用于研究基于细胞的相互作用的微流体平台的制作方法

本发明涉及用于在三维(3d)微环境中培养细胞的微流体技术，且更具体地(但不仅仅)涉及微流体塑料装置。

背景技术：

微流体技术能够使用户在更具生理性的三维(3d)微环境中培养细胞，并提供高分辨率实时成像、多流通细胞类型、以及对于流量和梯度的控制的能力。国际专利申请号pct/us2009/039434描述三维微流体平台及其使用方法。用于制造这些现有技术装置的材料是聚二甲基硅氧烷(pdms)，其为一种光学清晰且气体可渗透的可模制硅树脂。pdms常用于通过软光刻工艺进行快速成型以生产微流体装置。然而，pdms对于基于细胞的应用而言不是理想的材料，其原因在labchip(2012,12,1224–1237)中由beebe等人详细论述。简要而言，一些缺点包括：

·pdms材料是易受疏水性化合物的体吸收的可渗透材料——研究疏水性药物/蛋白质的生物测定将受到影响，这是因为，其有效浓度将会由于体吸收而降低。

·pdms易于蒸发——pdms水蒸气渗透性在微流体装置中是缺点，其中所用的培养基的量较小。蒸发可导致渗透压偏移并影响细胞行为。

·pdms将恢复其疏水性——pdms通常为疏水性的，并以等离子体处理以增大表面亲水性。亲水性表面有利于特定的微流体处理，如表面功能化和微通道填充。然而，等离子体处理的pdms表面由于聚合物链从主体向表面扩散而恢复其疏水性。用户于是不得不在使用前重复等离子体处理；除了不便之外，许多用户可能无法访问等离子体室。

·pdms不适于大批量制造——pdms由于其冗长的固化和处理时间而使其制作周期时间长得难以接受。

本发明的开发的出发点在于：提供一种塑料材料制成的三维微流体平台，其不易受现有技术的pdms制装置的问题的影响。本发明的微流体平台也可以包含改进其功能性的多个其他有利特征。

在此专利文件中引用的现有技术文献仅用于例示目的，而并非承认这样的现有技术是新加坡或其他地区的公知常识的一部分。

技术实现要素：

根据本发明的一个方面，提供一种微流体平台，用于研究基于细胞的相互作用，该平台包括：

片基，其由具有适当光学性质的合适的塑料材料制成，该片基具有与用于容纳培养基的微流体通道流体连通的多个端口，培养基中保持有细胞。

优选地，片基通过工程塑料材料制成，该工程塑料材料能够被注射成型而且是光学清晰的。典型地，塑料材料选自包括以下材料的组：聚碳酸酯(pc)、聚苯乙烯(ps)、聚乙烯(pe)、环烯烃共聚物(coc)、环烯烃聚合物(cop)。

优选地，平台进一步包括：气体可渗透层片，其结合到片基的底表面。

优选地，气体可渗透层片由具有低体密度的聚合物制成。典型地，低体密度的聚合物选自包括以下材料的组：聚甲基戊烯(pmp)和聚(1-三甲硅基-1-丙炔)(ptmsp)，或者选自聚甲基化的聚合物(如聚甲基化的聚二苯乙炔)，或者选自通过其他方式实现充分气体渗透性的聚合物。典型地，层片通过热层压、溶剂结合、粘结(利用湿性或干性粘结剂)、或者通过其他方式而结合到片基，取决于相应地用于片基和层片的具体材料。优选地，气体可渗透层片是光学清晰的。

典型地，片基具有以线性阵列布置的细长构造的多个微流体通道，每个微流体通道大致平行于相邻的通道。优选地，每个微流体通道具有一对端口，在每端分别设置一个端口。优选地，端口均开通到片基的上表面上。优选地，微流体通道成对布置，且在成对的微流体通道之间设置有第三微流体通道，该第三通道被布置以允许在成对的微流体通道与第三微流体通道之间的受控的流体连通。典型地，第三微流体通道填充有水凝胶或其他细胞外基质。优选地，所有微流体通道形成在片基的底表面中，气体可渗透层片结合到片基的底表面以封闭通道。

有利地，片基形成有多个储部，这些储部模制在片基的上表面中而且不与端口流体连通，其中，在使用时，每个储部适于保持无菌水、水凝胶、或其他物质，以在装置周围产生潮湿环境。

典型地，片基具有整体上细长、矩形的构造，各端口沿片基的相应的纵向边缘布置。

根据本发明的另一方面，提供一种制造微流体平台的方法，该微流体平台用于研究基于细胞的相互作用，该方法包括以下步骤：

通过具有适当光学性质的合适的塑料材料而模制片基，该片基具有与用于容纳培养基的微流体通道流体连通的多个端口，该培养基中保持有细胞。

优选地，模制片基的步骤涉及：使用光学清晰的工程塑料材料进行注射成型。典型地，塑料材料选自包括以下材料的组：聚碳酸酯(pc)、聚苯乙烯(ps)、聚乙烯(pe)、环烯烃共聚物(coc)、环烯烃聚合物(cop)。

典型地，该方法进一步包括以下步骤：将气体可渗透层片结合到片基的底表面。

优选地，气体可渗透层片是光学清晰的，由具有低体密度的聚合物制成。典型地，低体密度的聚合物选自包括以下材料的组：聚甲基戊烯(pmp)和聚(1-三甲硅基-1-丙炔)(ptmsp)，聚甲基化的聚合物(如聚甲基化的聚二苯乙炔)，或者通过其他方式实现充分气体渗透性的聚合物。

典型地，将所述层片结合到片基的步骤涉及：通过热层压而将层片层压到片基。可替代地，将所述层片结合到片基的步骤涉及：溶剂结合、粘结结合(利用湿性或干性粘结剂)、或者其他结合方式，取决于相应地用于片基和层片的具体材料。

根据本发明的进一步的方面，提供一种微流体平台，用于研究基于细胞的相互作用，该平台包括：

片基，其具有与用于容纳流体培养基的微流体通道流体连通的多个端口，在流体培养基中保持有细胞，每个端口具有用于将端口与微流体通道连接的内部入口和邻近于该入口的用于容纳小储量的培养基的槽，其中，在使用时，培养基能够经由槽而不是直接经由内部入口从微流体通道吸出。

在一个实施例中，入口设置在端口的居中处，槽具有围绕入口的环形构造。

典型地，槽的底部具有半圆形截面。

优选地，微流体平台的端口被设计为模块式附接接口。

有利地，端口适于接纳通用模块式鲁尔连接器以将标准鲁尔配件(如管连接器和注射泵)附接到微流体平台。

有利地，多个微流体芯片能够被接纳和保持在单个微板保持器中。优选地，该保持器包括：设置在其上表面中而且不与芯片流体连通的多个内储部，其中，在使用时，每个储部适于保持无菌水、水凝胶、或其他物质，以在芯片周围产生潮湿环境。

在本专利文件的全文中，除非在上下文中另有所需，否则用词“包括”或其变体(例如包含或具有)将被理解为暗示所述整数或整数组，但不排斥任何其他的整数或整数组。类似地，用词“优选地”或其变体(如优选的)将被理解为暗示所述整数或整数组是所希望的，但对于实施本发明并非必需。

附图说明

通过以下对参照附图的仅利用示例给出的多个具体实施例的详细描述，本发明的特性将被更好地理解，在附图中：

图1a是根据本发明的微流体平台的第一实施例的等距视图；

图1b是图1a所示微流体平台的平面图；

图2是图1所示微流体平台的截面图，其中显示出片基和气体可渗透层片的优选布置；

图3是现有技术的微流体平台的截面图，其中显示出传统端口的构造；

图4是根据本发明的微流体平台的截面图，其中显示出改进的端口的优选构造；

图5例示出优选的模块式鲁尔连接器，其可用于根据本发明的微流体平台；

图6例示出模块式鲁尔连接器连接到根据本发明的微流体平台中的端口；

图7是微板保持器的一个实施例的平面图，微板保持器用于保持最多三个根据本发明的微流体平台；

图8是图1所示微流体平台的顶侧和下侧的等距视图，其例示出设置于其中的内储部的位置；

图9例示出设置在图7所示微板保持器中的内储部的位置；

图10是图1所示微流体平台中的微流体通道的优选实施例的放大底部；以及

图11是通过图10中的线a-a的微流体通道的放大截面图。

具体实施方式

根据本发明的用于研究基于细胞的相互作用的微流体平台10的优选实施例如图1和图2中所示，包括：片基(chipbase)12，其由具有适当光学性质的合适的塑料材料制成。片基12具有与用于容纳培养基17的微流体通道16流体连通的多个端口14，在培养基17中保持有细胞。

典型地，片基12具有以线性阵列布置的细长构造的多个微流体通道16，每个微流体通道16大致平行于相邻的通道，如可在图10和图11中最清楚所见。每个微流体通道16具有分别设置在每端的第一和第二端口14，如可在图4中最清楚所见。优选地，端口14均开通到片基12的上表面上。典型地，片基12具有整体上细长、矩形的构造，各端口14沿片基的相应的纵向边缘布置。片基12的典型尺度是：75mm长、25mm宽、6mm深。微流体通道16典型地为250微米深。

优选地，微流体通道16成对(16a、16b)布置，在成对的微流体通道之间设置有第三微流体通道16c，如图10和图11中所示。第三通道16c被布置为允许在成对的微流体通道16a、16b与第三微流体通道16c之间的受控的流体连通。典型地，第三微流体通道16c填充有水凝胶18或其他细胞外基质。

优选地，片基12通过工程塑料材料制成，工程塑料材料能够被注射成型并且是光学清晰(opticallyclear)的。典型地，塑料材料选自包括(但不限于)以下材料的组：聚碳酸酯(pc)、聚苯乙烯(ps)、聚乙烯(pe)、环烯烃共聚物(coc)、环烯烃聚合物(cop)。

塑料(如聚碳酸酯、聚苯乙烯等)过去已用于大批量制造细胞培养装置。传统的细胞培养装置是具有大的空气头空间(airheadspace)和介质容量的瓶或井，因而气体交互易于实现。不过，微流体装置包括处于密封通道中的小容积，则气体交换变为限制性因素，这是因为大多数塑料不能使气体透过。这种限制可通过将塑料片基14与气体可渗透层片20组合而克服。

优选地，气体可渗透层片20是光学清晰的，由具有低体密度的聚合物制成。典型地，低体密度的聚合物选自包括以下材料的组：聚甲基戊烯(pmp)和聚(1-三甲硅基-1-丙炔)(ptmsp)，或者选自聚甲基化的聚合物(如聚甲基化的聚二苯乙炔)，或者选自通过其他方式实现充分气体渗透性的聚合物。优选地，所有微流体通道16形成在片基12的底表面中，而气体可渗透层片20结合到片基12的底表面以封闭如图2和图11中所示的通道16。典型地，层片20通过热层压、溶剂结合、粘结(利用湿性或干性粘结剂粘结)、或者通过其他方式而结合到片基12，取决于相应地用于片基12和层片20的具体材料。

还可以完全通过气体可渗透的聚合物制造片基12。这样可具有的优点是：提供更简单的层片处理，这是因为，层片20和片基12于是将具有相同的材料性质。不过，在氧可用性上可能没有显著增益，这是因为，氧不得不扩散通过厚的片基(数厘米的量级)，而不是薄的层片(几十至几百微米的量级)。专门的气体可渗透的塑料也可能具有使其不适合于注射成型的材料性质。出于这些原因，在优选实施例中，片基12由标准的能够被注射成型的塑料制造，并且装置层压有薄的气体可渗透的层片。

本发明的微流体平台或芯片(chip)10能够复制培养系统中的细胞的体内行为。所述微流体平台或芯片10的应用可包括(但不限于)：

·用于学术和工业研发的研究工具

·用于制药公司的药品探索工具

·用于调整对个体患者的临床治疗的辅助性工具

易用性对于学术研发客户群而言是关键特点。除了pdms芯片制造不方便以外，用户面对的其他使用困难包括：

每天更换培养基——微流体装置在每个通道(典型地几十微升)内具有小的培养基容量。这意味着：培养基的营养成分将被培养细胞迅速耗尽，培养基必须每天更换。由于用户不得不为多个小装置更换培养基，因而处理需要简单、快速、防错。培养基通常通过附接到真空抽吸部的移液管尖端从微流体通道吸出。常发生的错误是：施加过大真空力所致的过度吸出，这样导致细胞与培养基一起被抽吸出通道，从而导致细胞损失/死亡。

适应性：研究者按照不同设定而评估试验适应性，例如通过将其他装置和设备连接到培养系统以修改培养条件。当前用户不得不塑造其自身的连接器，这可能是不方便的和不可靠的。

处理：用户希望优化利用其培育器中有限空间的微流体芯片。芯片还需要输送到组织培养罩和输送到各种显微平台，而不会溢洒或污染。装置自动化处理(例如通过机械平台实现)受限于特定形式因素，如微滴定板。

蒸发控制——微流体装置具有小培养基容量，因而蒸发损失将导致培养基渗透压的显著改变，引起不利的培养条件。用户不得不在培育器内设定湿度室以抵御蒸发。

多个创新点已包含在微流体平台或芯片10的优选实施例中，以克服上述的使用困难。这些另外的创新点现在将详细描述。

a.快速更换培养基而不过度吸出

现有技术的微流体端口的设计是圆柱形的，直接导入通道中(见图3)。在培养基更换过程中的真空抽吸可导致细胞被抽吸到通道外。改进的端口设计涉及：形成内槽，其深于内部入口(见图4)。每个端口14具有：将端口14与微流体通道16连接的内部入口22；邻近于入口22的用于容纳小储量的培养基流体的槽24，其中，在使用时，培养基能够经由槽24而不是直接经由内部入口22从微流体通道16吸出。

在所示实施例中，入口22设置在端口14的居中处，槽24具有按照同心圆围绕入口的环形构造(如图4的截面中所示)。可替代地，槽24可以具有不同构造，不过仍邻近于入口22安置。典型地，槽的底部具有半圆形截面。

通过安置在槽24中的玻璃/移液管尖端26施加真空(如图4中所示)导致培养基流体移除，当槽中的培养基完全移除时停止。由于内部入口22的更高高度，因而通道中的培养基和细胞将不受真空吸出的影响，无论移液管尖端在槽24中保持多久。新鲜培养基可然后在通道16的一侧上添加到端口(上游端口)，并被允许流动通过通道，从而替换旧的培养基。由于微流体系统中表面张力影响，因而可能需要将少量新鲜培养基添加到下游端口，使得下游入口处的表面张力可被克服以允许入流。

b.通过模块式鲁尔连接器和接口的适应性

芯片通道端口14优选地被设计为模块式附接接口。aim通用鲁尔锁定连接器30(如图5中所示)能够使用户将标准鲁尔配件(例如用于附接管连接器和注射泵)附接到微流体芯片10。由aim开发的进一步的附件可直接连接到端口14或者经由通用连接器连接。图5显示出多个模块式连接器30连接到微流体平台10的相应端口14。图5显示出用于鲁尔滑动和鲁尔锁定连接结构的连接器(左)、和附接到鲁尔滑动和鲁尔锁定注射器的连接器(右)。

其他制造者的现有技术的方法基于直接构建到芯片上的分立部件。连接器部件从芯片突出并默认被包括在芯片中。这种本发明的模块式的设计具有两个重要优点：

(i)微流体芯片10可通过单一材料高效地制成为单一部件——不是所有的用户都希望连接到其他装置。这些用户将会具有使用基本芯片10本身的选项。其他的需要连接到其他装置的用户具有使用模块式鲁尔连接器的不同的选项。这种设计方式在经济上对于制造者和使用者而言都更合理，这是因为，核心的平台(即，芯片)将更易于制造，而用户群将获得更低的价格基础，但又具有更多选择。

(ii)端口具有双重作用——端口用作储部，能够实现用户进行快速的培养基更换，而不需要连接器。需要连接到注射泵等的其他用户将使用端口作为连接接口。应注意，后一用户群将通过使用所连接的装置(例如泵)而更换培养基，因而不需要培养基快速更换功能。这种方式优化了芯片上的有限空间。还能够使进一步的附件通过匹配于端口槽和入口的接口而直接附接到芯片本身上，而不需要其他制造者现今使用的额外部件。

c.通过兼容sbs/ansi的微板保持器改进处理

有利地，多个微流体芯片10可被接纳和保持在单个的微板保持器40中，如图7和图9中所示。微板保持器40的所示实施例包括：盘42，其具有侧壁和大致平面形的基底；和被设置为与盘连接的多个隔间46。盘42中的每个隔间46适于在其中接纳微流体芯片10。在所示实施例中，盘42被设计为其中接纳最多三个流体芯片10。优选地，保持器40进一步包括：盖44，其被接纳在盘的上方以将微流体芯片10封闭其中。有利地，盖44大致透明。有利地，多个保持器40也是可堆叠的。

标准形状因子(如显微镜载玻片和微量滴定板)在生物和药物研究工业中普遍存在。芯片和保持器均被设计为符合这些现有标准而使得装置适用于现有工作流中。保持器还将适用于标准显微平台上，并可堆叠以使细胞培养培育器中的工作空间最大化。保持器被设计为定位芯片通道端口14以符合微滴定板的sbs/ansi标准，从而使其将与自动化板填充/处理系统兼容。使用这样的系统填充微板中的井，并需要填充位置准确定位。这种设计方式的进一步的优点是：适合在学术实验室中人工操作的装置也可用于工业自动化设施中。

d.通过芯片和保持器设计的湿度控制

微流体系统的用户常不得不将其装置安置在湿度室中以限制蒸发。有利地，芯片10和保持器40均具有内置的储部(见图8和图9)，储部可填充有无菌水、水凝胶(例如琼脂糖、聚丙烯酰胺等)、或其他物质，以在装置周围(或者保持器内)产生潮湿环境。这种方式不需要设定单独的湿度室。其还当将装置传送到成像平台上时有利于容易处理和保持湿度条件，这是因为加湿功能内置在芯片和保持器本身中。

如图8中最清楚可见，片基12形成有被模制在其上表面中的多个储部50。储部50不与端口14流体连通。在使用时，每个储部可用于保持无菌水、水凝胶、或其他物质，以在装置周围产生潮湿环境。

类似地，保持器40进一步包括：设置在盘42内的多个内储部60，如图9中最清楚可见。储部60分立于芯片10且不与芯片10流体连通。因此，在使用时，每个储部60可用于保持无菌水、水凝胶、或其他物质，以在芯片10周围产生潮湿环境。

既然已经详细描述了微流体平台的优选实施例，因而显见的是，提供针对现有技术的多个优点，包括以下优点：

(i)其克服了与使用pdms用于芯片衬底相关联的问题；

(ii)改进的芯片通道端口涉及消除了与过度吸出相关联的问题；

(iii)芯片可本身使用，或者使用模块式鲁尔连接器与其他装置相结合使用；

(iv)芯片和保持器均符合微滴定板的sbs/ansi标准，因而其与自动化板填充/处理系统兼容；

(v)内置的储部允许芯片和保持器提供自有湿度控制。

对于本相关领域技术人员易于显见的是，除了已经描述的实施例以外，在不背离本发明基本发明思路的情况下，可对前述实施例进行各种修改和改进。例如，所述实施例中的流体平台或芯片均设置有三组微流体通道。不过，芯片可定制设计以包含任意所希望数量的通道和采取各种构造。因此，应认识到，本发明的范围不限于所描述的具体实施例。