专利名称：通过拉曼散射增强核苷酸信号的方法
技术领域：
本发明的方法和装置涉及分子和生物学和基因组学领域。更具体说，这些方法和装置涉及核酸测序。
背景遗传信息以极长的脱氧核糖核酸(DNA)分子贮存，组成在染色体中。人类基因组含有大约30亿个碱基的DNA序列。此DNA序列信息决定了各个体的多种特征。许多常见病的基础至少部分在于DNA序列中的变异所致。
测定人类基因组的全序列为鉴定这类疾病的遗传原因提供了基础。然而，鉴定与各疾病相关的遗传变异仍有大量工作要做。这需要测定显示各疾病个体或家族的染色体部分中的DNA序列，以鉴定DNA序列中促进此病的特异性变化。也可测定核糖核酸(RNA)，一种遗传信息加工中的中间分子，的序列来鉴定各种疾病的遗传基础。
目前基于检测已按大小分离的荧光标记核酸的核酸测序方法，受到可测序核酸长度的限制。通常一次只能测定500-1,000个碱基的核酸序列。这比称为基因，可长达数万或甚至数十万个碱基的功能性DNA单位的长度短得多。采用目前的方法测定完整基因序列要求产生该基因的许多拷贝，将其切成重叠的片段并测序，然后可将重叠的DNA序列装配成完整的基因。此过程费力、费钱、效率低和费时。
附图的简要说明以下附图构成本说明书的一部分并包括在其中，以进一步说明本发明公开实施方式的某些方面。参见这些附图的一个或多个，结合本文提供的对本发明实施方式的详细描述，可更好地了解本发明的实施方式。
图1说明采用共价结合于拉曼标记的核苷酸16，测定核酸13序列的示范性装置10(未设比例尺)和方法。
图2说明测定核酸13序列的示范性装置100(未设比例尺)和方法，其中释放的核苷酸130共价结合于纳米微粒140，然后用表面增强拉曼光谱(SERS)180检测。
图3说明核酸13测序的其它示范性装置210(未设比例尺)。
说明性实施方式的描述本文公开的方法和装置用于快速自动化测定核酸13的序列。本发明的具体实施例中，这些方法和装置10、100、210适合于获得非常长的，1,000以上、2,000以上、5,000以上、10,000以上、20,000以上、50,000以上、100,000以上甚至更长的核酸分子的序列。超过现有方法的优点包括能在上次测序过程中读取长核酸13的序列；获得序列数据的速度更快；测序费用降低和每单位序列数据所需操作时间内效率更高。
本发明的各种实施例中，可在一次测序过程中，用一个核酸分子13获得序列列信息。在本发明其它实施例中，可平行或依次测定多个拷贝核酸分子13的序列，以验证该核酸序列或获得完整的序列数据。在本发明另外的实施例中，可测定核酸分子13及其互补链的序列发言权验证序列信息的准确性。
本发明某些实施例中，侍测序的核酸13是DNA，虽然考虑也可测定含RNA或合成性核苷酸同类物的其它核酸。以下详述包括许多细节以提供对本发明公开实施方式的更全面了解。然而本领域技术人员懂得无须这些具体细节即可实施本发明的实施方式。此外，本文对本领域熟知的装置、方法、程序和各种组分不作详述。
图1所示本发明的各种实施例中，核苷酸可共价结合于拉曼标记，以提高表面增强拉曼光谱(SERS)、表面增强共振拉曼光谱(SERRS)、相干反斯托克斯拉曼光谱(CARS)或其它已知的拉曼检测技术可检测到的拉曙信号。在本发明的一些实施例中，可将这类标记的核苷酸，用标准的核酸聚合技术加入到新合成的核酸链13中。通常使特定序列的旨物或一种或多种随机引物与模板核酸杂交。加入聚合酶和标记的核苷酸后，拉曼标记的核苷酸结合于引物的3’端，导致形成序列上与该模板互补的标记的核酸链13。
合成后，标记的核酸链13可用一种或多种外切核酸酶15消化。该领域技术人员知道上述方法不限于外切核酸酶15本身，而且可采用能从核酸13的至少一端依次去除核苷酸16、130的任何酶或其它试剂。在本发明的一些实施例中，从标记的核酸13的3’端17位依次释放拉曼标记核苷酸16、130。与标记核酸13分离后，用检测单元18、180、300检测拉曼标记核苷酸16、130。依次检测标记核苷酸16、130的信息可用于编辑标记核酸13的序列，其与模板链的序列互补。
在本发明的一些实施例中，在外切核酸酶15外理前，可将标记的核酸链13与未标记的模板链及未掺入的核苷酸相分离。这可通过用已与表面14交联的或含生物素或类似基团能与表面14结合的引物来实现。生物素标记的引物能结合于已用亲和素或链霉亲和素修饰的表面14。标记的核酸13可用已知技术与未标记的模板链相分离。
在本发明某些实施例中，四种核苷酸可各自结合一可鉴别的拉曼标记。在本发明的其它实施例中，可只标记嘌呤核苷酸(胞嘧啶和/或胸腺嘧啶和/或尿嘧啶。在一示范性实施例中，该标记核苷酸可含有生物素标记的脱氧胞嘧啶-5’-三磷酸(生物素-dCTP)和地高辛标记的脱氧尿嘧啶-5’-三磷酸(地高辛-dUTP)。
在图2所示本发明的其它实施例中，可通过将核苷酸16、130共价结合于纳米微粒140而增强拉蛊惑信号。在本发明的一些实施例中，这种结合可在如图1所示外切核酸酶15处理核酸13之后。在本发明的一些实施例中，纳米微粒140是银或金，但可考虑已知能提供表面增强拉曼信号的其它纳米微粒140。纳米微粒可以是单个纳米微粒140，纳米微粒140的凝聚物，或单个和凝聚的纳米微粒140的某些混合物。在本发明的某些实施例中，可采用接头化合物将核苷酸16、130结合于纳米微粒140。在本发明的各种实施例中，此接头化合物可以长1-1000纳米(nm)之间，2-90nm、3-80nm、4-70nm、5-60nm、10-50nm、15-40nm或20-30nm。在本发明的某些实施例中，此接头化合物可长1-50nm、1-5nm、2-10nm、10-20nm或约5nm。在本发明其它实施例中，二个或多个纳米微粒可用接头化合物结合在一起。
共价结合后，可使纳米微粒-核苷酸复合物150通过流通小室170、290，在其中受到检测单元18、180、300的SERS、SERRS和/或CARS检测。在本发明的一些另外实施例中，可不修饰核苷酸16、130；而在在本发明其它的另外实施例中，可用一种或多种拉曼标记修饰核苷酸16、130。在本发明某些实施例中，可将各种核苷酸结合于可鉴别的拉曼标记。其它实施例中，只标记嘧啶16、130。
定义如本文所用，“一个”或“一种”可表示一个或一个以上项目。
如本文所用，“操作性连接于”指二个或多个单位之间的功能性相互作用。例如，如果检测仪21、310安置的位置当分析物如核苷酸16、130经过流通小室170、290时能检测它们，则称检测仪21、310与流通小室170、290“操作性相连接”。
“核酸”13包括DNA、RNA、单链、双链或三链及它们的任何化学修饰物。实际上考虑了核酸13的任何修饰。如本文所用，单链核酸13可用前缀“ss”表示，双链核酸13可用前缀“ds”表示，三链核酸13可用前缀“ts”表示。
“核酸”13可以是几乎任何长度，可长10、20、30、40、50、60、75、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、15,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000、100,000、150,000、200,000、500,000、1,000,000、1,500,000、2,000,000、5,000,000个或更多个碱基，直至全长染色体DNA分子13。
“核苷酸”16、130是含有嘌呤或嘧啶碱基(腺嘌呤--“A”，胞嘧啶--“C”，鸟嘌呤--“G”，胸腺嘧啶--“T”或尿嘧啶--“U”)或它们的任何化学修饰物或结构同类物，与五糖如脱氧核糖、核糖或五糖的衍生物或同类物共价结合的分子。
“核苷酸”16、130指还包含一共价结合五糖的磷酸基团的核苷酸16、130。在本发明的一些实施例中，核苷酸16、130是核糖核苷单磷酸16、130或脱氧核糖核苷单磷酸16、130，虽然预计可能产生核苷二磷酸或三磷酸并检测。在本发明其它实施例中，楞从核酸分子13释放核苷酸16、130。考虑可在核苷酸16、130结构中制造各种取代或修饰，只要能利用聚合酶作用将它们掺入核酸13中并用外切核酸酶15或等价试剂使用使其释放。
“拉曼标记”是能产生可检测拉曼信号的有机或无机分子、原子、复合物或结构，包括但不限于合成的分子、染料、天然产生的色素如藻红蛋白、有机纳米结构如C60、巴克球(buckyball)和碳纳米管、金属纳米结构如金或银纳米微粒、或纳米棱镜和缪米半导体如量子小球。下面将描述拉曼标记的许多实例。该领域技术人员知道这些实例无限制性，“拉曼标记”包括该领域已知的可用拉曼光谱检测的有机或无机原子、分子、化合物或结构。
核酸侍测序的核酸分子13可用该领域已知技术制备。在本发明某些实施例中，核酸13是天然产生的DNA或RNA分子。实际上任何天然产生的核酸13均可用已发表的方法制备和测序，不限于染色体、线粒体和叶绿体DNA和核糖体、转运性异质性核内和信使RNA(mRNA)。制备和分离不同形式的核酸13的方法是已知的(见例如，Guide toMolecular Cloning Techniques，Berger和Kimmel编，Academic Press，New York，NY，1987；Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Sambrook，Fritsch和Maniatis编，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。所引用参考文献中公开的方法只是示范性的，可采用该领域已知的改进。当侍测序单链DNA(ssDNA)时，可用已知方法从双链DNA(dsDNA)制备ssDNA13。这些方法包括加热dsDNA使此链分离，或也可用已知的扩增或复制方法，例如克隆入M13中，从dsDNA制备ssDNA。
虽然本发明的某些实施例涉及制备天然产生的核酸13，实际上可测定可作为外切核酸酶或等价试剂15底物的任何类型的核酸13。例如，可测定用各种扩增技术如聚合酶链反应(PCRTM)扩增制备的核酸13的序列。(见美国专利4,683,195；4,683,202和4,800,159)。或可将侍测序的核酸13克隆入标准载体如质粒、粘粒、BAC(细菌的人造染色体)或YAC(酵母菌人造染色体)中。(见例如，Berger和Kimmel，1987；Sambrook等，1989)。可用例如适当的限制性内切酶切割，然后作琼脂糖凝胶电泳，从载体DNA中分离得到核酸插入物13。插入物核酸13的分离方法是众所周知的。
分离单个核酸分子在本发明某些实施例中，可采用一米射流或纳米射流技术选拣和分离核酸分子13。可利用流体动力学将核酸13移动进入微通道、毛细管或微孔中。在本发明的一实施例中，利用流体动力使核酸13通过梳状结构而分成单个核酸分子13。一旦核酸分子13被分离，可利用流体动力将分子13定位于反应室11、220中。也可利用热能、电能、压力或真空力提供操纵核酸13的动力。在本发明的示范性实施例中，为测序操纵核酸13可包括利用通道构块设计，掺入显微制作的通道和整合的凝胶材料(见美国专利5,867,266和6,214,246)。
在本发明的其它实施例中，可稀释含核酸分子13的样品，然后将其偶联于固定表面14。在本发明的示范性实施例中，该固定表面可以是磁性或非磁性珠或其它不不连续的结构单元。适当稀释后，每个珠14具有结合零个或一个核酸分子13的统计学概率。可用例如，荧光染料和流式细胞计数仪选拣或磁性选取拣，鉴定具有一个结合的核酸分子13的珠14。取决于珠14和核酸13的相对大小和均匀性，可采用磁性滤器和质量分离来分离含一个结合的核酸分子13的珠14。在本发明的其它实施例中，可测定结合一个珠或其它固定表面14的多个核酸13的序列。
在本发明的另外实施例中，可利用包被的纤维尖头14产生一分子核酸13用于测序(如美国专利6,225,068)。在另外其它实施例中，可制备固定的表右14使含有一分子亲和素或其它交联试剂。这样表面14可结合一个侍测序的生物素化核酸分子13。此实施例不限于亲和素-生物素系统，可适合于任何已知的偶联系统。
在本发明另外其它实施例中，可利用光陷井(滤波器)操纵侍测序的一分子核酸分子13(如美国专利5,776,674)。典型的光陷井系统可从Cell Robotics，Inc.(Albuquerque，NM)，S+L GmbH(海德堡，德国)和P.A.L.M.Gmbh(Wolfratshausen，德国)获得商品。
拉曼(Raman)标记本发明某些实施方式可涉及使一标记结合于核苷酸16、130以有利于通过检测单元18、180、300对它们的检测。能用于拉曼光谱的标记的非限制性例子包括TRIT(四甲基罗丹明异硫氰酸盐)、NBD(7-硝基苯-2氧杂-1，3-二重氮)、德克萨斯红染料、苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二酸、甲苯基快紫、甲苯基兰紫、亮甲苯兰、对氨基苯甲酸、视红质、生物素、地高辛、5-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧荧光素、5-羧基-2’，4’，5’，7’-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基史丹明、6-羧基四甲基氨基酞菁、偶氮甲碱、花菁、黄嘌呤(Zanthine)、琥珀酰荧光素和氨基吖啶。这些和其它拉曼标记可获自商品来源(如Molecular Probes，Eugene，OR)。
如该领域所知，聚环芳香化合物可起着拉曼标记功能。可用于本发明具体实施例的其它标记包括氰化物、硫醇、氯、溴、甲基、磷和硫。本发明的某些实施例中，碳纳米管可用作拉曼标记。诸标记在拉曼光度法中的用途是已知的(如美国专利5,306,403和6,174,677)。该领域技术人员知道所用的拉曼标记应产生可监别的拉曼光谱，并可特异性结合或连接不同类型的核苷酸16、130。
可将标记直接结合于核苷酸16、130或可通过各种接头化合物结合。用于所述方法的交联试剂和接头化合物下面将进一步描述。或者，共价结合于拉曼标记的的核苷酸可得自标准的高品化来源(如Soche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN；Promega Corp.，Madison，WI；Ambion，Inc.，Austin，TX；Amersham PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)。含设计的能与其它分子如核苷酸16、130共价反应的反应基团的拉曼标记可从商业上获得(如Molecular Probes，Eugene，0R)。制备标记核苷酸并将它们加入核酸13中的方法是已知的(如美国专利4,962,037；5,405.747；6,136,543；6,210,896)。
纳米微粒本发明某些实施方式涉及利用纳米微粒140来增强获自核苷酸16、130的拉曼信号。在本发明某些实施例中，此纳米微粒140是银或金纳米微粒140，虽然可采用能提供表面增强拉曼光谱(SERS)的任何纳米微粒。本发明另一些些实施例中，该纳米微粒140可以是纳米棱晶(Jin等，Science 294；1902-3，2001)。在本发明各种实施例中，可用的纳米微粒140的直径在1纳米至2微米之间。在本发明其它实施例中，考虑纳米微粒140的直径在2nm-1μm、5nm-500nm、10-200nm、20nm-100nm、30-80nm、40-70nm或50-60nm。在本发明某些实施例中，考虑纳米微粒140的平均直径为10-50nm、50-100nm或约100nm。纳米微粒140开态可以是大略的球形，捧状，棱角形，多面体形或尖头形，虽然可采用任何形状或不规则形状的纳米微粒140。制备纳米微粒的方法是已知的(如美国专利6,054,495；6,127,120；6,149,868；Lee和Meisel，J.Phys.chem.86；3391-3395，1982；Jin等，2001)。纳米微粒也可获自商业来源(如Nanoprobes Inc.，Yaphank，NY；Polysciences，Inc.，Warrington，PA)。
本发明某些实施例中，纳米微粒140可以是单个的纳米微粒140和/或纳米微粒140的随机凝聚物(胶质纳米微粒140)。在本发明其它实施例中，可将纳米微粒140交联产生纳米微粒140的颗粒状凝聚物，如二聚体、三聚体、四聚体或其它凝聚体。本发明某些其它实施例可采用不同大小凝聚物的不均一混合物，而其它另外实施例可采用纳米微粒140的均质群。本发明某些实施例中，可用已知方法如蔗糖溶液超离心，富集或纯化含有所选数量纳米微粒140(二聚体，三聚体等)的凝聚物。在本发明各种实施方式中，纳米微粒140凝聚物的大小考虑约为100、200、300、400、500、600、700、800、900至1000nm或更大。
交联纳米微粒140的方法是已知的(如Feldheim，“Assembly of metalnanoparticle arrays using molecular bridges，”The Electrochemical SocietyInterface，Fall，2001，22-25页)。金纳米微粒140你如可用带有末端巯基或硫氢基的双功能接头化合物交联。与金纳米微粒140反应时，接头形成的纳米微粒140二聚体被该接头的长度分开。在本发明其它实施方式中，可采用具有三个、四个可多个巯基的接头同时结合多个纳米微粒140(Feldheim，2001)。采用比接头化合物过量的纳米微粒140可防止形成多种交联和纳米微粒140沉淀。可用该领域已知的标准合成方法形成银本发明某些实施方式可涉及140的凝聚物。
在本发明另一些实施例中，可修饰纳米微粒140使其含各种反应基团，然后使它们结合接头化合物。修饰的纳米微粒140可从商业上获得，如Nanoprobes，Inc.(Yaphank，NY)的Nanogold纳米微粒140。可获得的Nanogold纳米微粒140每全颗粒结合有一个或多个马来酰亚胺基、氨基或其它基团。也可获得阳电荷或阴电荷形式的Nanogold纳米微粒140。这种修饰的纳米微粒140可结合于多种已知的接头化合物而提供纳米微粒140的二聚体、三聚体或其它凝聚物。
所用的接头化合物类型无限制，只要其可导致产生不会在溶液中沉淀的纳米微粒140的小凝聚物。本发明某些实施例中，接头基团可包括苯乙炔聚合物(Feldheim，2001)。另外，接头基团可含聚四氟乙烯、聚乙烯酯、吡咯烷酮、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙酰胺、聚乙烯或其它已知聚合物。所用接头化合物不限于聚合物，也可包括其它类型分子，如硅烷、烷类、衍生的硅烷或衍生的烷类。
本发明各种实施例中，纳米微粒140可共价结合于核苷酸16、130。本发明另外实施例中，核苷酸16、130可直接结合于纳米微粒140，或可结合共价或非共价连接于纳米微粒140的接头化合物。在本发明此类实施例中，接头化合物不是用于将二个或多个纳米微粒140交联在一起，而是用于将核酸16、130结合于纳米微粒140或纳米微粒140凝聚物。在本发明具体实施例中，用衍生的硅烷包被纳米微粒140。这种修饰的硅烷可用标准方法共价结合于核苷酸16、130。也可采用下述各种将核酸13交联于表面14的已知方法，使核苷酸16、130结合于纳米微粒140。考虑用于结合核苷酸16、130的接头化合物可以是任何长度，范围从约0.05、0.1、0.2、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、27、30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、90至100nm或甚至更长。本发明某些实施方式可采用不均一长度的接头。
在本发明其它实施例中，可将核苷酸16、130吸附在纳米微粒140的表面，或可密切靠近纳米微粒140(约0.2-1.0nm之间)。该领域技术人员知道为了产生SERS、SERRS或CARS的增强的拉曼信号，不需要将核苷酸16、130共价结合于纳米微粒140。
在图2所示本发明示范性实施方式中，核苷酸130结合实际于纳米微粒140，随着它们运行到微射流通道160时形成核苷酸一纳米微粒复合物150。在本发明某些实施例中，发生交联反应所需时间长度可能是非常有限的。这类实施方式可采用具有快速反应率的高度反应交联基团，如环氧基、叠氮基、芳基偶氮基、三嗪基或重氮基。在本发明某些实施方式中，交联基团可以通过暴露于强光，如激光，而被光激活。例如，光激活重氮或叠氮化合物导致分别形成高反应性卡宾(carbene)和氮宾(nitrene)基团。本发明某些实施例中，可选择反应基团，使它们可只将纳米微粒140结合于核苷酸16、130，而不会使纳米微粒140相互交联。选择和制备能结合核苷酸16、130的反应性交联基团是该领域所知的。本发明另外的实施例中，可共价修饰核苷酸14、130本身，例如利用可结合金纳米微粒140的硫氢基。
本发明某些实施例中，可用该领域已知的方法，如微射流学、纳米射流学、流体动力学聚焦或电渗透法使纳米微粒140进入微射流通道120、160、270、280。在本发明某些实施例中，采用带电的接头化合物或带电的纳米微粒140通过采用电场梯度可能有利于操纵纳米微粒140。
核酸的固定如图1所示的本发明某些实施例中，可将一种或多种核酸分子13结合于表面14，如功能人的玻璃、硅、硅酸盐、PDMS(聚二甲基硅烷)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、银或其它金属包被的表面、石英、塑料、PIFE(聚四氟乙烯)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、聚氯乙烯、聚甲基异丁烯酸盐、聚二甲基硅烷、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、乳胶、尼龙、硝酸纤维、玻璃珠、磁珠、含有光反应基团如氮宾、亚碳化和羰游基(ketyl)能与核酸分子13形成共价连接的光聚合物(见美国专利5,405,766和5,986,076)或该领域已知的可能具有能加入此表面14的功能基团如氨基、羧基、巯基、羟基或Diels-Aider反应剂的任何其它物质。
在本发明某些实施例中，表面功能基团可共价结合交联化合物，这样核酸分子13和外切核酸酶15和/或聚合酶之间的结合相互反应可发生而无空间障碍。典型的交联基团包括乙二醇寡聚物和二胺。结合可以是共价或非共价结合。使核酸分子13与表面14结合的各种方法是该领域已知的，可以采用。本发明某些实施例中，核酸分子13被固定和浸没的位置在微液体流下游的流径13和/或微射流通道110、160、260、280中，它们将释放的核苷酸16转运通过检测单元18、180、300。在非限制性实例中，此微液体流可产生自众多溶剂流向下游流径12和/或微射流通道110、160、260、280。
在本发明其它实施例中，大量培养液只缓慢流动或不流动，但溶液中的带电物质(如带负电的核苷酸16、130)对外加电场的反应是流向下游的流径12和/或微射流通道110、160、260、280。
可采用各种方法实现核酸分子13的固定。在本发明一示范性实施例中，可用链霉亲和素或亲和素包被表面14，然后结合生物素化核酸13而实现固定(Holmstrom等，Anal.Biochem.209278-83，1993)。实现固定也可用聚L-赖氨酸或聚L-Lys，苯基丙氨酸包被硅、玻璃或其它表面，然后用双功能交联试剂共价结合氨基或巯基修饰的核酸13(Running等，Biotechniques 8276-277，1990；Newton等，Nucleic AcidsRes.211155-62，1993)。胺残基可通过利用氨基硅烷包被在表面14上。
可将5’-磷酸化的核酸13直接共价结合于化学修饰的表面14(Rasmussen等，Anal.Biochem.198138-142，1991)。与水溶性碳二亚胺凝缩可形成核酸13与表面14之间的共价结合。此法有利于核酸13通过其5’-磷酸的优势5’-结合。
DNA13常通过先硅化玻璃表面14，然后用碳二亚胺或戊二醛活化而结合于玻璃。另外的方法可采用试剂如3-环氧丙氧基三甲氧基硅烷(GOP)或氨基丙基三甲氧基硅烷(APTS)，通过加入在该分子3’或5’端的氨基接头与DNA13连接。DNA13可用紫外光照直接结合实际于膜表面14。其它核酸13固定技术的非限制性实例见美国专利5,610,287；5,776,674和6,225,068。
在本发明的各种实施例中可用双功能交联试剂将例如核酸分子13结合于表面14双功能交联试剂可按它们的功能基团如氨基、胍基、吲哚基或羧基的特异性分离。交联分子的示范性方法见美国专利5,603,872和5,401,511。交联试剂包括戊二醛(GAD)、双功能环氧乙烷(OXR)、乙二醇二环氧甘油醚(EGDE)和碳二亚胺如1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)。
核酸的的合成聚合酶本发明某些实施方式包括合成性试剂如DNA聚合酶与引物分子结合，将拉曼标记的核苷酸加入到该引物的3’端。聚合酶的非限制性例子包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶和RNA-依赖的RNA聚合酶。这些聚合酶在它们的“校对”活性和需要或不需要引物和启动子序列方面的差异是该领域知道的。当RNA聚合酶用作聚合酶时，待测序的模板分子可以是双链DNA。聚合酶的非限制性例子包括Thermatogamaritime DNA聚合酶、AmplitaqFSTMDNA聚合酶、TaquenaseTMDNA聚合酶、ThermoSequenaseTM、Taq DNA聚合酶、QbetaTM复制酶、T4DNA聚合酶、Thermusthermophilus DNA聚合酶、RNA-依赖的RNA聚合酶和SP6RNA聚合酶。
许多聚合酶可从商业上获得，包括Pwo DNA聚合酶(Boehringer MannheimBiochemicals，Indianapolis，IN)、Bst聚合酶(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)；IsoThermTMDNA聚合酶(Epicentre Technologies，Madison，WI)、莫洛尼小鼠白血病病毒逆转录酶、Pfu DNA聚合酶、禽髓母细胞症病毒逆转录酶、Thermus flavus(Tfl)DNA聚合酶和Thermococcus litoralis(Tli)DNA聚合酶(Promega Corp.，Madison，WI)、RAV2逆转录酶、HIV-1逆转录酶、T7RNA聚合酶、T3RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶、大肠杆菌RNA聚合酶、Thermus aquqticus DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、+/-3’→5’外切核酸酶、DNA聚合酶I的Klenow片段、Thermus‘ubiquitous’DNA聚合酶和DNA聚合酶I(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。可采用该领域已知的能使标记核苷酸模板依赖性聚合的任何聚合酶。(见例如，Goodman和Tippin，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.1(2)101-9，2000；美国专利6,090,589)。采用聚合酶从标记的核苷酸合成核酸13的方法是已知的(如美国专利4,962,037；5,405,747；6,136,543；6,210,896)。
引物通常引物长10-20个碱基之间，虽然可采用更长的引物。本发明某些实施例中，设计的引物在序列上与模板核酸分子的已知部分互补。可采用已知的引物序列，例如当所选的引物用于监定与已知的染色体恒定序列相毗连的序列的变异时；当将未知核酸序列插入已知序列的载体时；或当部分测序天然核酸时。合成任何序列的引物方法是已知的。本发明的其它实施例中包括测定缺乏已知引物结合位点的核酸13的序列。此时，可采用随机引物，例如随机六聚体或随机寡聚体来启动聚合。
核酸的消化图1所示本发明某些实施例中，核酸13测序的方法包括使用权外切核酸酶15或等价试剂结合于核酸分子13的游离端17，并一次去除核苷酸16、130。可采用的核酸消化酶15的非限制性例子包括大肠杆菌外切核酸酶I、III、V或VII，Bal 31外切核酸酶、绿豆核酸酶、S1核酸酶、大肠杆菌DNA聚合酶I的全酶或Klenow片段、RecJ、外切核酸酶T、T4或T7DNA聚合酶、Taq聚合酶、外切核酸酶T7基因6、蛇毒磷酸二酯酶、脾磷酸二酯酶、Thermococcus litoralis DNA聚合酶、火球菌属(Pyrococcus sp.)GB-D DNA聚合酶、λ外切核酸酶、S.aureus微球菌核酸酶、DNA酶I、核糖核酸酶A、T1微球菌核酸酶、或其它该领域已知的外切核酸酶。外切核酸酶15可从商业来源上获得，如New England Biolabs(Beverly，MA)、AmershamPharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega(Madison，WI)、Sigma Chemicals(St.Louis，MO)或Boehringer Mannheim(Indianapolis，IN)。
本领域技术人员知道，具有外切核酸酶15活性有酶能除去核酸分子13的5’端、3’端或任一端的核苷酸16、130。它们可能显示对RNA、DNA或RNA与DNA13二者的特异性。它们的活性取决于所用的单链或双链核酸13。它们可能受到盐浓度、温度、pH或二价阳离子的不同影响。外切核酸酶15的这些和其它性能是本领域知道的。本发明某些实施例中，可操纵外切核酸酶15活性的速率，与通过检测单元18、180、300分析核苷酸16、130的最佳速率相一致。已知有多种方法可调节外切核酸酶15活性的速率，包括调节反应室11、220中的温度、压力、pH、盐或二价阳离子的浓度。
虽然通常由外切核酸酶15从核酸13释放核苷单磷酸16、130，但本发明实施方式不限于检测任何特定形式的游离核苷酸或核苷16、130，而是包括检测可能从核酸13释放的单体16、130。
反应室和集成芯片如图1所示，本发明某些实施例是关於设施10、100、210，其包括一反应室11、220，设计包含在水环境中的固定表面14、核酸分子13、外切核酸酶15和核苷酸16、130。本发明某些实施例中，该反应室11、220的温度是可控制的，例如通过加入颗粒小丸成分或该领域已知的其它方法。控制低容量液体温度的方法是已知的。(见例如美国专利5,038,853；5,919,622；6,054,263和6,180,372。
本发明某些实施例中，如计算机芯片制造和/或微细管芯片制造领域所知，反应室11、220和相关的流体腔室，如流径12、微射流腔室110、160、260、280或腔室120、230、240、270、350、360都在一批制造过程中制造成与废物口、与核酸13装载口、与纳米微粒贮藏器370、与外切核酸酶15源或其它流体脸室相连。本发明某些实施例中，反应室11、220和装置10、100、210的其它组件，如流径12和/或微射流腔室120、160、260、280可制备成一张集成芯片。可用本领域已知方法，例如光刻平板印刷和蚀刻。然而，制备方法不限于此，可采用该领域已知其它方法，如激光烧蚀、注模、浇铸、分子射线晶体取向附生、蘸水笔纳米平板印刷、化学蒸发沉积(CVD)制造术、电子束或聚焦离子束技术或印刻技术。本发明某些实施例可采用制造纳米电子机械系统的方法(见例如Craigjead，Science2901532-36，2000)。显微制作芯片可从商业上获得，例如Caliper Technologies Inc.(Mountain View，CA)ACLARA BioSciences Inc.(Mountain View，CA)。
为有利于通过检测单元18、180、300检测核苷酸16、130，含流径12或流通小室170、290的材料可选用对用于检测单元18、180、300的激发和发射频率电磁射线可穿透的材料。玻璃、二氧化硅和通常对用于拉曼光谱的波长可穿透的任何其它材料都可用。本发明某些实施例中，正对着检测单元18、180、300的流径12或流通小室的表面，可用银、金、铂、铜、铝或对检测单元18、180、300相对不能透过的其它材料包被。在此部位采用不透过材料可增强拉曼信号，例如SERS，同时不干扰检测单元18、180、300的功能。或者，流径12或流通小室170、290可包含由银、金、铂、铜、铝或其它拉曼信号增强金属组成的网罩。
流径和微射流通道本发明某些实施例中，核酸13所释放的核苷酸16、130向下流入流径12和/或微射流通道110、160、260、280通过检测单元18、180、300。转运核苷酸16、130技术的非限制性例子包括微射流技术。流径12和/或微射流通道110、160、260、280可包含一微毛细管(如购自ACLARA BioSciences Inc.，Mountain View，CA)或一流体整合环路(如Caliper Technologies Inc.，Mountain View，CA)。
本发明某些实施例中，待测的核苷酸16、130随大量流入的溶剂向下流入流径12和/或微射流通道110、160、260、280。本发明其它实施例中，可用微毛细管电泳将核苷酸16、130转运流入流径12和/或微射流通道110、160、260、280。微毛细管电泳通常涉及可装有或不装有特殊分离介质的薄毛细管或通道。带适当电荷的分子，如带负电的核苷酸16、130在对施加的电场反应中泳动，负电的到装置10、100、210的反应室11、220侧，而正电的到检测单元18、180、300侧。虽然常采用电泳来根据分子大小分离同时加入毛细管中的混合物组分，但也可用电泳来转运依次从核酸13释放的类似大小的核苷酸16、130。因为嘌呤核苷酸(A、G)16、130比嘧啶核苷酸(C、T、U)16、130大而移动更慢，可将流径12和/或微射流通道110、160、260、280的长度，及通过检测单元18、180、300的相应运送时间保持最小，以防止因混淆核酸13释放核苷酸16、130的顺序而产生的迁移差异。或者，可选择充填微毛细管的介质，使嘌呤和嘧啶核苷酸向流径12和/或微射流通道110、160、260、280迁移的速率相似或相同。毛细管电泳的方法已公开，例如可参见Wooley和Mathies(Proc.Natl.Acxad.Sci.USA 9111348-352，1994)。
本发明某些实施例中，流径12和/或微射流通道110、160、260、280可含有粘度较高的水性溶液如甘油溶液。这种高粘度溶液的作用是降低流速和增加核苷酸16、130与纳米微粒140交联所需的反应时间。
显微制作微射流装置包括毛细管电泳装置的方法已公开，例如见Jacobsen等(Anal.Biochem，209278-83，1994)；Effenhauser等(Anal.Chem.662949-53，1994)；Harrison等(Science 261895-97，1993)和美国专利5,904,824。这些方法包括用标准光刻平板照相术制作的含硅网罩的微铸模技术，或聚焦离子束技术，或二氧化硅、硅或其它晶体基质或芯片上的微米级通道光刻平板蚀刻术。这些技术可不难采用于上述方法和设施中。本发明某些实施例中，可以制作反应室11、220所用的相同材料，用该领域已知技术制作毛细管。
检测单元本发明各种实施例中，设计检测单元18、180、300用拉曼光谱来检测和定量核苷酸16、130。用拉曼光谱检测核苷酸16、130的方法是该领域已知的(见例如美国专利5,306,403；6,002,471；6,174,677)。已公开了表面增强拉曼光谱(SERS)、表面增强共振拉曼光谱(SERRS)和相干反斯托克斯拉曼光谱(CARS)上的变化。对于毗邻粗糙的金属表面，如银、金、铂、铜或铝表面的分子，拉曼检测的灵敏度增强系素为106。
拉曼检测单元18、180、300的非限制性实例公开在美国专利6,002,471中。频率倍增的钕钇铝石榴石激光19,320产生531nm波长，或频率倍增的钛兰宝石激光19,320产生波长365nm的激发光束20、330。可采用脉冲式激光光束20、330或连续激光光束20、330。激发光束20、330通过共聚焦光片和显微镜目镜聚焦在光径12和/流通小室170、290上。显微镜目镜和共聚焦光片收集核苷酸16、130的拉曼发射光，耦合于单色器进行光谱解离。该共聚焦光片包括二色性滤片、屏蔽滤片、共聚焦针孔、透镜和减少背景信号的镜子。也可采用标准的全视野光片作为共聚焦光片。拉曼检测器21、310所检测的拉曼发射信号包括与计算机介面的崩塌光电二极管以计数信号和使其数字化。
拉曼检测单元18、180、300的另一实例见美国专利5,306,403所述，包括Spex1403型双光栅分光光度计21、310和砷化镓光电倍增管(RCA C31034型或BurleIndustries C3103402型)，以单光子计数模式操作。激发源19,320包括SpectraPhysics 166型514.5nm线性氩离子激光器19,320和氪离子激光器19,320的647.1nm线(Innova 70，Coherent)。
替代激发源19,320包括337nm的氮激光器19,320(Laser Science Inc.)和325nm氦-镉激光器19,320(Liconox)(美国专利法6,174,677)，光发射二极管19,320，钕YLF激光器19,320，和/或各种离子激光器19,320和/或染料激光器19,320。激发光束20、330可用带通滤波器(Corion)作光谱纯化，并可用6倍物镜(Newport，L6X型)聚焦在流径12和/或流通小室170、290上。此物镜可同时用于激发核苷酸16、130和收集拉曼信号，采用全息光束分解器(Kaiser Opital Systems，Inc.，HB647-26N18型)产生激发光束20、330和发射的拉曼信号正确角度几何形状。可用全息凹口滤光器(Kaiser Optical Systems，Inc.)来减少Rayleigh散发光。其它拉曼检测器21、310包括配备有红色增强强化电偶合装置(RE-ICCD)检测系统(PrincetonInstruments)的ISA HR-320摄谱仪。可采用其它类型检测21、310，例如傅里叶-转化摄谱仪(依据Michaelson干涉仪)、带电注射装置、光电二极管阵列、InGaAs检测仪、电子倍增CCD、强化CCD和/或光电晶体管阵列。
该领域已知的任何合适形式或构型的拉曼光谱测定法或相关技术均可用于检测核苷酸16、130，包括但不限于正态拉曼散射、共振拉曼散射、表面增强拉曼散射、表面增强共振拉曼散射、相干反斯托克斯拉曼光谱(CARS)、激发的拉曼散射、逆向拉曼光谱、激发的增益拉曼光谱、超拉曼散射、分子性可见激光检测仪(MOLE)或拉曼显微探测或拉曼显微镜或共聚焦拉曼显微分光计、三维或扫描拉曼、拉曼色饱和光谱、时间分辨共振拉曼、拉曼去偶合光谱或UV-拉曼显微镜。
信息加工、控制系统和数据分析本发明某些实施例中，核酸测序装置10、100、210可包括-信息加工系统。上述方法和装置10、100、210不限于所用的信息加工系统的类型。示范性信息加工系统可加入一含有交流信息的汇流线和加工信息的处理器。本发明一实施方式中，从奔腾(Pentium)处理器家族选择处理器，包括但不限于可从Intel公司获得的奔腾处理器II家族、奔腾处理器III家族和奔腾处理器4家族(Santa Clara，CA)。本发明其它实施例中，此处理器可以是Celeron、Itanium或奔腾Xeon处理器(IntelCorp.，Santa Vlara，CA)。本发明其它各种实施方式中，此处理器可基于Intel结构体系，如Intel IA-32或Intel IA-64结构。或者可采用其它处理器。信息加工和控制系统还可包括该领域已知的外围装置，如存贮器、显示器、键盘和/或其它装置。
在本发明的具体实施例中，检测单元18、180、300可操作性连接于于信息处理系统。处理器加工检测单元18、18、300的数据并将数据存放在贮存器中。标准核苷酸16、130发射光图数据也可存放在贮存器中。处理器可比较核苷酸16、130在流径12和/或流通小室170、290中的发射光谱以鉴定核酸分子13释放的核苷酸16、130的类型。贮存器也可保存核酸分子13释放的核苷酸16、130的序列。贮存器可分析检测单元18、180、300的数据，以确定核酸13的序列。该信息处理系统也能执行标准程序如当测定重叠的信号时减去本底信号和“基线召唤(Base-calling)”测定。
虽然可在程序处理器的控制下进行上述方法，但在本发明其它实施例中，这些方法可全部或部分通过任何可编程的或硬编码(hardcoded)的逻辑，例如字段可编程门控阵列(Field Programmable Gate Arrays，FPGAs)、TTC逻辑、或应用特异性集成环路(Application Specific Integrated Circuits，ASICs)，来执行。
数据收集操作后，通常将该数据报告给数据分析运算指令。为了促进该分析运算指令，通常如上所述，用数字计算机分析检测单元18、180、300获得的数据。通常，该计算机将经过适当编程接受和贮存检测单元18、180、300的数据，以及分析和报告收集的数据。
在本发明某些实施例中，可采用为顾客设计的软件包来分析检测单元18、180、300获得的数据。在本发明其它实施例中，可用信息处理系统和公众可得到的软件包进行数据分析。DNA序列分析可得到的软件的非限制性例子包括PRISMTMDNA测序分析软件(Applied Biosystems，Foster City，CA)、SequencherTM软件包(Gene Codes，ANNArbor，MI)和通过National Biotechnology Information Facility网址www.nbif.org/links/1.4.1.php.得到的各种软件包。
实施例实施例1用拉曼标记的核苷酸进行核酸测序图1所示本发明的某些实施例，涉及测定结合于反应室11、220中固定表面14和解构室中拆卸的各单链核酸分子的序列。在本发明这些实施例中，反应室11、220中含有一种或多各外切核酸酶，其可从核酸分子13的非结合端17依次每次去除一个核苷酸16、130。
核苷酸16、130释放后，它们进入流径12通过检测单元18、180、300。检测单元18、180、300包含激发光源19,320，如激光器，其发射激发光束20、330。激发光束与释放的核苷酸16、130相互反应，激发电子至较高能量状态。电子返回较低能量状态产生的拉曼发射光谱，可用拉曼光谱检测仪21、310，如分光计、单色仪或电荷偶合器件(CCD)如CCD摄影仪检测。
反应室和流径的制备在浓HF(氢氟酸)中短时预先蚀刻硼浮法玻璃晶片(Precision Glass & Optics，Santa Ana，CA)，并清洗，然后在等到离子增强化学蒸发沉积(PECVD)系统(PEII-A，Technics West，San Jose，CA)中沉积无定形二氧化硅保护层。晶片用六甲基二硅烷(HMDS)预处理，用光阻材料(Shipley 1818，Marlborough，MA)旋转包被，并软烘乾。可用通讯蔽光校直仪(Quintel Corp.San Jose，CA)使带有一个或多个蔽光图案的光阻材料暴露，用浓显微定位显影剂(Microposit developer concentrate，Ahipley)和水的混合物除去暴光的光阻材料。硬烘乾显影的晶片并在PECVD反应器中用CF4(四氟化碳)去除暴光的无定形二氧化硅。用浓HF化学蚀刻晶片产生反应室11、220和流径12。剥去残留的光阻材料并除去无定形二氧化硅。采用这些方法可制备直径约50-100μm的显微通道。较小直径的通道可用已知方法，例如包涂显微通道内侧面使用权直径变窄，或用纳米光刻术、聚焦电子束、聚焦离子束或聚焦激光技术制备。
用金刚钻小钻头(Crystalite，Westerville，OH)在蚀刻晶片中钻出进入孔。在程序控制的真空熔炉(Centurion VPM，J.M.Ney，Yucaipa，CA)中加热二个互补的蚀刻和钻孔板，使其相互粘合制备最后的芯片。制作编入反应室11、220和流径12芯片的其它示范方法见美国专利5,867,166和6,214,246。在本发明某些实施例中，反应室11、220和流径12之间插有分子量截留值2,500道尔顿的尼龙滤膜以阻止外切核酸酶15离开反应室11、220。
核酸制备和外切核酸酶处理按Sambrook等(1989)纯化染色体DNA。用Bam H1消化后，将基因组DNA片段插入pBluescript II粘粒载体(Stratagene，Inc.，La Jolla，CA)的多克隆位点中并在大肠杆菌中培养。接种含氨苄青霉素琼脂糖平板后，选择单元个菌落培养以测序。与辅助噬菌体共感染拯救基因组DNA插入物的单链DNA拷贝。在蛋白酶K十二烷基磺酸钠(SDS)溶液中消化后，酚抽提DNA，然后加入乙酸钠(pH6.5约0.3M)和0.8体识的2-丙醇沉淀DNA。以Tris-EDTA缓冲液重悬含DNA的沉淀物，保存于-20℃直至使用。琼脂糖凝胶电泳显示一条纯化的DNA条带。
M13正向引物与位于基因组DNA插入物旁的已知pBluescript序列互补，购自Midland Certified Reagent Company(Midland，TX)。共价修饰这些旨放使含有结合于该寡核苷酸5’端的生物素。此生物素基团通过一(CH2)6臂共价联接于引物的5’磷酸生物素标记的引物能与从pBluescript载体制备的ssDNA模板分子杂交。此引物模板-复合物然后可结合链霉亲和素包被的珠(Dorre等，Bioimaging 5139-152，1997)。适当稀释DNA时，一个引物-模板复合物可结合一个珠14。将含单个引物-模板复合物的珠14插入测序装置10、100、210的反应室11、220中。
将该引物-模板与修饰的T7DNA聚合酶(United States Biochemical Corp.，Cleveland，OH)一起培育。此反应混合物含有未标记的脱氧腺苷-5’-三磷酸(dATP)和脱氧鸟苷-5-三磷酸(dGTP)、地高辛标记的脱氧尿苷-5’-三磷酸(地高辛-dUTP)和罗丹明标记的脱氧胞苷-5’-三磷酸(罗丹明-dCTP)。合成地高辛和罗丹明标记的核酸13后，使模板链与标记的核酸13分离，洗去反应室11、220中的模板链、DNA聚合酶和未掺入的核苷酸。
在反应室11、220中加入外切核酸酶III 15以启动外切核酸酶15的活性。将反应混合物保持在pH8.0和37℃。当核苷酸16、130从核酸13的3’端正17位释放出来时，微射流流将它们转运到下游流径12，通过检测单元18、180、300。
标记核苷酸的检测检测单元18、180、300包括激光器19、320和拉曼检测仪21、310。钛兰宝石激光器19、320(Tsunami by Spectra-Physics)可产生近红外波长(750-950nm)的激发光束20、330，或镓铝砷化物二极管激光器19、320(Process Instruments的PI-ECL系列)可产生785nm或830nm的激发光束20、330。可采用脉冲激光束20、330或或连续光束20、330。用二色性镜子(Kaiser Optical的全息凹形滤片或ChromaakOmega Optical的干扰滤片)将激发光束20、330反射入带收集光束的共线几何结构中。反射光束通过显微镜物镜(Nikon LU系列)聚焦在靶核苷酸16、130位于的微孔、流径(显微通道)12或流通小室170、290上。同一显微镜物镜能收集靶核苷酸16、130产生的拉曼散射光，并使其通过二色性镜子到拉曼检测仪21、310。拉曼检测仪21、310包括聚焦透镜、光谱仪和阵列检测仪。聚焦透镜将拉曼苍白射光会聚通过光谱仪的入口狭缝。光谱仪(RoperScientific)包括能按波长分散光的光栅。被分散的光在阵列检测仪(RoperScientific的背投射深缺失(deep-depletion)CCD照象机)上成象。阵列检测仪连接于一控制仪环路。该环路又连接于计算机，用于数据转输和控制检测仪21、310的功能。
拉曼检测仪能检测和鉴定通过检测仪21、310的dATP、dGTP罗丹明-dCTP和地高辛-dUTP的单个核苷酸16、130。编辑和分析标记核苷酸检测时间过程中的数据，以获得核酸13的序列。
实施例2采用共价结合于纳米微粒进行核酸测序图2显示了本发明的另一实施方式。外切核酸酶活化后从核酸13释放出核苷酸16、130。本发明的某些实施例中，不标记核苷酸16、130。这些实施例不包括将标记的核苷酸用引物和聚合酶掺入互补链。而是可直接测定从器官、组织和/或细胞样品直接纯化的，或用已知克隆方法获得的核酸13的序列。本发明的某些实施例中，可将一个分子的单链RNA或DNA13结合于表面14，再用外切核酸酶15处理。释放的核苷酸16、130通过流径12。流径12可与微射流通道110、160、260、280紧邻或相同。
将反应11、220的核苷酸16、130与金和/或银纳米微粒140混合。按Lee和Meisel(J.Phys.Chem.863391-95，1982)所述制备银纳米微粒140。金纳米微粒购自Polysciences，Inc.(Warrington，PA)。从Polysciences，Inc.得到的金纳米微粒140大小为5，10，15，20，40和60nm。在此非限制性实施例中，采用60nm的金纳米微粒。
表面修饰的纳米微粒140在接触核苷酸16、130之前用硅烷包被，如3-环氧丙氧基三甲氧基硅烷(GOP)，一种活性接头化合物包被。GOP含有末端高反应性环氧基团。可修饰纳米微粒140使含羟基以共价结合于GOP。将硅化纳米微粒140与核苷酸16、130混合，形成与核苷酸16、130的共价连接。此核苷酸-纳米微粒复合物150通过流通小室170、290，接受拉曼检测单元18、180、300的SERS、SERRS和/或CARS的鉴定。因为核苷酸16、130密切靠近纳米微粒140，拉曼信号大大增强，能检测出通过流通小室170、290的单个核苷酸16、130。
实施例3核酸测序装置图3显示本发明另一示范性实施例。DNA测序装置10、100、210包括反应室11、220，其与流入通道230和流出通道240以流体相沟通。可通过采用一个或多个阀门250控制液体流动。微射流通道130、260也与反应室11、220流体沟通。外切核酸酶15活性从一个或多个核酸13释放的核苷酸16、130存在于反应室11、220，通过微射流通道110、260。核苷酸16、130与纳米微粒140混合后流经与微射流通道110、260流体沟通的纳米微粒通道120、270。在结合通道160、280中发生核苷酸16、130与纳米微粒140的共价结合。此种共价结合的核苷酸-纳米微粒复合物150流经流通小室170、290，在那儿核苷酸16、130接受拉曼检测单元18、180、300的鉴定。检测单元18、180、300中有激光器19、320和拉曼检测仪21、310。激光器发射激发光束20、330，激发流通小室170、290中的核苷酸16、130。受激发的核苷酸16、130发射拉曼信号，被拉曼检测仪21、310测定到。
本发明的某些实施例，可在再循环室340中回收纳米微粒140。纳米微粒可用化学方法，例如酸溶液处理，然后洗去结合的核苷酸16、130、接头化合物和任何其它附着或吸附的分子。纳米微粒140可经再循环通道360再循环至纳米微粒存贮器370中。本发明的某些实施例，纳米微粒140在再循环通道360和/或纳米微粒存贮存器370中，可包被一接头化合物，如GOP。废物经废物通道350从再循环室中流出。
本文公开和声明的所有方法和装置可根据此文公开内容无须过多实验而制备和实施。本领域技术人员知道可对本文所述的方法和装置进行变化，而不脱离所声明对象材料的概念、思路和范围。更具体说，显然某些化学和物理上相关的物质可替代本文所述的物质而能获得相同或相似的结果。本领域技术人员知道的所有这些相似的替代物和修饰均认为属于本发明声明对象材料的思路、范围和概念之内。
权利要求
1.一种方法，所述方法包括a)从至少一个核酸的一端依次取下核苷酸；b)使各核苷酸结合于至少一个纳米微粒；c)鉴定所述核苷酸；和d)确定所述核酸的序列。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸结合于一表面。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米微粒用一种或多种接头化合物修饰。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述核苷酸共价结合于所述接头化合物。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核苷酸采用表面增强拉曼光谱(SERS)、表面增强共振拉曼光谱(SERRS)和/或相干反斯托克斯拉曼光谱(CARS)鉴定。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米微粒含有金和/或银。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，各核苷酸结合于一个纳米微粒或纳米微粒聚合物。
8.如权利要求1所述的方法，还包括分离所述核苷酸与所述核酸分子。
9.如权利要求5所述的方法，还包括用激光激发所述核苷酸。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，采用电荷偶合器件(CCD)摄相仪来鉴定所述核苷酸。
11.如权利要求1所述的方法，还包括记录各核苷酸的同一性和各核苷酸被鉴定的时间。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用外切核酸酶从所述核酸取下所述核苷酸。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米微粒直径在2nm-2μm之间。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述纳米微粒直径约100nm。
15.一种方法，所述方法包括a)获得结合拉曼标记的核苷酸；b)合成含标记核苷酸的核酸；c)从该核酸的一端取下核苷酸；d)用拉曼光谱鉴定核苷酸；和e)确定该核酸的序列。
16.如权利要求15所述的方法，还包括使从该核酸取下的核苷酸通过一金属涂布的通道。
17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，各种核苷酸用可鉴别的拉曼标记物标记。
18.如权利要求15所述的方法，其特征在于，只有嘧啶核苷酸用拉曼标记物标记。
19.如权利要求15所述的方法，还包括i)获得至少一种模板核酸分子；ii)使该模板核酸分子与一引物杂交；和iii)加入DNA聚合酶来合成所述核酸。
20.如权利要求15所述的方法，其特征在于，通过外切核酸酶活性从所述核酸去除所述核苷酸。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，一次只使一个核酸接触外切核酸酶活性。
22.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述标记的核苷酸采用表面增强拉曼光谱(SERS)、表面增强共振拉曼光谱(SERRS)和/或CARS鉴定。
23.如权利要求22所述的方法，还包括使所述核苷酸结合于纳米微粒。
24.一种装置，其特征在于，该装置包括a)一个反应室；b)与所述反应室流体沟通的第一通道；c)与所述第一通道流体沟通的第二通道；d)与所述第一和第二通道流体沟通的流通小室；和e)操作性连接于所述流通小室的检测单元。
25.如权利要求24所述的装置，其特征在于，所述检测单元包括拉曼检测仪。
26.如权利要求25所述的装置，其特征在于，所述检测单元包括激光器和CCD摄像仪。
27.如权利要求24所述的装置，所述第一通道含有核苷酸，所述第二通道含有纳米微粒。
28.如权利要求27所述的装置，其特征在于，所述核苷酸共价结合于所述纳米微粒。
29.如权利要求28所述的装置，其特征在于，所述核苷酸在所述通道中变为共价结合于所述纳米微粒。
30.如权利要求28所述的装置，其特征在于，所述核苷酸共价结合于所述纳米微粒提供了增强的拉曼信号。
全文摘要
这里所述方法和设备涉及用拉曼光谱法进行核酸测序。在本发明的某些实施方案中，核苷酸在掺入核酸(13)之前共价结合拉曼标记上。外切核酸酶(15)处理标记的核酸(13)导致标记的核苷酸(16，130)的释放，释放的核苷酸通过拉曼光谱检测。在本发明的其它实施方案中，通过外切核酸酶(15)处理由核酸(13)释放的核苷酸(16，130)共价交联到银或金纳米微粒(140)，并通过表面增强拉曼光谱(SERS)、表面增强共振拉曼光谱(SERRS)和/或相干反斯托克斯拉曼光谱(CARS)检测。本发明的其它实施方案涉及用于核酸测序的装置(10、100、210)。
文档编号G01N21/29GK1791681SQ03810692
公开日2006年6月21日 申请日期2003年3月11日 优先权日2002年3月14日
发明者X·苏, A·伯林, T·－W·柯, S·钱, N·孙达拉拉间, 山川峰雄 申请人:英特尔公司