专利名称：一种dna光修复酶的活性检测方法
技术领域：
本发明属于蛋白质的活性检测技术领域，特别是涉及利用高效液相色谱方法检测DNA光修复酶活性。
背景技术：
美国《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.1984，259，6028-6032)指出，DNA光修复酶是一种分子量约55kD的蛋白质，其主要作用是修复生物体基因组DNA因紫外辐射作用形成的嘧啶二聚体。而在任何DNA光修复酶的纯化制备过程中，活性检测是必不可少的步骤。
在现有DNA光修复酶的活性检测方法中，电泳检测方法已是很成熟的一种，如美国《生物化学》(Biochemistry 1990，29，7715-7727)报道的电泳检测方法，其基本过程是先合成一段约50bp的双链DNA片段作为酶底物，该片段必须具备两个条件第一，在片段全长中仅有一个核酸内切酶作用位点，这个位点一般位于片段中间位置而且包含两个相邻的胸腺嘧啶碱基，第二，相临的胸腺嘧啶碱基形成嘧啶二聚体。该DNA底物经同位素标记、DNA光修复酶修复，核酸内切酶酶切，然后对产物进行电泳胶分析，根据射线计数检测酶切的片段和未酶切的片段的量以测定DNA光修复酶的活性。这种方法对酶底物要求严格，底物合成困难；同位素标记也增加了环境污染的可能。
发明内容
本发明的目的是提出一种利用高效液相色谱法检测DNA光修复酶的活性的方法，以克服现有技术对酶底物要求高、步骤繁杂、实验操作难、污染环境的缺陷。
本发明的DNA光修复酶活性检测方法，包括先制备含胸腺嘧啶二聚体的DNA底物，然后将含胸腺嘧啶二聚体的DNA底物与DNA光修复酶混合于反应缓冲液中用近紫外光照射，得到各不同照射时间的相应产物；其特征在于将DNA光修复酶与含胸腺嘧啶二聚体的DNA底物经近紫外照射不同时间的相应产物经分子-排阻高效液相色谱分析，在线检测底物单峰的260nm紫外吸收，根据底物所出的峰，计算峰面积的变化值，即胸腺嘧啶二聚体的解聚程度，根据胸腺嘧啶二聚体解聚程度和时间的比确定DNA光修复酶的活性。
本发明的DNA光修复酶活性检测方法的原理是以含胸腺嘧啶二聚体的DNA作为底物，无论其胸腺嘧啶二聚体是否被解聚，其分子量是不变的，所以进行分子-排阻高效液相色谱检测时，它们的分子-排阻效应是相同的，即在相同高效液相色谱条件下它们的出峰时间是相同的；胸腺嘧啶二聚体在260nm处没有吸收峰，而解聚成胸腺嘧啶单体在260nm处有吸收峰，可利用高效液相色谱的操作和分析软件计算底物吸收峰的峰面积，该峰面积的变化值反映了胸腺嘧啶二聚体的解聚程度，故可根据胸腺嘧啶二聚体解聚程度和时间的比来确定DNA光修复酶的活性。
与现有DNA光修复酶的活性检测方法相比较，本发明的优点在于1、本发明利用高效液相色谱法检测DNA光修复酶的活性，只需将DNA光修复酶与底物反应不同时间的产物用高效液相色谱一步分析即可，全程操作简单，步骤少，避免了电泳检测方法中要对底物进行各步操作并提纯的麻烦。
2、在本方法中，合成酶修复底物简单，所用的底物是单链的且只有10-20个碱基的DNA，而不像在现有方法中要求的约50bp的双链DNA。
3、高效液相色谱法是非常精确和稳定的，可方便地利用其操作和分析软件对变化前后的DNA底物进行定量，直接测定DNA光修复酶的活性，从而可避免同位素标记这种较为危险、繁杂、要求严格的操作。
图1为16聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸底物经紫外照射不同时间所得产物的紫外-可见扫描光谱。
图2为光照聚合前的16聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸底物标样的高效液相色谱图。
图3为70％聚合的16聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸底物标样的高效液相色谱图。
图4为70％聚合的16聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸底物随DNA光修复酶解聚1分钟的反应产物的高效液相色谱图。
图5为70％聚合的16聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸底物随DNA光修复酶解聚1小时的反应产物的高效液相色谱图。
具体实施例方式实施例1大肠杆菌DNA光修复酶的活性检测1.寡聚核苷酸底物的制备采用由上海生工生物工程有限公司合成的16聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸底物，用无菌双蒸水将底物配成浓度为100μM的储备液，储存于-20℃。
将储备液放置于玻璃核磁管中，用高纯氩气充气鼓泡，使其达到饱和氩气状态，封紧管口；在水浴中用300瓦高压汞灯以5厘米灯距对底物进行光照，分别光照0、30、60、180、300分钟；将光照不同时间的底物做紫外-可见扫描光谱分析。
图1给出了16聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸底物经紫外照射不同时间所得产物的紫外-可见光扫描光谱图，其横坐标是波长，纵坐标是光吸收值，图中扫描峰a、b、c、d、e分别表示16聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸底物紫外光照0、30、60、180、300分钟后产物的吸收峰。可以看出，按以上条件，16聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸底物随着高压汞灯紫外照射时间的延长，272nm吸光值不断下降，表明其经紫外照射，底物分子不断发生胸腺嘧啶聚合，生成没有紫外吸收的环丁烷胸腺嘧啶聚合体，随着照射时间的延长，底物发生胸腺嘧啶碱基聚合程度增加。实验过程中发现，紫外光照的结果并不是所有的胸腺嘧啶都形成二聚体，而是或多或少存在没有聚合的胸腺嘧啶单体，而单体是有吸收峰的，在光照5个小时后，其吸收峰基本稳定，即胸腺嘧啶碱基聚合基本达到饱和状态，高效液相色谱检测结果表明该状态下胸腺嘧啶的聚合程度是70％，下面的实验就是以这种状态的底物作为DNA光修复酶的底物，并称作70％聚合的16聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸底物。
2.70％聚合的16聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸底物与DNA光修复酶的反应反应体系由0.05M NaCl、0.02M Tris-HCl、0.01M二硫苏糖醇、5％甘油、0.001MEDTA组成的PH为7.4的反应缓冲液中，加入1-10μM的DNA光修复酶和1-5μM70％聚合的16聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸底物。所使用的DNA光修复酶是90％纯度的大肠杆菌DNA光修复酶。
将0.4毫升的反应体系，放置于2.5毫升核磁玻璃管中，高纯氩气充气达饱和氩气状态，封紧管口，在近紫外灯(365nm波长为主)以5厘米灯距，分别照射不同时间；随后沸水浴5分钟，15000g离心10分钟，上清用来做高效液相色谱分析。
3.高效液相色谱对反应产物的分析1)以沃特斯600泵、沃特斯2487双波长紫外检测器及Millennium32操作和分析软件构成高效液相色谱体系。层析柱采用沃特斯公司生产的型号为WAT084601，ProteinPAK125的凝胶柱，该柱的分子截留范围是2000-80000Da 7.8×300mm Column。分离条件洗脱液为0.02M醋酸铵(PH6.0)，流速为0.75ml/min；采用260nm单波长紫外检测。
2)聚合前后16聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸底物标样的高效液相色谱分析图2给出了16聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸底物的高效液相色谱图谱，其横坐标是时间，纵坐标是260nm光吸收值，样品于9.2分钟出峰，为峰f；
图3给出了70％聚合的16聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸底物的高效液相色谱图谱，其横坐标是时间，纵坐标是260nm光吸收值，于9.2分钟出峰，为峰g。
从上述高效液相色谱图可以看出①光照聚合前后的底物的出峰时间是一致的，表明二者的分子量是一致的；②光照聚合前底物的260nm吸收峰面积明显大于光照聚合后的底物，利用Millennium32分析软件可计算出光照前后底物的峰面积之间比例，从而能计算出单体变成二聚体的转化率，约为70％左右；③光照前后底物的出峰时间的一致性和峰高、峰面积的明显差异，可以作为检测DNA光修复酶作用活性的依据，即加入DNA光修复酶作用不同时间，样品用同样条件做高效液相色谱图分析，观察在9.2分钟位置的峰高和峰面积的变化趋势，该峰面积的变化值代表了胸腺嘧啶二聚体经DNA光修复酶解聚的程度，根据解聚程度和反应时间的比来确定DNA光修复酶的活性。
3)有了以上标样的实验基础，便可以对DNA光修复解聚不同时间的底物进行分析，并可以根据图谱变化趋势来直观判断和检测DNA光修复酶的活性。
解聚不同时间的DNA光修复酶反应产物的制备的具体操作同实施例1.2的“16聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸底物与DNA光修复酶的反应”。将反应不同时间的产物做以下处理沸水浴灭酶，离心去除沉淀，取上清做高效液相色谱检测。
图4给出了70％聚合的16聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸底物随DNA光修复酶解聚1分钟反应产物的高效液相色谱图，其横坐标是时间，纵坐标是260nm光吸收值，同样在9.2分钟出现峰，为峰h。
图5给出了70％聚合的16聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸底物随DNA光修复酶解聚1小时反应产物的高效液相色谱图，其横坐标是时间，纵坐标是260nm光吸收值，同样在9.2分钟出现峰，为峰i。
4)结果分析因为峰f是未聚合的底物，故可以认为是完全解聚状态。利用Millennium32分析软件分别对峰f、g、h、i进行面积积分，并以峰f认为100％解聚，可得到峰g、h、i分别为30％、47％、85％解聚，从而可以看出DNA光修复酶作用前后和不同作用时间对底物解聚程度的影响，尤其是在DNA光修复酶作用1小时后，底物可达到85％的解聚程度。
可以看出，在DNA光修复酶的作用下，光照聚合后的16聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸底物能被明显的解聚，即DNA光修复酶具有修复嘧啶二聚体活性。
权利要求
1.一种DNA光修复酶的活性检测方法，包括先制备含胸腺嘧啶二聚体的DNA底物，然后将含胸腺嘧啶二聚体的DNA底物与DNA光修复酶混合于反应缓冲液中用近紫外光照射，得到各不同照射时间的相应产物；其特征在于将DNA光修复酶与含胸腺嘧啶二聚体的DNA底物经近紫外照射不同时间的相应产物经分子-排阻高效液相色谱分析，在线检测底物单峰的260nm紫外吸收，根据底物所出的峰，计算峰面积的变化值，即胸腺嘧啶二聚体的解聚程度，根据胸腺嘧啶二聚体解聚程度和时间的比确定DNA光修复酶的活性。
全文摘要
本发明DNA光修复酶的活性检测方法，特征是将DNA光修复酶与含胸腺嘧啶二聚体的DNA底物经近紫外照射不同时间的相应产物经分子－排阻高效液相色谱分析，在线检测底物单峰的260nm紫外吸收，根据底物所出的峰，计算峰面积及其变化值，即胸腺嘧啶二聚体的解聚程度，根据胸腺嘧啶二聚体解聚程度和时间比确定DNA光修复酶的活性；该方法操作简单，可方便地利用操作和分析软件对变化前后的DNA底物进行定量，结果可信度高，克服了现有技术对酶底物要求高、步骤繁杂、实验操作难、环境污染的缺陷，适合于DNA光修复酶的实验室纯化和其产业化制备过程中的活性检测。
文档编号G01N30/00GK1624151SQ200310106548
公开日2005年6月8日 申请日期2003年12月5日 优先权日2003年12月5日
发明者王玉珍, 沐万孟, 俞书勤, 宋钦华, 章东方, 罗昭锋 申请人:中国科学技术大学