专利名称：农药检测用纳米修饰微型电化学生物传感器的制法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于农药残留检测的一次性纳米修饰微型电化学生物传感器的制备方法，它给出了一种能提供稳定参比电位、对蔬菜中残留农药进行检测的一次性纳米修饰微型电化学生物传感器的一种制备方法及用于农药残留检测的掌上型有机磷农药检测仪。
背景技术：
有机磷和氨基甲酸脂类农药是我国目前使用量最大的农药，其中大多农药是限量使用在蔬果作物上。有的剧毒农药是禁止在蔬菜瓜果上使用。但无论登记制度和管理条例如何严格，总有人违反规定，滥用农药。由于此类农药易大量残留在蔬果表面，能引起人的神经传导阻碍、神经麻痹及死亡。因此，在上市前进行农药残留的快速测定，避免因食含高残留农药的蔬果而引起急性中毒，保障人民的身体健康，具有十分重要的意义。
国际上农药残留分析是色谱法、色谱—质谱联用法等，但由于仪器复杂、昂贵，操作烦琐，常需液—液萃取或固—液萃取等前期处理过程，难于现场使用。蔬菜、瓜果等农产品为了保持新鲜，需要快运速销，传统仪器难于或无法在时间上予以保证。因而针对当前我国的国情需要开发在常温下的速测技术，即时确保上市蔬果的食用安全。
八十年代，蔬菜农药快速检测技术在国外一些国家已广泛使用。近年来，我国一些省、市的蔬菜的批发市场、蔬菜生产基地，质检部门也用速测法检测，使用的仪器有十几种型号，但其检测原理均采用光电比色法。这类仪器检测灵敏度低，有的农药残毒检测达不到国际或国内最低检测限标准。样品处理需超声震荡提取，恒温箱37℃培养30分钟。不利于现场检测和进一步推广普及。
近年来，随着生命科学和环境科学诸领域的迅速发展，以生物材料为基础的各种生物传感器的开发应用愈来愈受到关注。乙酰胆碱脂酶电化学电流传感器用于有机磷农药测定就是其中之一。农药残留毒性的检测原理模拟生物体的中毒过程，将敏感酶源中获取的乙酰胆碱酯酶作为目标物，设计反应来测定蔬菜中的农药残留对乙酰胆碱酯酶的抑制程度(毒性)。乙酰硫代胆碱可在适宜电位下，在玻碳电极上发生氧化反应，通过检测稳态下的电流值，可以间接反映酶活性，进而反映农药对酶活性的抑制，在0.1伏氧化电位下，检测氧化电流并按下式计算乙酰胆碱酯酶的抑制率。
酶抑制率A(与农药残留具有正相关性)＝[(I0-I)/I0]×100％式中I0指未被毒剂抑制的酶电极稳定响应电流(空白电流)I指被毒剂抑制酶电极稳态响应电流现有电极条为二电极体系，难以保证电位的恒定，难以进行一片之间的比较，其误差还较大，检测灵敏度低。
发明内容
为了克服现有的两电极系统难以保持恒定测定电位、难以进行一片之间的比较、以及误差较大，检测灵敏度低的不足，本发明提出一种用于农药残留检测的一次性纳米修饰微型电化学生物传感器的制备方法，该方法制备的三电极不仅体积小，易携带，并可提供稳定的参比电位，而且，由纳米复合型酶工作电极(1)、微型银/氯化银(Ag/AgCl)参比电极(2)和对电极(3)组成为一体，可提供一种简单、易用、不易损坏和易于批量生产的一次性纳米修饰微型电化学生物传感器。
本发明解决其技术问题所采用的方案是1.把中国传统的丝网印刷方法与电化学中的三电极体系以及生物体系中酶的专一性、灵敏性和纳米材料所具有的高度催化能力相结合。
2.采用电脑绘图代替传统丝网印刷中的手工制版。制备出三电极底板；3.在底板上修饰纳米材料与酶的复合物。
本发明的有益效果是，可以在采用电化学方法三电极系统进行有机磷类和氨基甲酸酯类农药的测量时，提供稳定的参比电位，并使经过预处理之后的电极在恒定的检测电位下电流恒定。而且，将传统的分散的三电极进行微型化，并成为一体，易于使用。
仪器采用乙酰胆碱脂酶生物传感器为电极的电化学电流检测法，直接显示底物电流和抑制电流，计算出抑制率。采用碳纳米管技术制作工作电极，提高电流灵敏度，减小电极内阻。采用丝网印刷技术制作的三电极纸质传感器，一次性使用，成本低。电流灵敏度高达1×10-9A/V，最低可测出1×10-11A电流。仪器稳定度高。时飘＜1％。相应仪器噪音也＜1％。仪器为电池供电，重量仅为250g，实行掌上型操作。小巧、美观、灵敏度高，易现场测试。样品处理程序简单，无需恒温培养。仪器采用贴片元器件，设计造价低，便于批量生产。
下面结合附图对本发明进一步说明。
图1生物传感器结构1中1.工作电极，2.对电极，3.参比电极，4.与仪器连接部分，5.导线，6.基板，7.纳米材料复合酶部分。
图2掌上型有机磷农药检测仪的原理框2中8.氧化电位，9.恒电位系统，10.参比电极，11.I/V变换，12.放大滤波，13.数字显示，14.定时控制，15.检测单元，16.超标报警，17.电化学池。
通过恒电位仪施加0.1V氧化电位，于含有乙酰胆碱酯酶的生物传感器(三电极体系)上，引起氧化反应，产生的氧化电流经I/V电压变换，放大后由液晶数字显示结果。
图3掌上型有机磷农药检测仪简3中18.电源开关，19.显示选择拨动开关分为SV，JV，HV，IV四档，其中SV是测试电压显示；JV是检测电位设置显示；HV是氧化电位检测；IV是电流/电压变换放大显示，20.液晶显示屏，21.起动按钮按钮开关，控制定时开始的开关，22.定时指示灯发红光。当按下定时按钮时，指示灯亮检测定时开始，4.5分钟后自由熄灭，表示定时时间到，开始检测。超标报警，报警器是在设定好残留农药毒性的抑制率后，当检测的实际样品抑制率低于此设定值时，报警表示其毒性超过设定标准，23.检测电位器设定酶抑制百分比电位旋钮，24.放大倍率对I/V变换的电压进行放大变换的开关。分为X0.5，X1，X2，X5四档，25.生物传感器插头及卡座供生物传感器与仪器连接。
图4呋喃丹抑制率A--浓度对数lgC关系图
具体实施例方式印刷过程根据所印制的电极的复杂程度可分几步进行，以我们印制的最简单的三电极为例，每一步印制过后，都要置于烘箱中加热干燥24小时以上，才进行下一步的操作。全部印制完成后，在烘箱中干燥48小时，电极裁好后即可使用1.第一步在基板(6)上先印制导电银浆，制成与仪器连接部分(4)和导线(5)；
2.第二步印制银-氯化银(Ag/AgCl)层制成参比电极(3)。
3.第三步印制导电碳浆制成工作电极(1)和对电极(2)4.第四步制备纳米材料酶电极(7)5.仪器开机后稳定10分钟后检测；6.将电极放于缓冲溶液中泡20分钟；7.用蒸馏水轻轻冲洗电极表面后，插入仪器接口端，滴两滴底液，均匀覆盖电极；8.按下检测开关开始检测，记下仪器面板上指示灯熄灭时的指示电流值；9.取下电极，用蒸馏水仔细冲洗电极后，泡于待测标准液中30分钟；10.调节仪器面板上的抑制率旋钮，设定检出电流值为前记下的指示电流值的8％；11.用蒸馏水轻轻冲洗电极表面后，插入仪器接口端，滴两滴底液，均匀覆盖电极；12.按下检测开关开始检测，仪器面板上指示灯熄灭时，如果农药超标，仪器发出报警声，如果仪器不报警，说明农药未超标。
权利要求
1.一种纳米修饰微型电化学生物传感器的制备方法及用于农药残留检测的掌上型有机磷农药检测仪，是由纳米复合型酶工作电极(1)、微型银/氯化银(Ag/AgCl)参比电极(2)和对电极(3)组成，其特征是纳米材料与酶复合，与薄膜状的工作电极结合，同薄膜状的微型银/氯化银(Ag/AgCl)参比电极(2)以及薄膜状的对电极(3)共同组成薄片式三电极型的纳米复合型生物传感器。
2.根据权利要求1所述的纳米修饰微型电化学生物传感器，其特征是碳纳米管与乙酰胆碱酯酶复合，与碳基底形成薄膜状纳米修饰工作电极(1)；
3.根据权利要求1所述的纳米修饰微型电化学生物传感器，其特征是薄膜状纳米修饰工作电极(1)和薄膜状的对电极(3)之间薄膜状的微型银/氯化银(Ag/AgCl)参比电极(2)，共同构成薄膜状三电极式纳米复合型生物传感器。
4.根据权利要求1所述的用于农药残留检测的掌上型有机磷农药检测仪，其特征是电流灵敏度高达1×10-9A/V，最低可测出1×10-11A电流。
5.根据权利要求1所述的用于农药残留检测的掌上型有机磷农药检测仪，其特征是稳定度高，时飘＜1％。相应仪器噪音＜1％。
6.根据权利要求1所述的用于农药残留检测的掌上型有机磷农药检测仪，其特征是电池供电，重量仅为250g。
全文摘要
一种用于农药残留检测的一次性纳米修饰微型电化学生物传感器的制备方法，它给出了一种能提供稳定参比电位、对蔬菜中残留农药进行检测的一次性纳米修饰微型电化学生物传感器的一种制备方法及用于农药残留检测的掌上型有机磷农药检测仪。
文档编号G01N27/403GK1699985SQ20041003806
公开日2005年11月23日 申请日期2004年5月18日 优先权日2004年5月18日
发明者张君, 黄鸿年, 袁倬斌 申请人:中国科学院研究生院应用化学研究所