专利名称：基于水溶性共轭聚合物的荧光传感器制备方法
技术领域：
本发明涉及生物、医学、药学、材料、化学、病毒学等学科的交叉学科领域。更具体涉及一种基于水溶性共轭聚合物的荧光传感器的制备方法。
背景技术：
环境毒素、重要致病微生物和病毒是危害人类生命安全和身体健康的大敌，生物恐怖主义阴影增加，新的病毒不断地出现，本已得到控制的疾病也可能会重新爆发，给人类的生存，社会稳定和经济发展带来严重威胁和挑战。在疾病早期诊断、环境监测与保护、病毒及细菌监测等方面，人们迫切需要具有实时、快速、灵敏及特异性的检测手段。人们逐步认识到，公共场合更易受到生化恐怖袭击，对检测技术的灵敏度和选择性提出了越来越高的要求，这些技术在医学诊断和生物医学研究中也会得到广泛的应用。基于水溶性荧光共轭聚合物的化学/生物传感器技术是近年来发展起来的一种快速、高灵敏的化学/生物传感技术。此类传感器已成为化学与生物学交叉学科研究领域的一个重要方向。水溶性荧光共轭聚合物在生物传感器中的应用将实现对生物样品(大分子或小分子)的实时、快速、均相、灵敏及选择性检测。
识别生物分子(大分子或小分子)的方法，例如酶联免疫分析法(ELISA)和免疫竞争法(小分子检测)，选择性好，但操作步骤多，费时费力，成本高。其它具有选择性的配体-受体检测方法如聚合酶链反应(PCR)法，通常需要将生物分子固定基质或薄膜上(如DNA芯片和蛋白质芯片)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于水溶性共轭聚合物的荧光传感器的制备方法。采用水溶性荧光共轭聚合物为敏感材料的传感器性质稳定，对生物样品检测灵敏度高，选择性好，通用性强。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施其步骤如下(1)以4-甲氧基苯酚、3-氯丙醇，四氢噻吩，金属钠，无水乙醇，乙醚，吡啶，甲基磺酰氯，浓盐酸，无水硫酸钠，氯仿，丙酮，碘化钠，氯化钠，浓硫酸，无水硫酸镁(MgSO4)，亚硫酸钠(Na2SO3)，氢氧化钠(NaOH)，N，N二甲基甲酰胺(DMF)，亚硫酰氯，甲醛，二氧杂环己烷，苯，无水甲醇为原料，通过回流、用阳离子交换树脂提纯、真空干燥、减压蒸馏、旋转蒸发或冷冻干燥结晶、重结晶等技术[黄涛主编，张治民副主编，有机化学实验(第二版)，北京，高等教育出版社，1998年]制备水溶性好的聚合物聚(5-甲氧基-2-(3-磺酰化)丙氧基-1，4-对苯撑乙烯)(MPS-PPV)或聚(5-甲氧基-2-(4-磺酰化锂丁氧基)-1，4-对苯撑乙烯)(MBL-PPV)，将其溶解于水或醇(甲醇、或乙醇、或丙醇、或丁醇、或四氢呋喃)中，得浓度为10-10mol/L～10-5mol/L反应液A(MPS-PPV或MBL-PPV)；共轭聚合物为水溶性或醇溶性；共轭聚合物为水溶性或醇溶性的阴离子或阳离子聚对苯撑乙烯衍生物或聚对苯撑乙炔烯衍生物。
(2)将生物大分子或生物素化的金属配合物作为探针溶于溶剂中，得浓度为10-10mol/L～10-5mol/L反应液B(病毒抗体溶液或Re-Biotin溶液或Ru-Biotin溶液或Ir-Biotin溶液)；所述的生物大分子为抗体或抗原。
所述的生物素化的金属配合物为生物素化铼(I)配合物、生物素化钌(II)配合物、生物素化铱(III)配合物，或生物素化的其它金属配合物；或是金属配合物与抗原/抗体、DNA/RNA、配体/受体的偶联物；所述的溶剂为水、或甲醇、或乙醇、或丙醇、或丁醇、或四氢呋喃(任意一种)；(3)取反应液A、反应液B及水或0.01mol·L-1磷酸盐缓冲溶液(pH为7.4)或0.1mol·L-1碳酸铵缓冲溶液(pH为8.9)，按物质的量比10∶10∶1～1∶1∶10混合，得混合溶液C；(4)取混合溶液C 500～1000μL于微量荧光比色皿中，以一定的激发波.长280～450nm激发，测量其在适当发射波长350～600nm处的荧光强度。
(5)加入被测样品如病毒抗原或亲和素/链亲和素于前述混合溶液C中，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处的荧光强度。
本传感器用于出血热病毒抗体/抗原或亲和素或链亲和素的检测，可在1-15分钟完成。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果与酶联免疫吸附分析及芯片技术相比，本法灵敏度高、简便快速、选择性好、通用性强。将它应用于抗原-抗体反应或DNA∶DNA(或DNA∶RNA)反应检测，将使现有的标准检测技术发生根本性变革。如果一种生物分子如抗体或抗原，既可以作为增强剂或猝灭剂，又可以通过与对应的抗原或抗体的特异性相互作用改变体系的荧光特性，便可以建立一种通用的免疫传感技术。
基于水溶性共轭聚合物的荧光传感器的制备将实现生物样品(大分子)如SARS病毒、禽流感病毒、炭疽病毒、艾滋病病毒、出血热病毒抗体/抗原和其它小分子的实时、快速、均相、灵敏及选择性检测。
响应快(1～200秒钟)，亲水性好，灵敏度高，选择性好，通用性强。
图1为溶液pH变化对MPS-PPV(1.0×10-5mol·L-1)-抗体L133(4.0×10-8mol·L-1)体系荧光强度的影响pH4.0～9.0Britton-Robinson缓冲溶液(正磷酸、乙酸、硼酸三酸混合溶液与NaOH溶液组成)图2为传感器对出血热病毒抗体-L133/抗原-EHF的响应特性及可逆性图2A荧光光谱曲线(a)1.0×10-5mol·L-1MPS-PPV，(b)a+1.6×10-7mol·L-1抗体-L133，(c)b+2.9×10-10mol·L-1抗原-EHF图2B荧光光谱曲线(a)1.0×10-5mol·L-1MPS-PPV，(b)a+2.9×10-9mol·L-1抗原-EHF，(c)b+1.6×10-7mol·L-1抗体-L133图3为敏感材料MPS-PPV的激发及发射光谱激发波长390nm，发射波长497nm图4为抗体-L133浓度变化对MPS-PPV水溶液荧光强度的影响1.0×10-5mol·L-1MPS-PPV水溶液中注入不同浓度的抗体-L133图5为出血热病毒免疫传感器示意图(MPS-PPV与抗体-L133及抗原-EHF之间作用)聚合物MPS-PPV受到抗体-L133微扰使荧光增强，加入抗原-EHF后，由于抗体-抗原间的特异性相互作用，使荧光减弱图6为聚合物MPS-PPV、MPS-PPV与抗体-L133或抗原-EHF及三者之间的原子力显微图(a)MPS-PPV，(b)MPS-PPV+L133，(c)MPS-PPV+EHF，(d)MPS-PPV+L133+EHF图象大小(a，b，c)3.0×3.0μm2，(d)1.5×1.5μm2图7为透射电子显微图(a)MPS-PPV，(b)MPS-PPV+L133+EHF图8为链亲和素(SA)传感器示意图(被Re-Biotin猝灭的MPS-PPV荧光加入链亲和素后荧光恢复)具体实施方式
实施例1一种基于水溶性共轭聚合物的荧光传感器的制备方法，其步骤为(1)将制备的MPS-PPV或MBL-PPV溶解于水或甲醇、或乙醇、或丙醇、或丁醇中，得浓度为10-10mol/L～10-5mol/L反应液A；(2)将生物素化的金属配合物如生物素化铼(I)配合物——六氟磷酸化-N-4-吡啶-甲基氨基化生物素-三羰基-2，9-二甲基-4，7-二苯基-1，10-邻二氮杂菲合铼(I)(Re-Biotin)作为探针溶于水或甲醇、或乙醇、或丙醇、或丁醇、或四氢呋喃中，得浓度为10-10mol/L～10-5mol/L反应液B；(3)取反应液A 10～100μL，反应液B 10～100μL及水或0.01mol·L-1磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)或0.1mol·L-1碳酸铵缓冲溶液(pH＝8.9)800～1000μL混和，得混合溶液C；(4)取混合溶液C 500～1000μL于微量荧光比色皿中，以一定的激发波长280～450nm激发，测量其在适当发射波长350～600nm处的荧光强度。
(5)加入被测样品亲和素或链亲和素于前述混合溶液C中，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处的荧光强度(见图8)。
实施例2一种基于水溶性共轭聚合物的荧光传感器的制备方法，其步骤为(1)将制备的MPS-PPV或MBL-PPV溶解于水或甲醇、或乙醇、或丙醇、或丁醇中，得浓度为10-10mol/L～10-5mol/L反应液A(见图3)；(2)将生物大分子如出血热病毒抗体作为探针溶于水或甲醇、或乙醇、或丙醇、或丁醇或四氢呋喃中，得浓度为10-10mol/L～10-5mol/L反应液B；(3)取反应液A 10～100μL，反应液B 10～100μL及水或0.01mol·L-1磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)或0.1mol·L-1碳酸铵缓冲溶液(pH＝8.9)800～1000μL混和，得混合溶液C；(4)取混合溶液C500～1000μL于微量荧光比色皿中，以一定的激发波长280～450nm激发，测量其在适当发射波长350～600nm处的荧光强度(见图2、图4)。
(5)加入被测样品如出血热病毒抗原于前述混合溶液C中，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处的荧光强度(见图2)。
权利要求
1.一种基于水溶性共轭聚合物的荧光传感器的制备方法，包括下列步骤A、以无水甲醇为原料，通过回流，用阳离子交换树脂提纯、真空干燥、减压蒸馏、旋转蒸发或冷冻干燥结晶、重结晶制备水溶性好的聚合物，将其溶解于水或甲醇、或乙醇、或丙醇、或丁醇、或四氢呋喃中，得浓度为10-10mol/L～10-5mol/L反应液A；B、将生物大分子或生物素化的金属配合物作为探针溶于溶剂水或醇或四氢呋喃中，得浓度为10-10mol/L～10-5mol/L反应液B；C、取反应液A、反应液B及水或0.01mol·L-1磷酸盐缓冲溶液pH为7.4或0.1mol·L-1碳酸铵缓冲溶液pH为8.9，按物质的量比10∶10∶1～1∶1∶10混合，得混合溶液C；D、取混合溶液C 500～1000μL于微量荧光比色皿中，波长280～450nm激发，测量其发射波长350～600nm处的荧光强度；E、加入被测样品或亲和素/链亲和素于前述混合溶液C中，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处的荧光强度。
2.根据权利要求1所述的一种基于水溶性共轭聚合物的荧光传感器的制备方法，其特征在于共轭聚合物为水溶性或醇溶性。
3.根据权利要求1所述的一种基于水溶性共轭聚合物的荧光传感器的制备方法，其特征在于共轭聚合物为水溶性或醇溶性的阴离子或阳离子聚对苯撑乙烯衍生物或聚对苯撑乙炔衍生物。
4.根据权利要求1所述的一种基于水溶性共轭聚合物的荧光传感器的制备方法，其特征在于溶剂为水、或甲醇、或乙醇、或丙醇、或丁醇、
5.根据权利要求1所述的一种基于水溶性共轭聚合物的荧光传感器的制备方法，其特征在于所述的生物素化的金属配合物为生物素化铼(I)配合物、生物素化钌(II)配合物、生物素化铱(III)配合物，或是金属配合物与抗原/抗体、DNA/RNA、配体/受体的偶联物。
全文摘要
本发明公开了一种基于水溶性共轭聚合物的荧光传感器制备方法，其步骤是首先制备水溶性阴离子荧光共轭聚合物聚(5－甲氧基－2－(3－磺酰化)丙氧基－1，4－对苯撑乙烯)，将其溶解于水中，得反应液A；其次是将生物大分子或生物素化金属配合物作为探针溶于水或醇或四氢呋喃中，得反应液B；第三是取反应液A、反应液B及水或缓冲溶液混合，得混合溶液C；第四是取混合溶液C于荧光比色皿中，测量其荧光强度；第五是加入被测样品如抗原/抗体或亲和素/链亲和素于混合溶液C中，测量其荧光强度。本方法简便快速、灵敏度高、特异性强、成本低、可实现高通量检测。
文档编号G01N21/64GK1712940SQ20051001920
公开日2005年12月28日 申请日期2005年8月2日 优先权日2005年8月2日
发明者何治柯, 陈彦国 申请人:武汉大学