专利名称：一种丹参和三七制剂的质量控制方法
技术领域：
本发明涉及天然药物的质量控制领域，具体为指纹图谱领域，具体涉及丹参和三七复方的HPLC-DAD指纹图谱鉴定方法。其可作为含有丹参和三七药材的复方制剂质量控制的指标之一。
背景技术：
含有丹参和三七的制剂，通常亦被称为复方丹参制剂，在临床上广泛用于治疗心血管疾病。常见的有复方丹参片，复方丹参滴丸，丹七片，冠心丹参片等。
丹参和三七是复方丹参制剂的两个主要组成药物，其中丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根，具祛瘀止痛，活血通经，清心除烦之功效，用于月经不调，经闭痛经，癥瘕积聚，胸腹刺痛，热痹疼痛，疮疡肿痛，心烦不眠，肝脾肿大，心绞痛；三七为五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根，具散瘀止血，消肿定痛之功效。用于咯血，吐血，衄血，外伤出血，跌扑肿痛等症。
现代研究表明丹参的活性成分主要为二萜醌类脂溶性及丹参酚酸类水溶性有效成分，丹参酚酸类成分具抑制血小板聚集，抗血栓形成，抗氧化及保护心脏微血管内皮细胞等作用；丹参酮等脂溶性成分能扩张冠状动脉，提高冠脉血流，保护心肌及广谱抑菌作用。三七皂苷类成分是三七的主要活性成分，具抗血栓形成，扩张血管及保护心肌等作用。
目前关于丹参和三七复方制剂指纹图谱鉴定方法的研究报导，大多为丹参或三七单味药材的鉴定，如丹参药材乙醇提取物高效液相色谱指纹图谱研究(中国药学杂志2004年8月第39卷第8期)、三七指纹图谱研究(Strait Pharmaceutical Journal Vol14 No52002)。现有技术未能用指纹图谱同时鉴定丹参和三七两味药中多类活性成分。
发明内容
本发明的目的在于建立一种能够同时鉴定丹参和三七复方中丹参与三七两味药中多类活性成分的指纹图谱。
本发明的另一目的在于将本发明的指纹图谱用于含有丹参和三七药材的复方制剂的质量控制。
本发明是这样实现的
我们模拟了丹七片的处方(以下称为丹七方)，通过对丹七方供试液制备方法，色谱条件选择及色谱条件方法学研究，确定了丹七方HPLC-DAD指纹图谱。该指纹图谱可满足对丹七方中丹参和三七的多类活性成分的同时检测与分析。我们又进一步将此指纹图谱用于含有丹参和三七药材的复方制剂质量控制。
本发明的具体方案如下使用高效液相色谱仪，DAD检测器，色谱工作站，将丹参和三七复方溶液，采用如下色谱条件色谱柱碳十八烷基键合硅胶填料色谱柱和预柱；柱温25-35℃；流动相A为0.1-0.5％的磷酸水；B为乙腈；A+B＝100％，采用梯度洗脱0-10min，7-17％B，10-12min，17-20％B，12-16min，20-21％B，16-32min，21％B，32-40min，21-29％B，40-55min，29-35％B，55-65min，35-70％B，65-75min，70-80％B，75-80min，80-97％B，80-82min，97-100％B，82-85min，100％B；或者在55分钟后梯度为55-65min，35-65％B，65-80min，65-80％B，80-85min，80-100％B；流速1ml/min，在22～28分钟时，流速为0.8ml/min；检测波长203，281nm。
优选的柱温是30℃。
优选的磷酸水的浓度为0.1％，为体积百分比。
供试品溶液的制备方法是取粉碎的丹参和三七，加入85-95％乙醇浸泡，水浴回流提取，放冷，滤过；药渣加水煎煮，放冷，滤过，合并滤液，浓缩至近干，加50-90％甲醇溶解，定容。
优选的制备方法是取粉碎的同样份数的丹参和三七，加入6-12倍重量份数的90％乙醇浸泡，水浴回流提取，放冷，滤过；药渣加水煮，加水量是药材重量的10-30倍，放冷，滤过，合并滤液，于50℃减压浓缩至近干，加70％甲醇溶解，定容。
上述液相色谱仪进样量优选10μl。
本发明的指纹图谱鉴定方法，记录时间在85分钟即可，用于鉴定丹七片，复方丹参滴丸时记录时间为55-65分钟即可。
下面是本发明的部分试验1.供试品溶液的制备取粉碎的丹参和三七适量，加入90％乙醇，浸泡，水浴回流提取2h，放冷，滤过；药渣加适量水继续煎煮2h，滤过，合并滤液，减压回收乙醇至干，加70％甲醇溶解并转移至容量瓶定容至刻度，微孔滤膜过滤，得供试品溶液(0.024g生药/ml)。进样10μl进行色谱分析。
2.HPLC色谱分析条件色谱柱碳十八烷基键合硅胶填料色谱柱(4.6×250mm ID，5μm)和预柱(4.6×12.5mm ID，5μm)；柱温30℃；流动相，A为0.1％的磷酸水；B为乙腈；A+B＝100％，采用梯度洗脱0-10min，7-17％B，10-12min，17-20％B，12-16min，20-21％B，16-32min，21％B，32-40min，21-29％B，40-55min，29-35％B，55-65min，35-70％B，65-75min，70-80％B，75-80min，80-97％B，80-82min，97-100％B，82-85min，100％B；或者在55分钟后梯度为55-65min，35-65％B，65-80min，65-80％B，80-85min，80-100％B。流速1ml/min(22-28min，0.8ml/min)；检测波长203，281nm。记录时间85min。
3色谱条件的选择及结果3.1洗脱系统的选择及结果本实验对3种流动相系统进行了选择(1)乙腈-水梯度洗脱；(2)乙腈-0.1％-0.5％磷酸梯度洗脱；(3)乙腈-0.1％甲酸梯度洗脱。
结果表明，乙腈-0.1％-0.5％磷酸梯度洗脱吸收峰数目多，峰形好，基线平稳，优于乙腈-0.1％甲酸，乙腈-水梯度洗脱系统。乙腈-0.1％-0.5％磷酸梯度洗脱效果相当，0.1％磷酸浓度较低，对色谱柱的损耗小，故更优的是乙腈-0.1％磷酸梯度洗脱。
3.2洗脱梯度、柱温、及流速的选择及结果对5个洗脱梯度，柱温(25-35℃)及流速进行考察。结果确定洗脱梯度0-10min，7-17％B，10-12min，17-20％B，12-16min，20-21％B，16-32min，21％B，32-40min，21-29％B，40-55min，29-35％B，55-65min，35-70％B，65-75min，70-80％B，75-80min，80-97％B，80-82min，97-100％B，82-85min，100％B(流动相A为0.1％的磷酸水；B为乙腈；A+B＝100％)。或者在55分钟后梯度为55-65min，35-65％B，65-80min，65-80％B，80-85min，80-100％B。优选的柱温30℃3.3检测波长的确定丹七方提取液中三七的主要成分为三七皂苷类；丹参的主要成分为丹参酚酸类水溶性及丹参醌类脂溶性成分。根据这些成分的紫外吸收特征，设置203，254，270，281和286nm五个波长对色谱条件进行考察，结果表明三七皂苷类成分只在203nm低波长处出峰；丹参化学成分在各波长均有不同吸收，281nm比254，270和286nm能更好的兼顾丹参水溶性及脂溶性成分。综合考虑，选择203nm和281nm两个波长。
3.4丹七方供试品溶液制备的方法及结果本试验对丹七方的工艺进行了优化，旨在使丹七方供试液能全面反映其有效成分，同时减少糖类、鞣质等杂质的干扰。
供试液1取粉碎的丹参0.6g，三七0.6g，加入30ml水浸泡1h，煎煮2h，放冷，滤过，滤液于50℃减压浓缩至近干，加70％甲醇溶解并转移至50ml容量瓶定容。
供试液2取粉碎的丹参0.6g，三七0.6g，加入30ml水浸泡1h，煎煮2h，放冷，滤过，滤液于50℃减压浓缩至2ml，加3倍量95％乙醇醇沉，冰箱静置过液，滤过，滤液于50℃减压浓缩至近干，加70％甲醇溶解并转移至50ml容量瓶定容。
供试液3取粉碎的丹参0.6g，三七0.6g，加入90％乙醇10ml浸泡1h，水浴回流提取2h，放冷，滤过，滤液于50℃减压浓缩至近干，加70％甲醇溶解并转移至50ml容量瓶定容。
供试液4取粉碎的丹参0.6g，三七0.6g，加入70％乙醇10ml浸泡1h，水浴回流提取2h，放冷，滤过，药渣继续用70％乙醇提取1次，合并滤液，滤液于50℃减压浓缩至近干，加70％甲醇溶解并转移至50ml容量瓶定容。
供试液5取粉碎的丹参0.6g，三七0.6g，加入90％乙醇10ml浸泡1h，水浴回流提取2h，放冷，滤过；药渣加入50％乙醇10ml继续提取1次，合并滤液，滤液于50℃减压浓缩至近干，加70％甲醇溶解并转移至50ml容量瓶定容。
供试液6取粉碎的丹参0.6g，三七0.6g，加入90％乙醇10ml浸泡1h，水浴回流提取2h，放冷，滤过；药渣加水30ml煎煮2h，放冷，滤过，滤液于50℃减压浓缩至2ml，加3倍量95％乙醇醇沉，冰箱静置过液，滤过，滤液同90％乙醇提取滤液合并，于50℃减压浓缩至近干，加70％甲醇溶解并转移至50ml容量瓶定容。
供试液7取粉碎的丹参0.6g，三七0.6g，加入90％乙醇10ml浸泡1h，水浴回流提取2h，放冷，滤过；药渣加水30ml煎煮2h，放冷，滤过，合并滤液，于50℃减压浓缩至近干，加50％甲醇溶解并转移至50ml容量瓶定容。
供试液8取粉碎的丹参0.6g，三七0.6g，加入90％乙醇10ml浸泡1h，水浴回流提取2h，放冷，滤过；药渣加水30ml煎煮2h，放冷，滤过，合并滤液，于50℃减压浓缩至近干，加60％甲醇溶解并转移至50ml容量瓶定容。
供试液9取粉碎的丹参0.6g，三七0.6g，加入90％乙醇10ml浸泡1h，水浴回流提取2h，放冷，滤过；药渣加水30ml煎煮2h，放冷，滤过，合并滤液，于50℃减压浓缩至近干，加70％甲醇溶解并转移至50ml容量瓶定容。
制备丹七方各供试品溶液，液相色谱仪自动进样10μl进行色谱分析。结果表明单纯水提，70％乙醇及90％乙醇提取均不能很好的兼顾丹七方水溶性及脂溶性成分；90％乙醇与水提取相结合比90％乙醇与50％乙醇提取相结合效果好，但水提部分经醇沉对原儿茶醛略有损失，故可不经过醇沉；样品用70％甲醇溶解比用50％及60％甲醇溶解能更好的兼顾水溶性及脂溶性成分。综上，选取最优的供试液9的制备工艺。
3.5检测方法的方法学考察3.5.1供试品溶液稳定性及仪器精密度实验按“1”项下方法制备丹七方供试品溶液，分别在0、2、4、12、18、24小时检测指纹图谱(见图1-1，1-2)，考察丹七方供试品溶液的稳定性以及高效液相色谱仪的精密度。结果表明丹七方供试液在24小时内稳定，高效液相色谱仪的精密度也符合要求。
3.5.2供试品溶液测定的重复性实验取同一批丹参及三七药材粗粉(40目)，按“1”项下方法平行制备3份丹七方供试溶液，检测HPLC指纹图谱(见图2-1，2-2)，考察丹七方的提取方法及指纹图谱检测方法的稳定性和重复性。结果表明丹七方供试液制备方法稳定可靠，具有很好的重现性。
3.5.3记录时间的确定丹七方供试液在“2”项色谱条件下的2小时记录图和空白对照图(见图3-1，3-2)，考察最佳记录时间。结果表明，80min以后基本无样品中的成分，因而确定最佳记录时间为85min。
3.5.4标准品对照实验采用原儿茶醛、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮IIA、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1为参照物，精密称定适量，用70％甲醇溶解，制成标准品溶液，记录色谱图(见图4)。
结论通过对丹七方供试液制备方法，色谱条件选择及色谱条件方法学研究，确定的现有丹七方色谱分析条件可满足对丹七方中丹参和三七的多类活性成分的同时检测与分析。
我们将此指纹图谱条件进一步用于含有丹参和三七药材的复方制剂的质量控制。具体如下1.复方丹参制剂的供试液制备取丹七片(去糖衣)、复方丹参片和复方丹参滴丸(去除薄膜衣)适量，研成粉末，用70％甲醇溶解并转移到容量瓶中定容。超声提取，放冷，加入70％甲醇补足重量。溶液过0.45μm滤膜，即得。
2.用本发明的指纹图谱条件对复方丹参制剂的供试液进行HPLC-DAD色谱分析，即得复方丹参制剂指纹图谱。
图1-1供试品溶液稳定性及仪器精密度实验色谱图(203nm)，其中色谱图WDQ00135～WDQ00140分别为0～24小时色谱1-2供试品溶液稳定性及仪器精密度实验色谱图(281nm)，其中色谱图WDQ00135～WDQ00140分别为0～24小时色谱2-1供试品溶液测定的重复性实验色谱图(203nm)图2-2供试品溶液测定的重复性实验色谱图(281nm)图3-1记录时间实验的色谱图(203nm其中WDQ00120为空白；WDQ00121为供试品)图3-2记录时间实验的色谱图(281nm其中WDQ00120为空白；WDQ00121为供试品)图4标准品对照试验的色谱5是实施例1中的丹七方指纹图谱图6是实施例2中市售丹七片的指纹图谱图7是实施例3中市售批号为040602的复方丹参片的指纹图谱图8是实施例3中市售批号为050308的复方丹参片的指纹图谱图9是实施例3中市售批号为03121024的复方丹参片的指纹图谱图10是实施例4中批号为20020921的复方丹参滴丸的指纹图谱图11是实施例4中批号为20030604的复方丹参滴丸的指纹图谱图12是实施例4中批号为20040303的复方丹参滴丸的指纹图谱图13是实施例5中丹七方的指纹图谱。
图14是实施例5中丹七片的指纹图谱。
图15是实施例5中复方丹参片的指纹图谱。
图16是实施例5中复方丹参滴丸的指纹图谱。
图17是实施例6中丹七片的指纹图谱。
图18是实施例6中复方丹参滴丸的指纹图谱。
以上附图中各数字表示的是1.原儿茶醛 2.三七皂苷R1 3.人参皂苷Rg1 4.丹酚酸B 5.人参皂苷Rb1 6.隐丹参酮 7.丹参酮IIA
具体实施例方式实施例11实验材料1.1仪器与器材Agilent 1100型系列高效液相色谱仪，包括G1312A四元梯度泵、G1313A自动进样器、G1316A柱温箱，G1315A DAD检测器，HP Chemstation色谱工作站(美国惠谱公司)；旋转薄膜蒸发仪(瑞士Büchi公司)。
1.2试剂及试药药材丹参(陕西天士力植物药业有限公司，陕西商洛)，经李萍教授鉴定为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根；三七(云南文山)，经李萍教授鉴定为五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根。
2.实验方法2.1色谱条件色谱柱C18色谱柱(ZORBAX ODS 4.6×250mm ID，5μm)和C18预柱(4.6×12.5mmID，5μm)；柱温30℃；流动相，A为0.1％的磷酸水；B为乙腈；A+B＝100％，采用梯度洗脱0-10min，7-17％B，10-12min，17-20％B，12-16min，20-21％B，16-32min，21％B，32-40min，21-29％B，40-55min，29-35％B，55-65min，35-70％B，65-75min，70-80％B，75-80min，80-97％B，80-82min，97-100％B，82-85min，100％B；流速1ml/min(22-28min，0.8ml/min)；检测波长203，281nm。记录时间85min。
2.2供试品溶液的制备取粉碎的丹参1.2g，三七1.2g，加入90％乙醇25ml，浸泡1h，水浴回流提取2h，放冷，滤过；药渣加40ml水继续煎煮2h，滤过，合并滤液，于50℃减压回收乙醇至干，加70％甲醇溶解并转移至100ml容量瓶定容至刻度，微孔滤膜过滤，得供试品溶液。
3.实验结果将供试品溶液进样10μl进行色谱分析，即得丹七方指纹图谱，记录时间为85min。见图5。
实施例2取市售丹七片(湖南安邦制药有限责任公司，批号040803)20片，去糖衣并研磨成粉末，精密称取0.5g，置25ml棕色容量瓶中，70％甲醇定容。超声提取30min，放冷，加入70％甲醇补足重量。溶液过0.45μm滤膜。其它条件同实施例1。进样10μl进行色谱分析，得丹七片HPLC-DAD指纹图谱，见图6。
实施例3取市售复方丹参片(广东白云山制药厂，批号03121024；南京同仁堂制药有限责任公司，批号040602；浙江胡庆余堂制药有限责任公司，批号050308)20片，研磨成粉未，精密称取0.5g，置25ml棕色容量瓶中，70％甲醇定容。超声提取30min，放冷，加入70％甲醇补足重量。溶液过0.45μm滤膜。其它条件同实施例1。进样10μl进行色谱分析，得3个厂家复方丹参片HPLC-DAD指纹图谱，见图7-9。
实施例4取市售复方丹参滴丸(天津天士力制药有限责任公司，批号20020921，20030604，20040303)75粒，精密称定，研成粉未，去除薄膜衣，用70％甲醇溶解并转移到25ml棕色容量瓶中定容。超声提取30min，放冷，加入70％甲醇补足重量。溶液过0.45μm滤膜。其它条件同实施例1。进样10μl进行色谱分析，得3个批号复方丹参滴丸的HPLC-DAD指纹图谱。见图10-12。
实施例5用上述实施例同样的方法，只是将洗脱梯度改为55分钟后55-65min，35-65％B，65-80min，65-80％B，80-85min，80-100％B。分别对丹七方，丹七片，复方丹参片(广东白云山制药厂，批号03121024)及复方丹参滴丸(天津天士力制药有限责任公司，批号20020921)进行色谱分析，得指纹图谱见图13-16。
实施例6用实施例1、2、4的方法，只是记录时间改为60分钟，分别对丹七片和复方丹参滴丸(天津天士力制药有限责任公司，批号20020921)进行色谱分析。得指纹图谱见图17-18。
综上，本发明所建立的丹参和三七复方的HPLC-DAD指纹图谱可用于同时检测丹参中丹酚酸B等酚酸类水溶性成分和丹参酮IIA等二萜醌类脂溶性成分以及三七中皂苷类成分，方法可靠、稳定，可用于含有丹参和三七的复方制剂的质量控制。
权利要求
1.丹参和三七复方制剂的指纹图谱鉴定方法包括建立标准的指纹图谱、用相同方法测定待测样品的指纹图谱、将待测品的指纹图谱与标准指纹图谱对比，其特征采用如下方法获得指纹图谱使用高效液相色谱仪，DAD检测器，色谱工作站，将丹参和三七复方溶液，采用如下色谱条件色谱柱碳十八烷基键合硅胶填料色谱柱和预柱；柱温25-35℃；流动相A为0.1-0.5％的磷酸水；B为乙腈；A+B＝100％，采用梯度洗脱0-10min，7-17％B，10-12min，17-20％B，12-16min，20-21％B，16-32min，21％B，32-40min，21-29％B，40-55min，29-35％B，55-65min，35-70％B，65-75min，70-80％B，75-80min，80-97％B，80-82min，97-100％B，82-85min，100％B；或者在55分钟后梯度为55-65min，35-65％B，65-80min，65-80％B，80-85min，80-100％B；流速1ml/min，在22～28分钟时，流速为0.8ml/min；检测波长203，281nm。
2.权利要求1的指纹图谱鉴定方法，其中柱温是30℃。
3.权利要求1的指纹图谱鉴定方法，其中磷酸水的浓度为0.1％。
4.权利要求1的指纹图谱鉴定方法，其中标准图谱供试品溶液的制备方法是取粉碎的丹参和三七，加入85-95％乙醇浸泡，水浴回流提取，放冷，滤过；药渣加水煎煮，放冷，滤过，合并滤液，浓缩至近干，加50-90％甲醇溶解，定容。
5.权利要求4的指纹图谱鉴定方法，其中样品的制备方法取粉碎的同样份数的丹参和三七，加入6-12倍重量份数90％乙醇浸泡，水浴回流提取，放冷，滤过；药渣加水煮，加水量是药渣重量的10-30倍，放冷，滤过，合并滤液，于50℃减压浓缩至近干，加70％甲醇溶解，定容。
6.权利要求1的指纹图谱鉴定方法，其中待测样品的制备方法为将待测样品制剂去糖衣或去除薄膜衣，研成粉末，用70％甲醇溶解并定容，超声提取，放冷，加入70％甲醇补足重量，过滤，即得。
7.权利要求1的指纹图谱鉴定方法，液相色谱仪进样量为10μl。
全文摘要
本发明涉及天然药物的质量控制领域，具体为指纹图谱领域，具体涉及丹参和三七复方的HPLC－DAD指纹图谱鉴定方法。本发明可作为含有丹参和三七药材的复方制剂如丹七片、复方丹参片及复方丹参滴丸等的质量控制指标之一。
文档编号G01N33/15GK1806819SQ200510095180
公开日2006年7月26日 申请日期2005年11月2日 优先权日2005年11月2日
发明者李萍, 韦英杰, 李松林 申请人:中国药科大学