HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原免疫应答抗HIV实验与方法

专利名称：HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原免疫应答抗HIV实验与方法
技术领域：
本发明涉及了一种HIV-Erw基因DNA变构重组包膜蛋白抗原免疫 应答抗HIV实验与方法。它涉及生命科学领域、及医药领域。能够揭 示HIV感染人体复制，通过包膜蛋白gpl20——人CD4受体的异种特异 配体抗原，与人CD4+细胞特异受体特异结合，触发HIV感染者人体免 疫耐受机制，能够比HIV具有高度变异性免疫逃逸机制，更为有效对 -抗人体免疫抑制压力。证实迄今HIV疫苗科学研究设计、研制的， 所有各种不同的HIV包膜蛋白gpl60、gp120抗原疫苗的临床人体试验， 不能证实可以预防HIV感染人类,最重要的因素是:HIV包膜蛋白gpl20 或gpl60是人CD4受体的异种特异配体抗原，与人CD4+细胞特异受体 特异结合，触发人体免疫耐受机制，不能激发有效根除HIV的免疫应 答机制。寻找到能够解决HIV包膜蛋白gpl20触发人体免疫耐受机制 的方法，研制不触发人体免疫耐受机制的，HIV-Env基因DNA变构重组 包膜蛋白抗原抗HIV治疗疫苗、抗HIV预防疫苗，提供足够充分的直 接动物模型实验科学依据、直接临床人体实验科学依据。
背景技术：
自1983年人免疫缺陷病毒——艾滋病被发现以来，客观的讲，人 类在根治、预防艾滋病科学研究方面，至今没有取得解决根本问题的 科学研究突破。没有科学研究迹象表明抗HIV治疗可以彻底治愈HIV 感染者；HIV疫苗可能会有效预防HIV感染。HIV科学界，把不能根治、预防艾滋病AIDS，归咎于HIV复制速 度快、HIV基因具有高度变异性病毒的产量平均约为107天，HIV 在体内的平均产生时间约为2. 6天；体外测定每6000个核甘酸在逆转 录过程中有一次错误的概率，体内测试显示每轮复制过程可能产生一 次突变。可产生大量具有各种不同基因变异型或表型的毒株，应对药 物抑制压力、机体免疫抑制压力，不断衍生出新的耐药毒株、免疫逃 逸毒株优势病毒种株。病毒通过特异性突变所获得的选择性优点将对 病毒基因组产生有力的影响。HIV感染人体免疫应答，出现高滴度的 HIV的特有的抗体是HIV原发性免疫反应的特征，它出现在病毒血症的 高峰或稍晚时间。这最初的抗体反应不包括HIVgpl20中和抗体。抗逆 转录病毒药和IL-2治疗虽然可以使CD4+T细胞计数增加，却未能使解 体Ve库恢复。应用IL-2治疗期间CD4+T细胞的增加来源于CD4+T细胞 库在胸腺外的扩增，因为T细胞Ve库的PCR分析证明缺失的克隆不能 再生。用IL-2和抗逆转录病毒药试图重建T细胞Ve库的失败，暗示 免疫系统的损伤可能存在阈值，若超过该阈值，免疫功能便不能重建。 间接感染或各种疫苗免疫的HIV感染个体都有血浆病毒血症暂时增加， 并且与诱导产生免疫活性程度相关；类似的发现也可见于SIV感染的 恒河猴中。上述众多不可被一一综述HIV科学研究发现，显示HIV 感染人体复制，是在最初期、还没有激发机体免疫应答之前，通过包 膜蛋白gpl20——人CD4受体的异种特异配体抗原，与人CD4+细胞特异 受体特异结合，首先触发HIV感染者人体免疫耐受机制，导致感染人 体免疫系统针对HIV感染复制体液免疫应答反应延迟，不能首先产生 针对gpl20的保护性中和抗体、抑制gpl20与CD4+细胞特异受体特异
结合触发的免疫耐受机制；使HIV可以在人体免疫应答产生针对gpl20 的保护性中和抗体之前，还没有被细胞免疫CTL有效抑制时、HIV过度 复制达到病毒血症峰值，进一步触发细胞免疫耐受机制-细胞免疫损伤 机制；使HIV在感染者体内复制，不能激发有效根除HIV的体液免疫 应答机制、细胞免疫应答机制，能够比HIV具有高度变异性免疫逃逸 机制，更为有效对抗机体免疫抑制压力。迄今HIV疫苗科学研究设计、 研制的，所有各种不同的HIV包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗的各 种临床人体试验，不能证实可以预防HIV感染人类，最重要的因素是 gpl20或gpl60是人CD4受体的异种特异配体抗原，与人CD4+细胞特异 受体特异结合，首先触发HIV感染者人体免疫耐受机制，不能激发有 效根除HIV的免疫应答机制。现代疫苗科学研究设计、研制的，HAV甲肝灭活疫苗仅需要 100ng 500 ng接种一次，即可使90%以上接种人体产生保护性中和抗 体；HBV乙肝重组DNA蛋白HBs抗原疫苗MSD疫苗、C0H疫苗，仅需要 5|ig 20接种三次，即可使90%以上接种人体产生保护性抗-HBs中和 抗体。现代疫苗科学研究设计、研制的，HIV重组DNA包膜蛋白gp120 或gpl60抗原疫苗，多数受试者在用300Pg HIV-IIIB gpl20、 300^g或 60Cmg HIV-丽gpl20接种三次，仅可产生针对V3环的抗体、针对实验 室同源毒株的中和抗体，不能中和野生hiv毒株、预防野生hiv毒株 感染人类。例如，HlV包膜蛋白gpl60抗原疫苗，通常需用较高剂量接 种4次以上才能使少数受试者产生较低滴度的同源中和抗体；Vaxgene公司的hiv包膜蛋白gPi2o抗原疫苗在北美和泰国进行大规模的m临床人体试验，公布的北美地区的试验结果，其中接种疫苗人群HIV感 染率为5. 7%，未接种疫苗人群HIV感染率为5. 8%。临床人体试验结果 表明gpl20抗原疫苗不能有效预防HIV感染。迄今已经有上百次各种 不同HIV包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗临床人体实验失败，不能 一一综述。HIV包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗接种临床人体，表现 出体液免疫应答延迟、弱免疫原体液免疫应答反应，与HIV感染入体 复制最初表现体液免疫应答延迟，不能首先产生针对gpl20的保护性 中和抗体，弱免疫原体液免疫应答反应极为相似，可以为HIV感染人 体，通过包膜蛋白gp120——人CD4受体的异种特异配体抗原，与人 CD4+细胞特异受体特异结合，首先触发HIV感染者人体免疫耐受机制， 能够比HIV具有高度变异性免疫逃逸机制，更为有效对抗人体免疫抑 制压力，提供HIV疫苗相关临床人体实验科学依据。己经有众多相关器官移植免疫耐受动物模型实验结果证实给动 物注射CD4受体的异种特异配体抗原，动物CD4受体的异种特异配体 抗原与动物CD4+细胞特异受体特异结合，触发动物机体针对CD4异种 特异配体抗原的体液免疫、细胞免疫耐受机制；表现出针对动物CD4 异种特异配体抗原的体液免疫应答延迟、弱免疫原体液免疫应答反应。 与现代HIV疫苗科学研究实施过的，所有各种不同的HIV包膜蛋白 gpl20或gpl60抗原疫苗——人CM受体的异种特异配体抗原接种临床 人体实验，表现出针对HIV包膜蛋白gpl20或gpl60抗原——人CD4 受体的异种特异配体抗原体液免疫应答延迟、弱免疫原体液免疫应答 反应极为相似；与FIIV感染人体复制最初表现体液免疫应答延迟，不 能首先产生针对HIV包膜蛋白gpl20或gpl60抗原的保护性中和抗体， 弱免疫原体液免疫应答反应极为相似。实验证实，改变动物CD4受体 的异种特异配体抗原分子的某个或某些个氨基酸结构，使其失去与动物CD4受体结合的特异氨基酸结构表位、不能与动物CD4受体结合； 它将不能触发动物机体免疫耐受机制。发明者认为1.改变HIV包膜蛋白gpl20或gpl60——人CD4受 体的异种特异配体抗原分子的某个或某些个氨基酸结构，使其失去与 人CD4受体结合的特异氨基酸结构表位、不能与人CD4受体结合；它 将不能触发人体免疫耐受机制。2.现代HIV疫苗科学研究，设计研制 HIV-Env基因DNA ，重组、能够改变HIV包膜蛋白gpl20或gpl60 分子的某个或某几个氨基酸结构，使其失去与人CD4受体结合的特异 氨基酸结构表位、不能与人CD4受体结合，不触发人体免疫耐受机制 的HIV包膜蛋扫gpl20或gpl60抗原疫苗，将有可能在研制筛选抗HIV 治疗疫苗、抗HIV预防疫苗科学研究方面，取得科学创新突破。发明内容本发明公开了一种HIV-Erw基因DNA变构重组包膜蛋白抗原免疫 应答抗HIV实验与方法。1.用大鼠抗小鼠CD4受体的单克隆抗体 IgG2a/b——小鼠CD4受体的异种特异配体抗原，模拟HIV包膜蛋白 gpl20或gpl60~~—人CD4受体的异种特异配体抗原，多次免疫注射 CBA/Ca小鼠；采血检测免疫小鼠针对大鼠IgG2a/b——小鼠CD4受体 的异种特异配体抗原的体液免疫应答、抗体的滴度。2.用大鼠抗人或 抗兔的单克隆抗体IgG2a/b—不能与小鼠CD4受体结合的异种抗原， 模拟HIV-Env基因DNA变构重组、改变HIV包膜蛋白gpl20或gpl60 分子的某个或某些个氨基酸结构，使其失去与人CD4受体结合的特异 氨基酸结构表位、不能与人CD4受体结合，不触发人体免疫耐受机制
的HIV包膜蛋白gpl20或gpl60抗原，多次免疫注射CBA/Ca小鼠；采 血检测免疫小鼠针对大鼠IgC2a/b——-异种抗原的体液免疫应答、抗体 的滴度。证实1.改变HIV包膜蛋白gpl20或gpl60——人CD4异种特 异配体分子的某个或某些个氨基酸结构，使其失去与人CD4受体结合 的特异氨基酸结构表位、不能与人CD4受体结合，它不能触发人体免 疫耐受机制；提供直接动物模型实验科学依据。2.现代'HIV疫苗科学 研究，设计研制HIV-Env基因DNA变构重组、改变HIV包膜蛋白gpl20 或gpl60分子的某个或某几个氨基酸结构，使其失去与人CD4受体结 合的特异氨基酸结构表位、不能与人CD4受体结合，不触发人体免疫 耐受机制的HIV包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗，将有可能在研制 筛选抗HIV治疗疫苗v抗HIV预防疫苗科学研究方面，取得科学创新 突破。3.为研制HIV-Env基因DNA ^i^重组包膜蛋白抗原抗HIV治疗 疫苗、抗HIV预防疫苗，提供可实施的小鼠、恒河猴、大猩猩与临床 人体HIV疫苗实验科学研究方案。本发明的目的是，提供一种HIV-Erw基因DNA变构重组包膜蛋白 抗原免疫应答抗HIV实验与方法。设计、实施HIV-Env基因DNA变构 重组包膜蛋白抗原免疫应答抗HIV实验，揭示HIV感染人体复制，通 过包膜蛋白gpl20——人CD4受体的异种特异配体抗原，与人CD4+细胞 特异受体特异结合，触发HIV感染者人体免疫耐受机制，能够比HIV 具有高度变异性免疫逃逸机制，更为有效对抗人体免疫抑制压力。证 实迄今HIV疫苗科学研究设计、研制的，所有各种不同的HIV包膜 蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗的临床人体试验，不能证实可以预防HIV 感染人类，最重要的因素是HIV包膜蛋白gpl20或gpl60是人CD4
受体的异种特异配体抗原，与人CD4+细胞特异受体特异结合，触发HIV 感染者人体免疫耐受机制，不能激发有效根除HIV的体液免疫应答机 制、细胞免疫应答机制。寻找解决HIV包膜蛋白触发人体免疫耐受机 制的方法，研制不触发人体免疫耐受机制的，HIV-Erw基因DNA皿重 组包膜蛋白抗原抗HIV治疗疫苗、抗HIV预防疫苗，提供足够充分的 直接动物模型实验科学依据、直接临床人体实验科学依据。
具体实施例方式
为达到上述目的，实施本发明采用的方案 HIV-Env基因DNA变抱重组包膜蛋白抗原免疫应答抗HIV实验与方法 1.实验动物与临床试验人体
1.1. 实验动物4 6周龄无菌动物，CBA/Ca小鼠，C57BL/6小鼠或 BALB/c小鼠，Hu-PBL-SCID小鼠；非人类的灵长类动物，恒河猴，大 猩猩。
1. 2.临床试验人体未感染HIV- I的正常健康人，感染HIV- I急性 期患者。
2. 实验生物材料
2. 1.用大鼠抗小鼠CD4受体的单克隆抗体IgG2a/b——小鼠CD4受体 的异种特异配体抗原，模拟HIV包膜蛋白gpl20或gpl60——人CD4 受体的异种特异配体抗原；用大鼠抗人或抗兔的单克隆抗体IgG2a/b ——不能与小鼠CD4受体结合的异种抗原，模拟HIV-Env基因DNA变 抱重组、改变HIV包膜蛋白gpl20或gpl60分子某个或某些个氨基酸 结构，使其失去与人CD4受体结合的特异氨基酸结构表位、不能与人 CD4受体结合，不触发人体免疫耐受机制的HIV包膜蛋白gpl20或gpl60 异种抗原。模拟实验采用的大鼠抗小鼠CD4受体的单克隆抗体，大鼠抗人或抗兔的单克隆抗体，可以应用其它异种动物如兔、羊、人的同 种Ig型的单克隆抗体。2. 2.感染体外培养CD4+细胞的HIV- I病毒由取自HIV- I感染者最 初急性期的血浆、液氮低温冷冻保存备用；由取自HIV-I感染者最初 急性期的人PBMC细胞与CD4+细胞共同培养获得；实验室HIV- I毒株。 猴SIV毒株;将人HIV膜蛋白替换猴SIV膜蛋白所构成的镶嵌病毒-SHIV 杂合毒株。2.3. 体外培养CD4+细胞取自HIV-I感染者最初急性期的人PBMC 细胞；取自未感染HIV-I者的正常健康人PBMC细胞；传代人CD4+细胞 系，例如人T淋巴细胞系MT4。2.3.人淋巴细胞取自HIV-I感染者最初急性期，经非逆转录酶抑制 剂NRTIs/ NNRTIs抗HIV- I药联合治疗，经HIV-Env基因DNA变构重 组、不能与人CD4受体结合的HIV包膜蛋白gpl20或gpl60异种抗原-疫苗多次免疫注射治疗后，采血获取的人淋巴细胞。 2. 4. C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠血清正常小鼠血清；小鼠经HIV-Env 基因DNA变构重组、不能与人CD4受体结合的HIV包膜蛋白gpl20或 gpl60异种抗原疫苗多次免疫注射后，采血获取的含抗gpl20抗体的小 鼠血清。恒河猴血清正常恒河猴血清；恒河猴经HIV-Env基因DNA 变构重组、不能与人CD4受体结合的HIV包膜蛋白gpl20或gpl60异 种抗原疫苗多次免疫注射后，采血获取的含抗gpl20抗体的恒河猴血 清。大猩猩血清正常大猩猩血清；大猩猩经HIV-Env基因DNA变构 重组、不能与人CD4受体结合的HIV包膜蛋白gpl20或gpl60异种抗
原疫苗多次免疫注射后，采血获取的含抗gpl20抗体的大猩猩血清。 正常健康人AB血清。未感染HIV- I者的正常健康人，经HIV-Env基因 DNA变构重组、不能与人CD4受体结合的HIV包膜蛋白gpl20或gpl60 异种抗原疫苗多次免疫注射后，采血获取的含抗gpl20抗体的人AB血 清。HIV-I感染者最初急性期，经非逆转录酶抑制剂NRTIs/丽RTIs 抗HIV-I药联合治疗，经HIV-Env基因DNA变构重组、不能与人CD4 受体结合的HIV包膜蛋白gpl20或gpl60异种抗原疫苗多次免疫注射 治疗后，停止用药治疗7d后抽取的，含抗gpl20抗体的人血清。 3.实验检测、药物和试剂及与培养液3.1. 检测gpl20抗体的双夹心法、或直接夹心法试剂。3.2. HIV前病毒检测与试剂。3. 3. HIV病毒载量检测HIV-l Qiantiplex实验与试剂，或Amplicor HIV-IMonitor实验与试剂，或NucliSens HIV-1实验与试剂。 3. 4. CD4+T淋巴细胞检测实验与试剂。3. 5. RPMI-2加2%血清培养液，RPMI1640加10% 20%血清培养液含青 霉素-G100U/ml、庆大霉素5(mg/ml; Ficoll-Hystopaque密度梯度溶 液d:1.077g/ml Pharmacia,把10ml Ficoll液预先内置于50ml离心 管内；淋巴细胞处理液Nycomed， Birmingham, UK，把15ml淋巴细胞处 理液预先内置于50ml离心管内；EDTA钠盐、用生理盐水配制4%抗凝'液，把O. 4ml抗凝EDTA钠盐溶液预先内置于10ml注射器内，把0. 6ml 抗凝EDTA钠盐溶液预先内置于20ml注射器内。4. 制备生物实验材料4.1.设计、研制各种不同HIV-Env基因DNA变构重组、改变HIV包
膜蛋白gpl20或gpl60分子的某个或某些个氨基酸结构，使其失去与 人CD4受体结合的特异氨基酸结构表位、不能与人CD4受体结合，不 触发人体免疫耐受机制的HIV包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗—— HIV-1包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗。4. 2.用大鼠抗小鼠CD4受体的单克隆抗体IgG2a/b——小鼠CD4受体 的异种特异配体抗原，模拟HIV包膜蛋白gpl20或gpl60——人CD4 受体的异种特异配体抗原，在实施实验时分别制备用含有10%小鼠血 清的生理盐水配制的3Pg/ml、 6Pg/ml、 l(mg/ml溶液；用大鼠抗人或 抗兔的单克隆抗体IgG2a/b——不能与小鼠CD4受体结合的异种抗原， 模拟HIV-Env基因DNA变构重组、不能与人CD4受体结合，不触发人 体免疫耐受机制的HIV包膜蛋白gpl20或gpl60异种抗原，在实施实 验时分别制备:用含有10%小鼠血清的生理盐水配制的3^/ml、6l^g/ml、 10Pg/ml溶液。4.3. HIV-Env基因DNA变构重组、不能与人的CD4受体结合的HIV包 膜蛋白gpl20或gP160抗原疫苗，在实施实验时分别制备用含有10% 小鼠血清的生理盐水配制的50Pg/ml溶液；用含有10%人AB血清的生 理盐水配制的50Pg/ml、 100Pg/ml、 200Pg/ml溶液。 4. 4.制取人PBMC细胞应用预先内置有0. 4ml抗凝EDTA钠盐溶液的 10ml注射器，无菌抽取未感染HIV- I者静脉血10ml、或感染HIV- I 者静脉血10ml，加2倍RPMI-2培养液混匀；将其仔细缓慢加入预先内 置有Ficoll液10ml的50ml离心管上层；20°C、 400g离心30min; 用灭菌吸管小心把离心管Ficoll液和血液分界层间的PBMC细胞吸 出，置入新离心管加5倍RPMI—2培养液混匀；20°C、 300g离心lOmin，200610170474.6说明书第ll/26页弃上清液，加5倍RPMI-2培养液混匀；20°C、 200g离心5min，弃上 清液，用含有10%人AB血清的RPMI1640培养液，配制细胞悬液 1X107ml、并进行活细胞计数。4.5.制取人淋巴细胞应用预先内置有0.6ml抗凝EDTA钠盐溶液的 20ml注射器，无菌抽取未感染HIV- I者静脉血15ml、或感染HIV- I 者静脉血15ml，加1倍RPMI-2培养液混匀；将其仔细缓慢加入预先内 置有淋巴细胞处理液15ml的50ml离心管上层；不要刹车，20°C、 800g 离心25min;用灭菌吸管小心吸取离心管淡黄色层，置入新离心管加5 倍RPMI-2培养液混匀；20°C 、300g离心10min，弃上清液，加5倍RPMI-2 培养液混匀；2(TC、 200g离心5min，弃上清液，用含有l(m人AB血清 的RPMI1640培养液，配制细胞悬液2X107ml、并进行活细胞计数。 会.6.活细胞计数检测EB和AO各0. lmg溶于100ml PBS液，制备EB/AO 工作液；待检测细胞悬液20l4 50W，与适量体积2(mi lml的EB/AO 溶液混合，使最终细胞浓度为2Xl(f 2X107ml;将细胞悬液加入血 球计数器，使用荧光显微镜配合紫外线UV和可见光，对活细胞绿色、 死细胞橙色计数。或应用2.5g/L台盼蓝溶于PBS液，做细胞染色活细 胞计数；台盼蓝是致癌剂，实验操作需要带手套。 4.7.制取人血清无菌抽取未感染HIV-I者静脉血200ml、或感染 HIV- I者静脉血200ml;分置4只100ml离心管内，2000g离心10min， 离心后4。C低温静置60min;然后用血管钳挤压血凝块，挤出内含的血 清；弃去血凝块，再分置2只100ml离心管内，5 10000g离心60min; 用一系列过滤器进行过滤，最后用0.1 U m孔径无菌过滤器进行过滤后; 分置于多个小无菌高密度聚丙烯容器，放置-7(TC冰箱保存备用。
4.8. 制取动物血清方法如上。
4.9. 人淋巴细胞免疫缺陷鼠Hu-PBL-SCID的再构建用人淋巴细胞悬 液2X107ml 、 0.2ml/只，注射到4 6周龄免疫缺陷鼠的腹膜腔内。 5.建立HIV- I毒株感染细胞体外培养系统
5.1.建立实验室HIV- I毒株感染细胞体外培养系统；HIV- I感染者 最初急性期HIV- I毒株感染细胞体外培养系统
5.1.1. 用含有10%胎牛血清、10%含抗gpl20抗体的动物血清的 RPMI1640培养液，调整MT4细胞浓度为5X107ml培养细胞悬液，每 个50ml细胞培养瓶中加入10ml该培养MT4细胞浓度悬液，在细胞培 养瓶中接种浓度为1000TCID50的实验室HIV- I毒株，将细胞培养瓶放 置37。C， 5%C02的培养箱中培养；用含有10%胎牛血清、1(F。不含gpl20 抗体的正常动物血清的RPMI1640培养液，调整MT4细胞浓度为 5X 107ml培养细胞悬液，每个50ml细胞培养瓶中加入10ml该培养MT4 细胞浓度悬液，在细胞培养瓶中接种浓度为1000TCID50的实验室HIV-I毒株，将细胞培养瓶放置37"C， 5%(:02的培养箱中培养。每培养3d 吸取细胞培养瓶中上清液，补充新鲜培养液。培养第4d后每天在倒置 显微镜观察培养细胞病变。培养12d后，对细胞培养瓶中没有被HIV-I感染致死的活细胞计数。
5.1.2. 用含有1(^正常人AB血清、1()%含抗gpl20抗体的动物血清的 RPMI1640培养液，调整正常人PBMC细胞浓度为5X 106/ml培养细胞悬 液，每个50ml细胞培养瓶中加入10ml该培养正常人PBMC细胞浓度悬 液，在细胞培养瓶中接种2.5X106、取自HIV-I感染者最初急性期液 氮低'温保存备用复苏的人PBMC细胞，将细胞培养瓶放置37"C， 5%C02
的培养箱中培养；用含有109&正常人AB血清、10%不含gpl20抗体的正 常动物血清的RPMI1640培养液，调整正常人PBMC细胞浓度为 5X107ml培养细胞悬液，每个50ml细胞培养瓶中加入10ml该培养正 常人PBMC细胞浓度悬液，在细胞培养瓶中接种2.5X106、取自HIV-I感染者最初急性期液氮低温保存备用复苏的人PBMC细胞，将细胞培 养瓶放置37t:， 5%C02的培养箱中培养。每培养3d吸取细胞培养瓶中 上清液，补充新鲜培养液。培养第4d后每天在倒置显微镜观察培养细 胞病变。培养12d后，对细胞培养瓶中没有被HIV- I感染致死的活细 胞计数。5.1.3. 用含有10%正常人AB血清、10%含抗gpl20抗体的人血清的 RPMI1640培养液，调整MT4细胞浓度为5X107ml培养细胞悬液，每 个50ml细胞培养瓶中加入10ml该培养MT4细胞浓度悬液，在细胞培 养瓶中接种浓度为1000TCID50的实验室HIV- I毒株，将细胞培养瓶放 置37°C ， 5%C02的培养箱中培养；用含有20%正常人AB血清的RPMI1640 培养液，调整MT4细胞浓度为5X107ml培养细胞悬液，每个50ml细 胞培养瓶中加入10ml该培养MT4细胞浓度悬液，在细胞培养瓶中接种 浓度为1000TCID50的实验室HIV- I毒株，将细胞培养瓶放置37°C， 5%C02的培养箱中培养。每培养3d吸取细胞培养瓶中上清液，补充新 鲜培养液。培养第4d后每天在倒置显微镜观察培养细胞病变。培养12d 后，对细胞培养瓶中没有被HIV-I感染致死的活细胞计数。5.1.4. 用含有10%正常人AB血清、10%含抗gpl20抗体的人血清的 RPMI1640培养液，调整正常人PBMC细胞浓度为5X lOVml培养细胞悬 液，每个50ml细胞培养瓶中加入10ml该培养正常人PBMC细胞浓度悬
液，在细胞培养瓶中接种2. 5X106、取自HIV- I感染者最初急性期液 氮低温保存备用复苏的人PBMC细胞，将细胞培养瓶放置37r， 5%C02 的培养箱中培养；用含有209&正常人AB血清的RPMI1640培养液，调整 正常人PBMC细胞浓度为5X 107ml培养细胞悬液，每个50ml细胞培养 瓶中加入10ml该培养正常人PBMC细胞浓度悬液，在细胞培养瓶中接 种2.5X106、取自HIV- I感染者最初急性期液氮低温保存备用复苏的 人PBMC细胞，将细胞培养瓶放置37"C， 5%C02的培养箱中培养。每培 养3d吸取细胞培养瓶中上清液，补充新鲜培养液。培养第4d后每天 在倒置显微镜观察培养细胞病变。培养12d后，对细胞培养瓶中没有 被HIV- I感染致死的活细胞计数。 6.实验方法、检测、结果评定6.1.模拟HIV-Erw基因DNA变构重组包膜蛋白抗原免疫CBA/Ca小鼠 抗HIV动物模型，实验方法、检测、结果评定6.1. 1.用大鼠抗小鼠CD4受体的单克隆抗体IgG2a/b——小鼠CD4受 体的异种特异配体抗原，模拟HIV包膜蛋白gpl20或gpl60——人CD4 受体的异种特异配体抗原。模拟HIV感染人体，人体针对HIV复制表 达包膜蛋白gpl20或gpl60——人CD4受体的异种特异配体抗原的免疫 应答机制，肌肉注射免疫l组10只4 6周龄CBA/Ca小鼠3l^g/ml、 0.2ml/只，Od、 3d、 6d、 9d各一次；6Pg/ml、 0.2ml/只，12d、 15d 各一次；10Pg/ml、 0.2ml/只，18d各一次;6Pg/ml、 0.2ml/只，21d、 44d各一次;3fVml、 0.2ml/只，27d、 30d、 33d各一次。 6.1.2.用大鼠抗人或抗兔的单克隆抗体IgG2a/b——不能与小鼠CD4 受体结合的异种抗原，模拟HIV-Env基因DNA变构重组、不能与人CD4
受体结合的HIV包膜蛋白gpl20或gpl60异种抗原，肌肉注射免疫2 组10只4 6周龄CBA/Ca小鼠3Pg/ml、 0.2ml/只，Od、 3d、 6d、 9d 各一次；6Pg/ml、 0.2ml/只，12d、 15d各一次;膨g/ml、 0.2ml/只， 18d各一次;6Pg/ml、 0. 2ml/只，21d、 44d各一次;3Pg/ml、 0. 2ml/ 只，27d、 30d、 33d各一次。6.1.3.在免疫接种第14d、 21d、 28d、 35d、 42d，分别对1组、2组 各自10只小鼠，尾部微量采血，检测每只小鼠针对大鼠IgG2a/b—— 异种抗原的体液免疫应答、抗体的滴度。实验1组免疫小鼠针对大鼠 IgG2a/b——小鼠CD4受体的异种特异配体抗原的体液免疫应答延迟、 血清抗大鼠IgG2a/b异种抗原的抗体滴度，明显低于实验2组免疫小鼠 针对大鼠IgC2a/b——异种抗原的体液免疫应答、血清抗大鼠IgG2a/b 异种抗原的抗体滴度。动物实验结论l.注射动物CD4受体的异种特 异配体抗原，异种特异配体抗原与动物CD4+细胞特异受体特异结合， 触发动物机体针对CD4异种特异配体抗原的免疫耐受机制；表现出针 对CD4异种特异配体抗原的体液免疫应答延迟、弱免疫原体液免疫应 答反应。与HIV疫苗科学研究实施过的，各种不同的HIV包膜蛋白gpl20 或gpl60抗原-疫苗临床人体实验，免疫接种人体表现出针对HIV包膜 蛋白gpl20或gpl60——人CD4受体的异种特异配体抗原体液免疫应答 延迟、弱免疫原体液免疫应答反应极为相似；与HIV感染人体复制最 初表现体液免疫应答延迟，不能首先产生针对HIV包膜蛋白gpl20或 gpl60抗原的保护性中和抗体，弱免疫原体液免疫应答反应极为相似。 2.实验证实，改变动物CD4受体的异种特异配体抗原分子的某个或某 些个氨基酸结构，使其失去与动物CD4受体结合的特异氨基酸结构表 位、不能与动物CD4受体结合；它将不能触发动物机体免疫耐受机制。3.实验证实，改变HIV包膜蛋白gpl20或gp160——人CD4受体的异 种特异配体抗原分子的某个或某些个氨基酸结构，使其失去与人CD4 受体结合的特异氨基酸结构表位、不能与人CD4受体结合；它将不能 触发人体免疫耐受机制，提供直接动物模型实验科学依据。4.设计研 制HIV-Env基因DNA变构重组、改变:HIV包膜蛋白gpl20或gpl60抗 原分子的某个或某些个氨基酸结构，使其失去与人CD4受体结合的特 异氨基酸结构表位、不能与人CD4受体结合，不触发人体免疫耐受机 制的HIV包膜蛋白gpl20或gpl60抗原-疫苗，将有可能在研制筛选抗 HIV治疗疫苗——抗HIV预防疫苗科学研究方面，取得重大科学创新突 破。提供相关实验动物模型实验科学依据。6. 2. HIV-Erw基因DNA变构重组包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗免 疫C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠抗HIV动物模型，实验方法、检测、结 果评定6. 2.1.对1组30只4 6周龄C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠，实施断头 采血，制取正常动物血清。6. 2. 2.用HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫 苗免疫C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠，肌肉注射免疫2组30只4 6周 龄C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠50l^g/ml、 0.2ml/只,Od、 14d、 28d、 42d各一次。在免疫接种第14d、 21d、 28d、 35d、 42d，尾部微量采血， 检测每只小鼠针对HIV-Env基西DNA变构重组包膜蛋白gpl20或gpl60 抗原的体液免疫应答、抗体的滴度。49d，分别各自断头采血处死30 只小鼠，制取含抗gpl20抗体的动物血清。6. 2. 3.分别用1组30只小鼠的混合正常动物血清、2组30只小鼠的 含抗gpl20抗体混合动物血清，实施5. 1. 1. / 5. 1. 2. HIV- I毒株感染 细胞体外培养系统实验2种HIV- I毒株感染T4细胞体外培养、每种 3个细胞培养瓶，2种HIV- I毒株感染人PBMC细胞体外培养、每种3 个细胞培养瓶。各自培养12d后，对细胞培养瓶中没有被HIV- I感染 致死的活细胞计数。检测用HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gpl20 或gpl60抗原疫苗免疫C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠抗HIV模型，体液 免疫应答产生的抗gpl20抗体，抑制实验室HIV- I毒株感染细胞的能 力、抑制感染人体野生HIV-I毒株感染细胞的能力。6.2.小鼠抗HIV动物模型，应用做实验检测、筛选研制各种不 同的HIV-Env基因DNA变构重组、改变HIV包膜蛋白gpl20或gpl60 抗原分子的某个或某些个氨基酸结构、使其失去与人CD4受体结合的 特异氨基酸结构表位，能够具有最好解除HIV免疫抑制的强免疫原性、 最好抑制感染人体野生HIV- I毒株感染细胞能力的，HIV-Env基因DNA 变构重组包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗，提供初步相关动物模型 实验科学依据。6. 3. HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗免 疫恒河猴抗HIV动物模型，实验方法、检测、结果评定6.3.1. 对12只恒河猴各自抽取静脉血30ml，制取正常动物血清。6.3.2. 用小鼠抗HIV动物模型实验初步证实的，HIV-Env基因DNA变 构重组包膜蛋白gpl20或gpl60抗原-疫苗，肌肉注射免疫12只恒河 猴50Pg/ml、 lml/只，Od、 21d、 42d各一次。在免疫接种第14d、 21d、 28d、 35d、 42d、 49d，采血检测每只恒河猴针对HIV-Env基因DNA变
构重组包膜蛋白gpl20或gpl60抗原的体液免疫应答、抗体的滴度。 60d，分别各自抽取静脉血30ml，制取含抗gpl20抗体的动物血清。分 别对12只恒河猴实施SHIV毒株攻毒实验。6.3.3.分别用每只恒河猴的正常动物血清、含抗gpl20抗体的动物血 清，实施5. 1.1./ 5. 1.2. HIV-I毒株感染细胞体外培养系统实验2 种HIV- I毒株感染T4细胞体外培养、每种3个细胞培养瓶，2种HIV-I毒株感染人PBMC细胞体外培养、每种3个细胞培养瓶。各自培养12d 后，对细胞培养瓶中没有被HIV-I感染致死的活细胞计数。检测用 HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gpl20、或gpl60抗原免疫恒河猴 抗HIV模型，体液免疫应答产生的抗gpl20抗体，抑制实验室HIV-I 毒株感染细胞的能力、抑制感染人体野生HIV- I毒株感染细胞的能力。 6.3.恒河猴抗HIV动物模型，应用做实验检测、筛选研制各种 不同的HIV-Env基因DNA变构重组、改变HIV包膜蛋白gpl20或gpl60 抗原分子的某个或某些个氨基酸结构、使其失去与人CD4受体结合的 特异氨基酸结构表位，能够具有最好解除HIV免疫抑制的强免疫原性、 最好抑制感染人体野生HIV- I毒株感染细胞能力的，HIV-Env基因DNA 变构重组包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗，提供进一步与人类相关 的灵长类动物模型实验科学依据。6. 4. HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗免 疫大猩猩抗HIV动物模型，实验方法、检测、结果评定6.4.1. 对4 6只大猩猩各自抽取静脉血30ml，制取正常动物血清。6.4.2. 用恒河猴抗HIV动物模型进一步证实的，HIV-Erw基因DNA变 构重组包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗，肌肉注射免疫4~6只大猩 猩20(mg/ml、 2ml/只，0d、 21d、 42d各一次。在免疫接种第14d、 21d、 28d、 35d、 42d、 49d，采血检测每只大猩猩针对HIV-Env基因DNA 变构重组包膜蛋白gpl20或gpl60抗原的体液免疫应答、抗体的滴度。 60d，分别各自抽取静脉血30ml，制取含抗gpl20抗体的动物血清。分 别对4 6只大猩猩实施取自临床人体感染HIV-1毒株急性期血浆攻毒 保护实验。6.4.3.分别用每只大猩猩的正常动物血清、含抗gpl20抗体的动物血 清，实施5. 1. 1. / 5. 1. 2. HIV- I毒株感染细胞体外培养系统实验2 种HIV- I毒株感染T4细胞体外培养、每种3个细胞培养瓶，2种HIV-I毒株感染人PBMC细胞体外培养、每种3个细胞培养瓶。各自培养12d 后，对细胞培养瓶中没有被HIV-I感染致死的活细胞计数。检测用 HIV-Erw基因DNA变构重组包膜蛋白gpl20或gpl60抗原免疫大猩猩抗 HIV模型，体液免疫应答产生的抗gpl20抗体，抑制实验室HIV- I毒 株感染细胞的能力、抑制感染人体野生HIV- I毒株感染细胞的能力。6.4.大猩猩抗HIV动物模型，应用做实验检测、筛选研制各种 不同的HIV-Env基因DNA变构重组、改变HIV包膜蛋白gpl20或gpl60 抗原分子的某个或某些个氨基酸结构、使其失去与人CD4受体结合的 特异氨基酸结构表位，能够具有最好解除HIV免疫抑制的强免疫原性、 最好抑制感染人体野生HIV- I毒株感染细胞能力的，HIV-Env基因DNA 变构重组包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗，提供更进一步与人类最 接近的灵长类动物模型实验科学依据。6.5. HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gpl20或gpl60抗原，作为 抗HIV治疗疫苗，与抗HIV药联合治疗HIV急性期感染患者，I临床 人体抗HIV治疗实验方法、检测、结果评定6. 5.1.在实施治疗前抽血制取HIV-[感染急性期患者的人PBMC细 胞，液氮低温冷冻保存备用。6. 5. 2.选择经非逆转录酶抑制剂NRTIs/ NNRTIs抗HIV- I药联合治 疗，可在14d内病毒载量下降为不可检测、28d内CD4+T淋巴细胞检测 计数可恢复》800AH的，40 60位患者。分2组，用猩猩抗HIV动物 模型更进一步证实的，HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gpl20或 gpl60抗原疫苗，与抗HIV药联合治疗HIV急性期感染患者1组lOCHig /人、2组200Pg/人，Od、 7d、 14d、 21d、 42d各一次。在免疫接种第 14d、 21d、 28d、 35d、 49d，采血检测每位患者针对HIV-Env基因DNA 变构重组包膜蛋白gpl20或gpl60抗原的体液免疫应答、抗体的滴度。 60d，分别各自抽取静脉血30ml，制取淋巴细胞。 6. 5. 3.用每位经非逆转录酶抑制剂NRTIs/丽RTIs抗HIV- I药联合治 疗，与HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gpl20或gpl60抗原—— 抗HIV治疗疫苗治疗患者的淋巴细胞，各自分别实施3 5只SCID鼠的， 人淋巴细胞免疫缺陷鼠Hu-PBL-SCID的再构建。21d，分别抽血处死 Hu-PBL-SCID鼠，分别做HIV前病毒检测、HIV病毒载量检测。 6. 5. 4.患者淋巴细胞重建Hu-PBL-SCID鼠的HIV前病毒、HIV病毒载 量为不可检测者，停止非逆转录酶抑制剂NRTIs/ NNRTIs抗HIV- I药 联合治疗7d后，抽取静脉血30ml，制取血清。实施5. 1. 3. / 5. 1. 4. HIV-I毒株感染细胞体外培养系统实验2种HIV- I毒株感染T4细胞体外 培养、每种3个细胞培养瓶；l种患者本人实施治疗前预留、液氮保存 的PBMC细胞HIV- I毒株感染人PBMC细胞体外培养、每种3个细胞培
养瓶，1种他人PBMC细胞HIV- I毒株感染人PBMC细胞体外培养、每 种3个细胞培养瓶。各自培养12d后，对细胞培养瓶中没有被HIV-I 感染致死的活细胞计数。检测用HIV-Erw基因DNA变构重组包膜蛋白 gpl20或gpl60抗原""抗HIV治疗疫苗，治疗HIV感染者，体液免疫 应答产生的抗gpl20抗体，抑制实验室HIV- I毒株感染细胞的能力、 抑制感染人体野生HIV- I毒株感染细胞的能力。 6. 5. 5.患者的血清抗gpl20抗体，具有抑制患者本人实施治疗前预留、 液氮保存的PBMC细胞HIV- I毒株感染细胞的能力，征求患者同意停止 非逆转录酶抑制剂NRTIs/丽RTIs抗HIV- I药联合治疗。对患者实施 定期抽血检测HIV前病毒、HIV病毒载量1年，观察是否会发生HIV 前病毒、HIV病毒载量反跳恢复？如果患者的HIV前病毒、HIV病毒载 量仍为不可检测，可被认为是应用HIV-Env基因DNA变构重组包膜 蛋白gpl20或gpl60抗原——抗HIV治疗疫苗，临床治愈的首例或几 例HIV-I感染者。6.5.抗HIV治疗疫苗I临床人体实验，应用做实验检测、筛选 研制各种不同的HIV-Env基因DNA变构重组、改变HIV包膜蛋白gpl20 或gpl60抗原分子的某个或某些个氨基酸结构、使其失去与人CD4受 体结合的特异氨基酸结构表位，能够具有最好解除HIV免疫抑制的强 免疫原性、最好抑制感染人体野生HIV-I毒株感染细胞能力的， HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gpl20或gpl60抗原疫苗，提供直 接临床人体实验科学依据。6.6. HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gpl20或gpl60抗原，作为 可以预防HIV感染人类的HIV疫苗，临床人体实验方法、检测、结果 评定6.6.1.用被临床抗HIV治疗疫苗治疗HIV感染者人体实验证实的， HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gpl20或gpl60抗原，作为可以预 防HIV感染人类的HIV疫苗，实施I、 II、 III期临床人体试验。实施 上述相关HIV疫苗实验科学研究、生物检测。6.6. I、 II、 III期临床人体试验应用做检验、筛选设计、研制 的，各种不同的HIV-Env基因DNA变构重组、改变HIV包膜蛋白gP120 或gpl60抗原分子的某个或某些个氨基酸结构，使其失去与人CD4受 体结合的特异氨基酸结构表位、不能与人CD4受体结合，能够具有最 好解除HIV免疫抑制的强免疫原性、最佳抑制感染人体野生HIV- I毒 株感染细胞能力的，HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gpl20或gpl60 抗原，将能够作为抗HIV治疗疫苗一—抗HIV预防疫苗，提供足够充 分的直接临床人体实验科学依据。 发明创新讨论自上个世纪70年代，Gershon提出"感染性免疫耐受(infection tolerance)"及"抑制性T细胞(suppressor T cells)",免疫耐受新 概念；Hall等1985年最先描述介导移植免疫耐受中抑制性CD4+T细胞 的存在;Qin等1993年实验证实，CD4+T细胞的存在能够明显抑制小鼠 移植免疫排斥反应，用非剔除的抗CD4和抗CD8抗体处理受者可以诱 导免疫耐受……。迄今世界各国从事器官移植免疫耐受研究的学者们， 针对CD4+细胞及CD4特异受体同特异配体抗CD4的mAb结合与器官移植免疫耐受的关系，在分子生物学科学研究层面，在细胞模型的细胞 生物学、分子生物学科学研究层面，在动物模型及临床人体的组织学、
细胞生物学、分子生物学科学研究层面，已经研究分析揭示的比较全 面。大量动物模型实验、及临床人体实验表明非剔除性抗T细胞辅 助分子的mAb，如抗CD4的mAb同CD4特异受体结合，使T细胞产生不 应答性，或诱导抑制性T细胞，建立T细胞免疫耐受、B细胞免疫耐受， 可以避免同种异体移植物的排斥反应，其免疫抑制功能失去抗原特异 性，即可以抑制对第三者抗原特异的T细胞免疫应答……等；诱导"感 染性免疫耐受"，诱导CD4+T前细胞Thl/Th2极性分化偏离，抗CD4单 克隆抗体可以阻止T细胞在胸腺的分化成熟，……等。有众多不可被 一一综述的，CD4+细胞及CD4特异受体同抗CD4的mAb特异配体抗 原结合，促发免疫耐受关系的科学研究文献、科学研究报告，可以供 HIV科学研究者学习借鉴，开拓HIV科学研究者的创新综合科学研究思 维，全面揭示HIV感染人体复制，通过表达包膜蛋白gpl20——人CD4 受体的异种特异配体抗原，与人CD4+细胞特异受体特异结合，触发HIV 感染者人体免疫耐受机制，导致感染机体免疫系统针对HIV感染体液 免疫应答反应延迟，不能首先产生针对gpl20的保护性中和抗体、抑 制gpl20与CD4+细胞特异受体特异结合触发的免疫耐受机制；使HIV 可以在免疫应答产生针对gpl20的保护性中和抗体之前，还没有被CTL 细胞免疫有效抑制时、过度复制达到病毒血症峰值，进一步触发细胞 免疫耐受机制-细胞免疫损伤机制，不能激发有效根除HIV的体液免疫 应答机制、细胞免疫应答机制；能够比HIV具有高度变异性免疫逃逸 机制，更为有效对抗机体免疫抑制压力的，现代细胞免疫学、分子免 疫学生物机制。可以借鉴器官移植免疫学的实验科学方法，利用现有的SIV、 HIV-
n恒河猴动物模型，SIV-mac239Anef减毒株疫苗、SIV包膜蛋白抗原 疫苗、HIV-II包膜蛋白抗原疫苗，实施揭示SIV包膜蛋白、HIV-II包 膜蛋白——猴CD4受体的异种特异配体抗原，与猴CD4+细胞特异受体 特异结合，触发猴机体免疫耐受机制相关的器官移植实验，为模拟证 实HIV感染人体，通过包膜蛋白gpl20-——人CD4受体的异种特异配体 抗原，与人CD4+T淋巴细胞受体特异结合，触发HIV感染者人体免疫耐 受机制，能够比HIV具有高度变异性免疫逃逸机制，更为有效应对机 体免疫抑制压力，提供可令人信服的，足够充分的相关动物模型实验 科学依据。通过"HIV-Erw基因DNA，重组包膜蛋白抗原免疫应答抗 HIV实验"，证实HIV感染人体，通过包膜蛋白gp120^人CD4受体 的异种特异配体抗原L与人CD4+T淋巴细胞受体特异结合，触发HIV 感染者人体免疫耐受机制，能够比HIV具有高度变异性免疫逃逸机制， 更为有效应对机体免疫抑制压力，提供足够充分的直接动物模型实验 科学依据、直接临床人体实验科学依据。但是它将会不幸的证实，HIV 疫苗科学研究设计、研制的，所有各种不同HIV包膜蛋白gpl20、 gpl60 抗原疫苗临床人体试验不能预防HIV感染人类，最重要的因素是 gpl20、 gpl60是人CD4受体的异种特异配体抗原，与人CD4+细胞特异 受体特异结合，触发HIV人体免疫耐受机制，不能激发有效根除HIV 的免疫应答机制。世界HIV疫苗科学研究在过去20多年里，关于是先 加强基础研究，搞清HIV致病机制和免疫机制，还是尽快开始人体试 验，在试验中积累知识，以便改进疫苗设计和工艺技术，各国专家的 意见趋于一致，错误的主张采取后者；在没有寻找到能够解决HIV包 膜蛋白gpl20触发人体免疫耐受机制问题的方法前，现有的疫苗科学
研究思维、科学研究方法，不能研制出可能会有效预防HIV感染人类 的HIV疫苗，是客观存在的必然科学现实。是被HIV科学界疏漏的， 极重要的科学研究"盲区"。因此，在没有揭示HIV感染通过gpl20与 人CD4+细胞特异受体特异结合，触发人体免疫耐受机制，寻找到能够 解决它触发免疫耐受机制问题的方法前，没有科学研究迹象表明HIV 疫苗可能会有效预防HIV感染人类。
发明者认为HIV感染人体，通过包膜蛋白gp120——人CD4受体 的异种特异配体抗原，与人CD4+细胞特异受体特异结合，触发HIV感 染者人体免疫耐受机制，导致感染机体免疫系统针对HIV感染体液免 疫应答反应延迟，不能首先产生针对gpl20的保护性中和抗体、抑制 gpl20与CD4+细胞特异受体特异结合触发的免疫耐受机制；使HIV可以 在人体免疫应答产生针对gpl20的保护性中和抗体之前，还没有被细 胞免疫CTL有效抑制时、过度复制达到病毒血症峰值，进一步触发细 胞免疫耐受机制-细胞免疫损伤机制;诱导抑制性T淋巴细胞，诱导"感 染性免疫耐受"，由HIV过度复制表达所编码的超抗原，能够与某些 特定的T淋巴细胞受体Ve克隆反应，导致某些特定的T淋巴细胞受体 Ve克隆损伤、渐至枯竭，从而使T细胞Ve库不可被再生恢复；因而确 实存在HIV感染者免疫系统损伤的阈值，若超过该阈值，HIV感染者的 免疫功能便不可被恢复重建。因而发明者认为HIV感染者急性期达到 病毒血症峰值期，可能是使T淋巴细胞受体Ve克隆损伤、转向渐至枯 竭不可被重建损伤，至无症状期达到免疫系统损伤不可被重建的阈值。 因而发明者认为在HIV感染者急性期、至达到免疫系统损伤不可被 重建的阈值之前，可能会存在一个可以被抗HIV药有效根治、能够重
建HIV感染者受损免疫系统的，很暂短的抗HIV药有效根治早期HIV 感染者的"窗口期"。是被HIV科学研究疏漏的，极重要的科学研究 "盲区"。
"HIV-Erw基因DNA变构重组包膜蛋白抗原免疫应答抗HIV实验" 方法，能够揭示上述被HIV科学研究疏漏的，极重要的科学研究"盲 区"；寻找到能够解决HIV包膜蛋白gpl20触发人体免疫耐受机制的方 法，研制不触发人体免疫耐受机制的，HIV-Env基因DNA变构重组包膜 蛋白抗原——抗HIV治疗疫苗——抗HIV预防疫苗，提供足够充分的 直接动物模型实验科学依据、直接临床人体实验科学依据。可行性科 学分析理论、方法依据是HIV相关生物学科不需要科学论证的基本 科学常识，与相关实用科学技术；不存在不可实施的现代生物科学的， 应用科学理论疑点、应用科学技术难点。
将可以在HIV科学研究理论、科学认识思维、方法论、方法方面
取得科学突破。
权利要求
1. 一种HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原免疫应答抗HIV实验与方法，其特征在于应用HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原(1)免疫接种实验动物(2)、采血检测免疫实验动物(2)针对HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原(1)的血清(3)抗体(4)的滴度(5)。
2. —种HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原免疫应答抗HIV 实验与方法，其特征在于应用HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗 原(1)免疫接种实验动物(2)，采血检测免疫实验动物(2)针对HIV-Env 基因認A变构重组包膜蛋白抗原(1)的血清(3)抗体(4)的滴度(5)， 应用免疫实验动物(2)的血清(3)培养液(6)感染CD4+细胞的HIV-I毒株(7)、体外培养CD4+细胞(8)，检测免疫实验动物(2)的血清(3) 抗体(4)抑制HIV-I毒株(7)感染培养CD4+细胞(8)的能力。
3. 根据权利要求l、 2中所述的HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋 白抗原免疫应答抗HIV实验与方法，其特征在于实验动物(2)是小鼠(9)0
4. 根据权利要求1、 2中所述的HIV-Erw基因DNA变构重组包膜蛋 白抗原免疫应答抗HIV实验与方法，其特征在于实验动物(2)是非人 类的灵长类动物(10)。
5. 根据权利要求l、 2中所述的HIV-Erw基因DNA变构重组包膜蛋 白抗原免疫应答抗HIV实验与方法，其特征在于实验动物(2)是临床 试验人体(11)。
6. 根据权利要求1至5中所述的HIV-Erw基因DNA变构重组包膜蛋 白抗原免疫应答抗HIV实验与方法，其特征在于HIV-Erw基因DNA变构 重组包膜蛋白抗原(1)是HIV-I-Env基因DNA变构重组包膜蛋白gpl20 抗原(12)。
7. 根据权利要求1至5中所述的HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋 白抗原免疫应答抗HIV实验与方法，其特征在于HIV-Env基因DNA变构 重组包膜蛋白抗原(1)是HIV- I -Env基因DNA变构重组包膜蛋白gpl60 抗原(13)。
8. 根据权利要求2至7中所述的HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋 白抗原免疫应答抗HIV实验与方法，其特征在于培养CD4+细胞(8)是 传代人CD4+细胞系(14)。
9. 根据权利要求2至7中所述的HIV-Erw基因DNA变构重组包膜蛋 白抗原免疫应答抗HIV实验与方法，其特征在于培养CD4+细胞(8)是 人PBMC细胞(15)。
10. 根据权利要求2至9中所述的HIV-Env基因DNA变构重组包膜 蛋白抗原免疫应答抗HIV实验与方法，其特征在于感染CD4+细胞的HIV-I毒株(7)是实验室HIV-I毒株(16)。
11. 根据权利要求2至9中所述的HIV-Env基因DNA变构重组包膜 蛋白抗原免疫应答抗HIV实验与方法，其特征在于感染CD4+细胞的HIV-I毒株(7)是取自HIV-I感染者血液成分(17)的HIV-I毒株(7)。
12. 根据权利要求1中所述的HIV-Erw基因DNA变构重组包膜蛋白 抗原免疫应答抗HIV实验与方法，其特征在于HIV-Erw基因DNA变构重组包膜蛋白抗原(1)是模拟实验应用的异种动物的单克隆抗体(18)。
全文摘要
本发明为HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原免疫应答抗HIV实验与方法。它涉及生命科学领域、及医药领域。证实HIV包膜蛋白gp120、gp160抗原疫苗临床人体试验，不能证实可以预防HIV感染人类，最重要的因素是HIV包膜蛋白gp120、gp160是人CD4受体的异种特异配体，与人CD4⁺细胞特异受体特异结合，触发人体免疫耐受机制，不能激发有效根除HIV的免疫应答机制。寻找解决触发人体免疫耐受机制的方法，研制不触发人体免疫耐受机制的，HIV-Env基因DNA变构重组包膜蛋白抗原抗HIV治疗疫苗、抗HIV预防疫苗，提供足够充分的直接动物模型实验科学依据、直接临床人体实验科学依据。
文档编号G01N33/53GK101210919SQ20061017047
公开日2008年7月2日 申请日期2006年12月30日 优先权日2006年12月30日
发明者叶新新 申请人:叶新新