Mhc寡聚体及其制备方法

专利名称：Mhc寡聚体及其制备方法
MHC寡聚体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及MHC寡聚体，其中单个的功能性MHC复合物单体们 通过其结合于所述复合物的肽结合沟中的肽发生寡聚化，本发明还涉及 制备这种MHC寡聚体的方法及各种使用所述MHC寡聚体的方法。
背景技术：
存在于组织的细胞表面上的主要相容性复合物(MHC)分子在通过与 T细胞表面上的T细胞受体(TCR)的相互作用将短的线性肽形式的细胞 抗原呈递给T细胞方面起到了重要作用。MHC分子是由a和P链、以及 结合于当这些链正确折叠时所述链所形成的沟的肽组成。
已经知道分离或重组形式的MHC肽分子可以用于依据T细胞所识 别的特异性肽抗原来检测、分离和加工处理这些T细胞。也已经了解到 MHC分子和跨细胞表面的TCR之间的相互作用在本质上都是多聚体的 相互作用，且单个MHC分子和给定TCR的亲和力通常是相当低的。
因此，尽可能开发出多聚体形式的具有增加的功能亲和力的分离或 重组的MHC肽分子，以便使得这些分子在上面所述的应用中是更有用 的。
欧洲专利申请EP 812 331描述了用于依据T细胞抗原受体特异性标 记、检测和分离哺乳动物T细胞的多聚体的结合复合物，所述复合物具 有结构式(ot-(3-P)n，其中(a-P-P)是MHC肽分子，n2 2， a包含I类MHC 或II类MHC分子的a链，P包含MHC蛋白的p链，以及P是基本上同质 的肽抗原。通过将MHC分子的a或P链中的其中一条链的C末端生物素 化并将MHC单体与四价的链霉抗生物素/抗生物素蛋白相结合使得 MHC肽分子发生多聚化，或者通过提供其中a或p链中的其中一条链的
c末端被修饰成包含被作为多聚化实体的相应抗体所识别的表位的 MHC分子的嵌合蛋白使得MHC肽分子发生多聚化。该文献还披露了 MHC寡聚体用于依据T细胞的TCR特异性来检测、标记和分离特异性 T细胞的用途。
WO 93/10220披露了嵌合MHC分子，其包含MHC的可溶性部分， 这可以是与免疫球蛋白恒定区融合的I型或II类MHC。分子的MHC部 分包含互补的a和/或p链以及结合于MHC分子的相应的结合沟的肽。因 为存在二聚体的免疫球蛋白构架，这些嵌合MHC-Ig分子可以自我组装 成二聚体结构。
欧洲专利申请EP 665 289披露了特异肽、结合这些肽的MHC分 子、以及通过使具有结合于其内的特异肽的相应的MHC分子发生交联 而获得的寡聚体。通过使用交联剂或者通过提供包含被免疫球蛋白例如 IgG或IgM识别的表位的MHC嵌合蛋白可以实现寡聚化。MHC分子可 以包含标记，并被用于依据T细胞的特异性受体结合来标记、检测和分 离T细胞，并最终可以应用于人类治疗。
在另一个实施方式中，EP 665 289描述了寡聚体的MHC复合物， 其通过使用寡聚体形式的MHC结合肽发生寡聚化。通过肽上面的化学 修饰可以连接寡聚体肽，或者寡聚体肽可能己经形成线性的寡聚体，即 一个肽链具有多个MHC结合部分。
US 2002/0058787披露了肽寡聚体，其包含至少两个经柔性分子接 头连接的MHC结合肽。MHC结合肽可以是I类MHC结合肽或II类 MHC结合肽。也披露了用于生产这种寡聚体的定向克隆方法。所阐述 的寡聚体例如可以被用于特异性激活或抑制CD4+或CD8+ T细胞的活 性的方法。这种方法提供了用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、同种异体 移植物排斥和过敏反应的治疗手段。但是这些肽寡聚体并不是非常适合 于形成分离的MHC肽多聚体，因为通常必须在存在摩尔过量的肽的条 件下孵育可溶性MHC复合物或其链。这会造成复合物的非常不完全的
寡聚化以及且所形成的复合物中的MHC结合肽的多个节段没有与MHC 肽复合物结合的情况，这反过来会造成这些复合物的特异性减低以及更 高的背景结合力。
在构建MHC多聚体时，首先需要构建出MHC肽单体，然后通过 将它们附着到多价实体(例如如US5，635，363所述)或者彼此附着将这些 单体多聚化。但是US 5,635,363所述的方法需要MHC肽复合物的a或p 链具有用于单体与多价实体特异性附着的表位或位点。事实上，提供这 种特异性附着位点的便利方法还很少。
最简单的方法可能是提供MHC分子的C末端上的抗体结合表位， 然后通过特异于表位的一个或多个抗体将分子多聚化。这种技术的缺点 是单体的抗体表位相互作用通常不像要求的那样强烈，且如果多聚化是 通过两步方法实现的，例如首先通过结合表位特异性抗体，其次是通过 所形成的MHC抗体复合物的同种型特异性抗体，则所形成的分子可能 很大。
对通过重组蛋白表达生成的多肽的任一化学位点特异性修饰都是困 难的，因为绝大多数已知的靶向结合方法都特异于一或多种氮基酸。因 此， 一些氨基酸常常同时被修饰，包括在单体复合物形成之后结合于 MHC分子的抗原肽的那些氨基酸。这对复合物与其互补的T细胞受体 成功结合的能力具有无法控制的影响。对于任何随机的交联过程来说更 是如此。
作为另一种选择方案，已经推荐利用生物素-链霉抗生物素系统将 MHC复合物寡聚化(见例如US 5,635,363)。这个方法要求在接近所述 MHC的其中一个羧基末端上对MHC进行酶性生物素化。大约14个氨 基酸的酶识别肽序列与一个MHC肽链的C末端融合，然后容许复合物 通过应用能够识别这个位点的生物素化酶发生生物素化。生物素化因此 包括大量的操作步骤，包括多轮蛋白纯化、和造成活性MHC复合物大 量丢失的酶性生物素化反应。此外，对单体MHC亚基的生物素化效率
以及最终多聚体产物的质量的控制都是困难的。例如，在合成包含同质
的肽的特异性MHC复合物且合成产率非常低的情况下，生物素化反应 中的蛋白丢失以及低于100%的生物素化效率可以使得最终产物的产率 要低于可接受的水平。
这个方法学也将生物素化复合物的多聚化方法局限于所述复合物与 抗生物素蛋白家族蛋白或这种蛋白的交联变体的结合，所述抗生物素蛋 白家族蛋白例如是链霉抗生物素，其使得所述复合物发生四聚体化。但 是，对于交联的抗生物素蛋白家族蛋白变体而言，难以准确地控制复合 物的效价。对于不想要四聚体的或不一致效价的多聚体或者不想使用链 霉抗生物素或链霉抗生物素相关分子的情况，这个方法也有严重的局限 性。
本发明的目的是通过提供容许发生任何所需程度的寡聚化的MHC
寡聚体实现对已有技术的改进。本发明的另一个目的是提供寡聚体，所 述寡聚体可以合适的产率和优越的纯度进行制备。

发明内容
为了克服上面提及的和其他的已有技术的缺点，以及为了实现上面 的目的，本发明的第一个方面因此提供了 MHC寡聚体，其包含至少两 个具有肽结合沟的功能性MHC复合物，每个MHC复合物都具有结合 于所述MHC复合物的肽结合沟中的肽，其中每个肽都具有容许所述功 能性MHC复合物通过一核心结构发生高度特异性寡聚化的修饰。
优选地，MHC寡聚体基本上不含未与MHC肽复合物结合的MHC 结合肽的节段。
优选地，MHC寡聚体所含的MHC肽复合物中的所述肽的MHC结 合部分的氨基酸侧链和/或MHC a或(3链的氨基酸侧链在寡聚化的过程中 基本上都没有被修饰。
在第一个具体实施方式
中，本发明涉及MHC寡聚体，其包含至少 两个具有肽结合沟的功能性MHC复合物，每个MHC复合物都具有结 合于所述MHC复合物的肽结合沟的肽，在所述包含肽的功能性单体 MHC复合物发生组装后，MHC复合物在其肽位置发生寡聚化。
在第二个具体实施方式
中，发明涉及MHC寡聚体，其包含至少两 个具有肽结合沟的功能性MHC复合物，每个MHC复合物都具有结合 于所述MHC复合物的肽结合沟的肽，其中每个肽都包含选自由特异性 附着位点(specific attachment site)禾卩寡聚化结构域(oligomerisation domain)组成的组中的修饰，
其中通过以下方式实现功能性MHC复合物的寡聚化
(i) 每个肽在每个肽上所提供的或附着于其的特异性附着位点与多价 实体结合，或者
(ii) 所述的肽通过每个肽上所提供的或附着于其的寡聚化结构域进 行排列，
其中寡聚体中的MHC复合物与多价实体或肽排列所提供的核心结 构相连接。
在第二个方面，本发明提供药物组合物或诊断组合物，其包含上面 所定义的MHC寡聚体，任选地与药学可接受载体组合，每个肽都具有 容许发生寡聚化的修饰，所述修饰选自由附着位点或寡聚化结构域组成 的组。
在第三个方面，本发明提供了一些依据T细胞抗原受体能够结合功 能性MHC复合物的特异性来标记和/或检测和/或分离哺乳动物T细胞的 方法。
在第四个方面，本发明提供了形成MHC寡聚体的方法，所述MHC 寡聚体包含至少两个具有肽结合沟的功能性MHC复合物，每个MHC 复合物都具有结合于所述MHC复合物的肽结合沟的肽，其中每个肽都
具有容许所述功能性MHC复合物通过一核心结构发生高度特异性寡聚
化的修饰，所述方法包括步骤
(i) 提供一或多种能够结合于每个功能性MHC复合物的肽沟的肽，
所述肽通过以下方式被修饰
(a) 提供特异性附着位点，或
(b) 提供寡聚化结构域；
(ii) 提供包含(i)的肽的单体功能性MHC肽复合物；和
(iii) 通过以下方式使功能性MHC复合物发生寡聚化
(a) 提供多价实体且所述单体功能性MHC肽复合物在每个肽所 具有的特异性附着位点与多价实体结合，或
(b) 所述的肽通过每个肽上所提供的或附着于其的寡聚化结构域 进行排列。
优选地，根据本发明的第四个方面的方法形成的MHC寡聚体是本 发明的其他适用方面和/或它们的相应实施方式中之一的MHC寡聚体和/ 或如在此所述的MHC寡聚体。


图1显示了单体的II类MHC肽复合物，其包含适合于随后发生多 聚化的本发明的修饰的肽。
图2显示了单体的I类MHC肽复合物，其包含适合于随后发生多 聚化的本发明的修饰的肽。
图3显示了适合于根据本发明使得MHC复合物单体在其结合肽处 发生多聚化的分支肽；和
图4显示了适合于根据本发明使得MHC复合物单体在其结合肽处 发生多聚化的环状寡核苷酸。
图5显示了在没有独立的多价实体的情况下能够形成多聚体MHC 复合物的修饰的肽。
发明详述
本发明的MHC寡聚体通过MHC结合肽发生寡聚化，在所述包含 肽的功能性单体MHC复合物通过所述肽上所具有的修饰发生组装后， 所述MHC肽复合物以高度特异方式发生寡聚化。为了形成寡聚化，每 个单体MHC肽复合物所含的肽通过所述肽以高度特异方式与核心结构 发生寡聚化。为此，肽与多价实体相附着或者肽进行自我组装或寡聚 化，据此生成了所形成的寡聚体的核心结构。
术语"核心结构"在此打算表示任何容许同时结合所述肽和MHC 单体的实体。也可通过独立的多聚体实体提供核心结构，肽与所述实体 相附着。或者，肽本身可以通过寡聚化生成这样的核心结构。这包括肽 寡聚化结构域，MHC结合部分结合并悬挂于此。换句话说，肽的修饰 容许肽进行自我组装或排列，据此生成能同时所有肽可与之结合的新的 核心结构。
术语"多聚化"或"寡聚化"在此表示生成至少一种在所需时间内 稳定的包含至少两个功能性MHC单体的复合物的现象。两个术语是可 以相互替换的。
根据所选的多聚化的类型，本发明的MHC寡聚体可以具有很好的 可控的预定效价以及非常高的纯度，因为单个的单体MHC肽复合物可 以被分别地纯化和组装，以及之后发生多聚化。另外，在一些实施方式 中，本发明所具有的优点是利用公知的合成方法可以合成单体MHC肽 复合物，如果需要还可以对其进行修饰。在单体合成之后就可以进行多 聚化，不需要同时对单体进行进一步的修饰，因此在这个阶段避免了额 外的蛋白丢失。另外，只需要对结合于MHC肽结合沟的小肽进行修饰 以用于随后发生多聚化的目的。但是，通过使用例如固相技术可以便利 地完成修饰，这为引入定点修饰提供了极大的灵活性。因此，本发明所形成的MHC寡聚体可以被设计成具有有利的立体 构象，因为它们可以被容易地定位为平面构型，其中复合物中所有的 MHC肽结合面都面向于抗原特异性T细胞表面上的T细胞受体。也可 以用精确的和受很好控制的化学计量法制备出这些MHC寡聚体。另 外，所形成的寡聚体基本上不含未与MHC分子结合的肽MHC-结合部 分。
在本发明中，首先形成功能性单体MHC复合物。它们可以是通过 来自包涵体材料的相关的MHC ot和(3链在存在相关的修饰肽时发生重折 叠、或者是通过优选地在存在相关的修饰肽时在真核表达系统表达出天 然的单体MHC肽复合物而形成的。在两种情况中，与这种相关的修饰 肽的肽交换也可以发生于重折叠之后。
在己经形成单体MHC肽复合物之后，通过部分地因所述肽提供的 修饰而得以进行合适的反应化学或机制使得MHC复合物发生寡聚化。 通常在不会破坏或更改单体MHC肽复合物的结合性能的生理缓冲液条 件下进行寡聚化。本发明因此也提供了高产率的方法，其保留了寡聚化 的MHC复合物单体功能性。
为了清楚起见，在此对单体MHC肽复合物的引用不排除这种单体 复合物在其肽发生进一步的寡聚化之前已经被预先多聚化到一定程度。 例如，在被寡聚化成更高效价的MHC肽寡聚体之前，可以以MHC-Ig 融合二聚体的形式提供单体MHC肽复合物，例如WO9310220所述的那 样。因此，单体MHC肽复合物在此只表示在所述肽发生进一步的寡聚 化之前首先要形成包含相关肽的功能性单体亚基的事实。但是，优选 地，通过形成第一种情况中的真正的单体MHC肽复合物生成本发明的 寡聚体的MHC复合物。
在第一个方面，本发明因此提供了 MHC寡聚体，其包含至少两个 具有肽结合沟的功能性MHC复合物，每个MHC复合物都含有结合于 所述MHC复合物的肽结合沟内的肽，每个肽都具有容许发生高度特异
性寡聚化的修饰。修饰可以优选地选自由附着位点或寡聚化结构域组成
的组。根据所选的修饰，功能性MHC复合物可以通过以下方式实现寡
聚化(i)每个肽在其所提供的或与之相连的特异性结合位点与多价实体 结合；或(ii)所述的肽通过每个肽上所提供的或附着于其的寡聚化结构 域进行排列。在各种情况中，寡聚体中的MHC复合物与多价实体或肽 排列所提供的核心结构相连接。
术语"高度特异性"寡聚化在此表示形成寡聚体(通过附着或排列)
的特异性和/或选择性优选地高于10倍，以及更优选地高于100倍，最 优选地高于1000倍，优选地是在生理条件下、以避免在寡聚化反应中 对单体MHC肽复合物的a或j3链的氨基酸或MHC结合肽的MHC结合部 分的氨基酸进行任何修饰的预定方式形成。
为了图解说明的目的，图1显示了相应的在其沟内具有抗原肽的单 体II类MHC复合物。该图分别显示了 MHCa和p链的al、 a2和(31、 P2 区。相应多肽链的氨基末端和羧基末端分别被标记为N和C。用S-S表 示二硫键的位置。显示出MHC a链具有一个标签区(E)。在肽(P)的一个 末端用接头(未显示)以及该接头末端的修饰(H)合成了肽(P)的抗原或 MHC结合部分，所述修饰的形式为附着位点或寡聚化结构域。
对于II类MHC结合肽而言，已知结合肽可以超出MHC结合沟的 范围，可以在肽的N或C末端或其邻近部位对其进行修饰。
与图1相似，图2显示了具有结合于其沟内的修饰抗原肽的单体I 类MHC复合物(用图1中的相应命名标记图2)。对于I类MHC分子而 言，特异性附着位点或寡聚化结构域形式的修饰(H)优选地位于肽的C 末端或其邻近部位，因为在该部位包含接头的MHC结合肽比N末端的 结合肽具有更强的悬挂MHC结合沟的柔性。
在一个实施方式中，通过肽与多价实体的附着发生寡聚化。这种附 着可以通过多价实体提供的互补的识别位点识别肽提供的或与之相连的 特异性附着位点来实现。识别位点将容许分别在特异性附着位点和互补
的识别位点发生肽与多价实体的共价的或非共价的结合。多价实体的效 价取决于多价实体所提供的以及结合所能接近的互补的识别位点的数目 以及它们的单个效价。
如果附着是非共价的，就从特异性结合对中选出特异性附着位点和 识别位点。具有所必需的特异性的合适的结合对在本领域是已知的。这 些结合对的非限制性实例是半抗原/抗体、表位/抗体、配体/受体、底物 或底物类似物/酶、辅因子或辅因子类似物/酶、核酸/互补核酸、糖/凝集 素、生物素/抗生物素蛋白家族蛋白例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素、
neutravidin 、 Streptag /Streptactin 。
例如对于生物素/链霉抗生物素结合对而言，可以通过便利的化学合 成将生物素引入到MHC结合肽的预定的氨基酸位点上，消除了麻烦的 酶的生物素化的需要。然后通过链霉抗生物素的寡聚化生成四聚体的 MHC复合物。
或者，可以通过肽与多价实体的共价结合实现肽与多价实体的附 着。在这种情况中，附着位点和识别位点是优选地能够在生理条件下形 成共价键或彼此偶联的互补部分。特殊的偶联方法包括但不限于以下类 型的共价键(a)肟键、(b)腙键、(c)噻唑烷键、(d)噁唑烷键、(e)硫醚 键、(f)二硫键、和(g)肽键。用本领域已知的一些化学方法可以形成这些 类型的键。
在一个优选的实施方式中，能够形成共价键或偶联的部分可以有(i) 天然氨基酸侧链和域(ii)氨基酸羧基或氨基末端基团和(iii)(i)和(ii)的组合 等不同。
在一个更优选的实施方式中，采用了其中任何一种最近开发出的利 用巯基化学或碳酰化学的特异的化学选择性连接化学。更多的细节应当 参照Weng C. Chan禾口 Peter D. White主编的"Fmoc solid phase peptide synthesis, A Practical Approach" (Oxford University Press)(2000)中J,R Tam 和Y.A. Lu编写的第ll章，在此通过引用将其并入本申请。可以应用于
本发明的商品化可获得的特异的交联工具是例如从EMD Biosciences, Inc., Darmstadt, Germany获得的HydraLinK⑧(商标名)。
这些化学选择性连接特征性地(i)使用了未受保护的肽片段和(ii)在水 性条件下进行反应。为了实现这些化学反应，在它们各自的合成过程 中，将由亲核剂和亲电子剂组成的反应对放置于P肽和多价实体上。亲 核剂通常是弱碱，其具有比天然氨基酸的a或s氨基明显更低的pKa，或 者其亲核性明显强于这些a氨基，使得在pH值近似为7的水性缓冲溶液 中发生的连接是选择性连接。当将这些相互反应的基团与作为唯一亲核 剂的弱碱都一起放在水溶液中与亲电子剂发生反应时，可以实现化学选 择性。因此，对所涉及的肽的其他功能基团的保护变成是不必要的。
一般优选地使用化学选择性连接化学，使得MHC结合肽的特异性 附着位点和多价实体的互补的识别位点作为互补部分发生反应，可以在 环境条件下进行彼此之间的反应，使得没有一个天然存在的氨基酸的氨 基酸侧链在这个反应中会被修饰，以及基本上不会破坏天然MHC肽复 合物的功能完整性。
在一个优选的实施方式中，特异性结合位点或互补识别位点包含醛
基，可以如Tam和Lu (见上)所述的那样将其引入到多肽骨架。在更优
选的实施方式中，特异性附着位点或互补识别位点包含与醛基相互反应
形成(a)肟键、(b)腙键、(c)噻唑烷键、(d)噁哇烷键、(e)硫醚键的基团。
在最优选的实施方式中，肽(P)所提供的特异性附着位点包含醛基。
形成上面的类型(a)到(d)的键的反应化学的实例如下
(a) 月亏键<formula>formula see original document page 17</formula>O
(b) 腙键 <formula>formula see original document page 17</formula>
<formula>formula see original document page 18</formula>
(c)噻唑烷键 <formula>formula see original document page 18</formula>(d)噁唑垸键 Ri—+ H2N」
其中R,是(a)未受保护的肽(P)或(b)多价实体中的任意一个，112是 相应的另一个。
在各种情况中，多价实体都可以被修饰成掺入可控数目拷贝的识别 位点。互补结合伴侣系统将具有高的特异性和选择性。具体地，识别位 点与附着位点的结合将使得在不会降低单体MHC肽复合物的稳定性和 活性的条件下发生所述结合，这意味着通常要在水性条件和近中性pH 值下进行所述结合。
也优选地是，选出两个位点使得在寡聚化的过程中不会修饰肽P的 MHC结合部位或MHC ot或(3链的任何残基。
识别位点和附着位点之间的共价偶联是优选的，以便使得寡聚体的 MHC复合物的稳定性最大化。为了开发这些共价偶联化学，肽的附着 位点提供了其中一个必需的反应部分，而多价实体的识别位点提供了另 一个必需的反应部分。整合这种反应部分的简单方法是在肽合成期间或 之后用如Tam和Lu (见上)所描述的方案将合适的修饰整合到多价实体 和/或肽的氨基或羧基末端或邻近部位。
化学选择性的非酰胺连接对于偶联是优选的，因为它是位点特异 的，以及在水性条件、pH值为7或非常接近于7的条件下进行反应，这 不会干扰天然MHC肽复合物的结构。
在一个优选的实施方式中，附着位点和识别位点分别是2-肼吡啶基
和苯甲醛基，它们可以在pH4.7时发生最佳反应，形成二芳香腙。也可 以在pH值最大到7.3的条件下进行这个反应，这保证了 MHC肽单体的 稳定性，不过在较高的pH值下这个反应进行得更为缓慢。为了兼顾结 合反应动力学的速度和不会破坏MHC分子的缀合条件，6.5到6.8左右 的缓冲pH值是最佳的pH值。
在另一个优选的实施方式中，用固相合成技术将附着位点和识别位 点引入到至少一个肽(P)和多价实体中。 一些用于引入合适基团的方法是 如Tam和Lu (见上)所述的方法。
如何将上面的化学转变成其中多价实体不是多肽而是寡核苷酸的情 况对于本领域熟练的实践人员是显而易见的。
在进行本发明的寡聚化的第一种和第二种方法中所用的多价实体可 以是任一多价实体，只要它们不会过分地干扰T细胞受体与MHC复合 物单体的结合即可。多价实体的效价即识别位点或反应部分的数目以及
它们的间距将决定寡聚化的程度。例如，四价实体例如链霉抗生物素将 形成四聚体。但是，明显更高的效价是可能的。实体的效价优选地是在 2到20的范围内，更优选地是4到10。
多价实体优选地是天然聚合物或其衍生物例如蛋白、分支多肽(树状 聚合物)、多聚体蛋白、核酸、多糖例如葡聚糖、淀粉、纤维素、透明质 酸、甲壳质、或海藻酸或这些多糖的衍生物、寡核苷酸、环状寡核苷 酸；合成聚合物例如聚丙二醇、聚乙二醇(PEG);磷脂膜例如小泡或脂 质体、和无机颗粒例如聚苯乙烯或丙烯酸珠或磁珠。识别位点可以由多 价实体例如其骨架提供或者可以与其附着。
在一个优选的实施方式中，多价实体是天然聚合物(例如蛋白或多聚 体蛋白例如链霉抗生物素、抗生物素蛋白、免疫球蛋白、透明质酸、纤 维素)或合成聚合物(例如聚丙烯酸、聚苯乙烯、聚乳酸)，而识别位点由 多价实体的骨架提供或者与之相附着。
在更优选的实施方式中，多价实体是分支多肽(所谓的树状聚合
物)。可以根据Tam和Lu (见上)所述的方案制备出这些树状聚合物。一 些用于合成分支多肽的其他方法对于本领域技术人员是公知的。
优选地，分支多肽在其两个或多个分支的预定位点上掺入特异性识 别位点或特异性结合对的成员。肽的每个分支都可以具有所需的长度。 每个分支的长度优选地小于24个氨基酸。通过在肽合成期间用已知的 方法在Lys残基上使肽分支可以实现肽的分支化。通过这种方式，肽在 第一个赖氨酸残基上被分支成两个分支，之后在更多的赖氨酸残基上被 进一步分支形成四价实体。通过包括更多的或更少的分支步骤可以实现 其他的效价例如八聚体。通过仅仅部分地分支合成肽也可以得到奇数效 价。
作为多价实体的树状聚合物的化学合成将容许非常精确地控制寡聚 体的性质和化学计量。这反过来造成了在寡聚体的各种用途例如T细胞 标记或检测中的更高的精确度。
图3显示了适用于使得本发明的MHC复合物单体在其肽位置发生 多聚化的分支肽或树状聚合物。该图举例说明了多肽骨架，其分支两 次，生成了四聚体结构。合成了在其每个末端分支上都掺入互补识别位 点(H')的树状聚合物，所述识别位点可以在不影响MHC稳定性的条件 下与特异性附着位点(H)结合，据此生成四价实体。该图还显示了荧光 标记部分(F),其被整合于树状聚合物的非分支部分。
在另一个实施方式中，多价实体是寡核苷酸或环状寡核苷酸。寡核 苷酸的长度通常是50到150个核苷酸，但是也可以短到3个核苷酸。多 价实体优选地是环状寡核苷酸，甚至更优选地其周长小于150个碱基。 图4显示了这个实施方式，其显示了这种环状寡核苷酸的骨架。与图3 相类似，在其合成期间或之后，寡核苷酸在此已经被修饰成包含6个不 同核苷酸位置上的互补识别位点(H，)，因此形成了六价实体。另外，环 状寡核苷酸也包括两个荧光标记的部分(F)。
根据第二种寡聚化方案，MHC寡聚体通过肽在其寡聚化结构域的 排列发生寡聚化。排列最广义地表示(大)分子之间的任何自我组织的结 合现象，这至少形成了两个或多个这种(大)分子的暂时连接。这种类型 排列的实例是核酸杂交、两种或多种蛋白(或蛋白区)例如免疫球蛋白Fc 区、巻曲螺旋区的自我组装、角蛋白纤维和类似物的自我组装以及化学 部分的共价结合。寡聚化结构域事实上可以形成肽骨架的一部分或者与 之相附着。它们在性质上可以是肽或核酸。因此，在第一个实施方式 中，每个肽都包含肽寡聚化结构域，其优选地与肽骨架融合。在另一个 实施方式中，每个肽都与寡聚化结构域相附着。在这种情况中，寡聚化 结构域可以选自由肽寡聚化结构域和核酸组成的组。
肽寡聚化结构域可以选自由抗体恒定区、酶单体和形成寡聚体的巻 曲螺旋蛋白的寡聚化结构域组成的组。优选地，这是形成寡聚体的巻曲 螺旋蛋白的寡聚化结构域，所述蛋白选自由胶原蛋白家族、C型凝集素 和血小板反应蛋白家族蛋白组成的组。
形成寡聚体的巻曲螺旋蛋白的实例包括各种类型的胶原、C型凝集 素例如甘露糖结合蛋白(MBP)的三巻曲螺旋区、Clq、肌球蛋白、亮氨 酸拉链例如存在于p53、 GCN4、噬菌体P22Mnt抑制子中的亮氨酸拉 链、和血小板反应蛋白家族蛋白例如COMP。寡聚化结构域优选地源自 软骨寡聚体基质蛋白(COMP)。更优选地，寡聚化结构域是人类的 COMP。
对于巻曲螺旋蛋白而言，本发明的MHC寡聚体所包含的MHC复 合物的数目(m)通常依赖于肽寡聚化结构域所来源的类型， 一般是2个 或更多，优选地m=2到10，最优选地m=3或5。如果被寡聚化的肽的 修饰例如源自COMP的五聚体化区，该数目通常是5，使得该寡聚体是 五聚体(m-5)，而当这些寡聚化结构域源自胶原时，该数目是3(m-3)。
在一个实施方式中，每个肽依次包含两个非重叠的寡聚化结构域。 寡聚体中的第n个肽的第二个寡聚化结构域与寡聚体中的第(n+l)个肽的
第一个寡聚化结构域形成二聚体或排列。然后，寡聚体中的第(n+l)个肽 的第二个寡聚化结构域与寡聚体中的第(n+2)个肽的第一个寡聚化结构域 形成二聚体或排列等等。在这种情况中，最优选地是，寡聚体中的最后
一个肽的第二个寡聚化结构域与寡聚体中的第一个肽的第一个寡聚化结 构域形成二聚体，以便提供环状结构。尽管对于本实施方式而言，理论
上可以使用任何形式的能够发生二聚体化的寡聚化结构域，但是第一个 和第二个寡聚化结构域优选地是核酸，通过它们的杂交发生寡聚化。
待寡聚化的功能性单体MHC复合物常常是可溶性的分离的或重组 的MHC复合物，其可以源自I型或II类MHC复合物，优选地分别是如 图1或图2所示的I类MHC复合物的胞外部分或者II类MHC复合物的 胞外部分。这些复合物中的每个复合物都由a链和P链组成。功能性复合 物还包含结合于相应的由其a和(3链形成的沟的修饰肽。
MHC蛋白可以来自任何脊椎动物物种，例如灵长类物种(特别是 人)、啮齿类动物包括小鼠、大鼠、仓鼠和兔、马、牛、犬、猫等。特别 相关的是人HLA蛋白和小鼠H-2蛋白。HLA蛋白包含II型亚基HLA-DPa、 HLA-DP(3、 HLA曙DQa、 HLA画DQJ3、 HLA-DRa和HLA-DR(3，以 及I型蛋白HLA-A、 HLA-B、 HLA-C、和{32-微球蛋白。小鼠H-2蛋白 亚基包含I型亚基H-2K、 H-2D、 H-2L，和II型亚基I-Aa、 I-AP、 I-Ea 和I-E(3，以及(32-微球蛋白。 一些代表性MHC蛋白的氨基酸序列参照 EP 812 331 。非经典的实例例如HLA-E、 HLA-F、 HLA-G、 Qal、和 CD1也在本发明的范围之内。CD1单体可以在其沟内结合有脂质而非 肽。本发明也适用于其中脂质代替肽被结合的情况，本领域技术人员能 够将上面的寡聚化方案转换到这个情况中。
在一个优选的实施方式中，MHC肽链对应于可溶性形式的正常膜 结合蛋白。对于I型亚基而言，通过缺失天然形式的跨膜区和胞浆区形 成可溶性形式。对于I型蛋白而言，可溶性形式包括a链的al、 oc2和cx3
区区。对于II型蛋白而言，可溶性形式分别包含oc链或l3链的al和cx2或 Pl和P2区区。
包含的跨膜区氨基酸不超过约10个、通常不超过约5个、优选地 不包含跨膜区的氨基酸。缺失可以延伸约10个氨基酸到达oc3区内。优 选地，不缺失a3区的氨基酸。缺失要使得其不会干扰ot3区折叠成功能 性二硫键结构的能力。I型(3链、P2m的天然形式都缺少跨膜区，因此不 必被截短。II型亚基一般都不与I型亚基缀合。
上述缺失同样适用于II型亚基。所述缺失可以延伸约10个氨基酸 到达a2或p2区内。优选地，不缺失a2或p2区的氨基酸。缺失要使得其 不会干扰a2或p2区折叠成功能性二硫键结构的能力。
可以在多肽末端引入少数氨基酸，通常不超过25个氨基酸，更通 常地不超过20个氨基酸。氨基酸的缺失或插入通常是克隆需要的结 果，例如提供便利的限制性位点等的结果，以便解决分子组装过程中可 能的空间问题。另外，基于同样的原因，可以用不同的氨基酸取代一个 或多个氨基酸，通常不取代任一区内的5个以上的氨基酸。
一般而言，因此，除了在此所含的一个或多个蛋白或蛋白链，寡聚 体还包含一个或多个附加区例如一个或多个接头、标签区和纯化区。附 加区例如不仅可以由多价实体或肽提供，还可以存在于MHC的a和/或(3 链中。
出于说明的目的，图1和图2中的复合物是融合多肽，额外具有与 其蛋白链之一融合的蛋白标签(E)，所述标签可以进一步地容许标记、纯 化或附着这些蛋白。标签E可以是表位标签或者经修饰的蛋白序列。多 肽接头可以将这个标签与MHC a或p链的多肽分开。这个接头和其他任 何接头一般都包含不超过25个氨基酸，优选地不超过20个氨基酸。
在所述复合物中任选包含的蛋白标签(E)可以是任何容许标记蛋白的 区域。优选地，标签区包括标记。这个标记本身可以包含于标签区内， 例如被抗体所识别的表位或光可检测或放射性标记。优选地，标记选自
由荧光标记物例如FITC、藻胆蛋白例如R-或B-藻红蛋白、别藻蓝蛋 白、Cy3、 Cy5、 Cy7、发光标记物、放射性标记例如1251或3卞、酶例如 辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶例如虾碱性磷酸酶、表位、凝集素、生物 素或链霉抗生物素。
当标记本身是蛋白时，用作标记的蛋白的多肽链可以与肽融合，形 成嵌合蛋白，优选地在其C末端。例如，该嵌合蛋白可以使用荧光蛋白 例如绿荧光蛋白(GFP)或藻胆蛋白的亚基。GFP嵌合蛋白技术在本领域 是公知的。例如在WO 01/46395中描述了包含源自藻胆蛋白的合适区域 的嵌合蛋白。
或者，可以通过经合适标记的抗体、或抗体片段例如经标记的F(ab) 片段与标签(E)的合适表位结合实现标记。
在本发明的寡聚体中任选包含的纯化区可以是有助于纯化本发明的 蛋白的任何区域，例如通过提供特异性结合表征。适当的序列对于本领 域技术人员是已知的，只要它们不会干扰复合物的功能部分就可以釆 用。优选地，纯化区是六组氨酸序列。
被寡聚化的功能性单体MHC复合物包含结合于它们的肽结合沟内 的肽。该肽至少包含MHC结合部分以及形成或携带附着位点或寡聚化 结构域形式的修饰的独立部分。除了任何接头和修饰之外，对于具有I 类MHC蛋白的复合物而言，MHC结合部分的长度是从约6个到14个 氨基酸，通常是从约8个到ll个氨基酸。具有II类MHC蛋白的复合物 的长度是从约6个到35个氨基酸，通常是从约10个到20个氨基酸。
肽的MHC结合部分可以具有源自多种蛋白的序列。在多种情况 中，都需要使用作为T细胞表位的肽。多种抗原的表位序列在本领域是 已知的。或者，可以通过分离和测序结合于天然MHC蛋白的肽、从靶 序列合成一系列推测的抗原肽、然后测定不同肽的T细胞反应性，或者 通过用这些肽生成一系列MHC肽复合物并定量出T细胞结合力可以经 验地确定出表位序列。肽的制备包括合成肽的合成、鉴定序列以及鉴定
相关的最小抗原序列在本领域都是已知的。在各种情况中，寡聚体的
MHC复合物中所含的肽优选地是基本上均一的，意思是所述肽在它们 的MHC结合部分优选地具有至少80%、更优选地具有至少90%以及最 优选地具有至少95%的相同性。
接头多肽序列通常被插入于肽(P)的MHC结合部分序列和修饰位点 (H)之间。为了其灵活性和可溶性，这种接头可以是例如插入于脯氨酸 或丝氨酸之间的甘氨酸残基重复，(GGPGG)n或(GGSGG)n，其中n的范 围通常是1到6之间。要明白其他的柔性的、具有足够可溶性并且不会 形成显著的二级结构的接头也适用于这个目的。 一般可以使用长度为1 到30个、优选的3到20个和最优选的3到IO个氨基酸的多肽。对于非 肽接头，可以相应地调整它们的长度。非肽接头还可包括PEG或聚环氧 乙垸(PEO)重复。
优选地选择接头的长度，使得寡聚化结构域或附着位点至少要远离 MHC肽复合物与T细胞受体(TCR)和CD4、 CD8或其他辅助受体的结合 部位，这样它就基本上不会干扰相应的MHC肽复合物与TCR的相互作 用。为了实现前述目的，接头长度也要尽可能短，因为这会有助于降低 肽合成的费用。
本发明的MHC寡聚体也可以包含标记。这种标记例如可以选自由 光可检测标记、放射性标记、酶、表位、凝集素或生物素组成的组。上 面已经列出了针对标签区的其他标记。同样可以使用这些标记。如果存 在这样的实体，标记在一个实施方式中优选地是由多价实体或寡聚化结 构域排列形成的结构提供的。在组装寡聚体期间或之后或者甚至在应用 或使用所述寡聚体期间可以整合标记。当多价实体本身是通过化学合成 形成时，可以在多价实体的预定位置上化学地引入标记，其容许标记具 有精确化学计量的寡聚体的MHC复合物。当标记是荧光标记时，这容 许获得具有高度均一的亮度和最大信号噪音比的复合物。本发明也涉及药物组合物或诊断组合物，其包含如上定义的MHC 寡聚体，任选地与药学可接受载体组合。
包含本发明的寡聚体的药物组合物可以用于例如肠外给药即皮下、 肌肉内或静脉内给药。另外，开发出了大量新的药物转运方法。本发明 的药物组合物同样适用于利用这些新方法给药。
用于肠外给药的组合物常常包含溶解于可用载体的寡聚体溶液，优
选地是水性载体。可以使用各种水性载体，例如缓冲水、0.4%盐水、 0.3%甘氨酸等。这些溶液是无菌的， 一般都不含颗粒物质。可以用传统 的、公知的灭菌技术将这些组合物灭菌。组合物可以包含近似生理条件 所需的药学可接受的辅助物，例如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂等、 例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。根据所选的具体给 药模式，这些剂型中的寡聚体浓度可以有着极大的不同，即从小于约 lpg/ml，通常至少约0.1mg/ml至U 10-100mg/ml，主要根据液体体积、粘 度等选择寡聚体浓度。
用于肌肉内注射的常用药物组合物通常被制剂成包含lml无菌的缓 冲水和O.lmg寡聚体蛋白。用于静脉内输注的常用组合物可以被制剂成 包含250ml无菌林格液和10mg寡聚体复合物蛋白。用于制备可肠外给 药的组合物的实际方法对于本领域技术人员是已知的或显而易见的。
本发明的MHC寡聚体可以被冻干储存，并在使用前用合适的载体 重构。这个技术已经显示出是有效的，可以采用常用的冻干和重构技 术。本领域技术人员要明白冻干和重构可以造成不同程度的活性丢失， 需要调整施用水平进行补偿。
本发明也涉及依据T细胞抗原受体的特异性来标记和/或检测哺乳动 物T细胞的方法，方法包括
(i) 组合本发明的MHC寡聚体和包含T细胞的悬浮液或生物学样 品，禾口
(ii) 检测是否存在所述复合物和T细胞的特异性结合。
本发明也涉及依据T细胞抗原受体的特异性来分离哺乳动物T细胞 的方法，方法包括
(i) 组合本发明的MHC寡聚体和包含T细胞的悬浮液或生物学样
品，禾口
(ii) 将与所述复合物结合的T细胞与未结合的细胞分离。 本发明还涉及用于如上所述标记和/或检测和/或分离细胞的方法，
其中依据与MHC分子特异性结合的特殊类型的细胞表面分子来标记、 检测或分离一种非T细胞的淋巴细胞类型。例如，已知人非经典MHC 分子HLA-E可以通过与NK表面受体CD94/NKG2的特异性结合与自然 杀伤(NK)细胞结合(D.S丄Allan W "/., J. Immunol. Meth. 268 (2002) 43-50)。同样，HLA-G和HLA-F显示出能染色CD14+细胞上的ILT2和 ILT4受体，以及HLA-F也显示出能染色CD19+亚群(Allan a/.,见 上)。技术人员能够将上面所述的方法翻译到这种情况。
本发明最后涉及一种生成MHC寡聚体的方法，所述寡聚体包含至 少两个具有肽结合沟的功能性MHC复合物，每个复合物都具有结合于 所述MHC复合物的肽结合沟内的肽，其中每个肽都包含容许发生高度 特异性寡聚化的修饰，所述方法包括步骤
(i) 提供一种或多种能够结合于每个功能性MHC复合物的肽沟的 肽，所述肽可以通过以下方式进行修饰
(a) 提供特异性附着位点，或
(b) 提供寡聚化结构域；
(ii) 提供包含(i)的肽的单体功能性MHC肽复合物，和
(iii) 可以通过以下方式使功能性MHC复合物发生寡聚化 (a)提供多价实体以及所述单体功能性MHC肽复合物在每个肽
上所提供的或附着于其的特异性结合位点与多价实体的结 合，或
(b)所述的肽通过每个肽上所提供的或附着于其的寡聚化结构域
进行排列。
优选地，在存在如步骤(i)所修饰的肽时，通过重折叠MHC a和卩链 提供步骤(ii)中的单体功能性MHC复合物。
例如可以从真核或原核表达系统中获得MHC a和p链，任选地可以 在重折叠之前将其纯化。或者，可以从其他来源中分离出a和p链或折叠 复合物。在需要或者合适的时候，该方法也可以包含重折叠的功能性 MHC复合物的肽交换步骤。通过如上所述的固相合成通常可以提供步 骤(i)中的肽。可以在所述合成期间或之后修饰所述肽。合成期间的修饰 是例如通过向骨架中添加肽区或者整合经修饰(例如硫代-)的氨基酸。合 成后的修饰例如可以是连接核酸寡聚化结构域。
在图5中，经修饰的肽(P)显示出在没有独立的多价实体时能够形成 多聚体MHC肽复合物。抗原肽通常具有10个氨基酸甘氨酸丝氨酸接 头，以便为寡聚体提供足够多的空间。在5个变体P(l)到P(5)中合成了 包含5种不同寡核苷酸的肽。优选地，P(1)到P(5泡含相同的MHC结合 部分。
每个附着的寡核苷酸都具有两个区(1,2')、 (2,3')、 (3，4')、 (4，5')、和 (5,1')，其中每个区与另一个寡核苷酸上的一个且仅仅一个其他区互补。 第5个寡核苷酸具有与第一个寡核苷酸的第一个区1互补的第二个区 1，。每个区对可以具有约为20。C的退火温度。通过已知的寡核苷酸设计 技术将非互补区之间的交叉反应性最小化。每个寡核苷酸上的两个区可 以直接连接或者具有非退火的寡核苷酸接头，以便增加区之间的空间。 接头可以包含合成标记，例如在前所述的标记。可以在一个单一过程中 合成偶联的多肽-寡核苷酸，或者可以分别合成，之后进行偶联，其中通 过如上所述的修饰肽与寡核苷酸的化学选择性连接可以实现肽与寡核苷 酸的连接。用HPLC将5种寡核苷酸/肽产物都纯化到足够高的纯度。
寡核苷酸/肽在被加热到30°C 5分钟后，在20。C退火。然后重新纯 化出寡核苷酸/肽五聚体。然后根据已知的方案，用变性的MHCoc和(3链 重折叠成寡核苷酸/肽五聚体。这将生成具有所形成的不均一效价的异多 聚体，因为MHC分子的重折叠是不完整的，所给定的合理的过量的肽 将主要生成具有经寡核苷酸偶联附着的4个附加肽的MHC肽单体 (MHC-Ps)。然后用凝胶过滤色谱法浓縮并纯化所形成的产物，以便主要 地选择出MHC-P5单体。然后通过将单体加热到30°C 5分钟，消除P5 相互作用，生成MHC-P，单体和游离肽。然后在30°C、 PD10柱 (Amersham Biosciences, Chalfont St. Giles, UK)中快速地纯化出肽。然后 从柱中洗脱出所形成的MHC-P单体。当在纯化产物中存在粗等量摩尔 比的单体P(l)到P(5)肽时，单个的MHC-P单体可以被重新退火形成 MHC五聚体。在第二次凝胶过滤步骤中，纯化去除不正确退火的产 物，使得纯化产物基本上只包含MHC五聚体。
实施例
实施例l:形成掺入流感血凝素A肽HA(306-318): PKYVKQNTLKLAT 的经标记的II类MHC肽八聚体HLA-DRB"OIOI
HA'-肽被合成为HA-(GGGSG)2-K"，其中K"是被修饰包含苯甲醛 的赖氨酸，其纯度>95%。
一般可以如下合成肽P'-K"-P"，其中P'、 P"是两个多肽亚片段。引 入Fmoc-Lys(Mtt)-OH或Fmoc-Lys(ivDde)-OH作为需要被修饰的位置， 其中Fmoc是9-芴甲氧羰基，Mtt是4-甲基三苯甲基，以及ivDde是1-(4,4-二甲基-2，6-二氧环己-1 -亚基)-3-甲丁基。然后用丁氧羰基(Boc)封闭 肽的N末端，使得可以选择性地去除Mtt或ivDde。然后可以用丙酮5-(琥珀酰亚胺基氧羰基)-吡啶-2-基腙(SANH)或琥珀酰亚胺基-4-甲酰基苯 甲酸酯(SFB)修饰暴露的氨基，以便引入2-肼基吡啶基或苯甲醛基。 按照Cameron et al., J. Immunol. Meth. 268: (2002) 51-69所述的方案 从可溶性oc链HLA-DRA1*0101禾叩链HLA-DRB1*0101和HA'肽的包涵 体材料中重折叠出单体的HLA-DRB1*0101 HA'复合物，有所不同的是 每个蛋白链都不需要生物素化的融合标签。按照该相同方案中所述的那 样实现单体复合物的纯化。用Bradford法测定出复合物的蛋白浓度。
合成下面的八价肽(F)MV8。
(F)MV8.1: (KmGGSGGGGSGG)8(K'G)4(K'G)2K'GKFGA
这个肽的分支出现在各个赖氨酸K'处，数字说明了每个阶段的肽的 分支的数目。KF是经异硫氰酸荧光素FITC修饰的赖氨酸残基，以提供 荧光标记物。K"'是经2-hydrazinopyridyl修饰的赖氨酸残基，提供了分 支肽上的8个能与HA'肽上的醛基反应形成稳定的二芳香腙的2-hydrazinopyridyl基团。
将单体HLA-DRB1*0101 HA'与(F)MV8.1按8:1摩尔比混合于PBS (pH 6.8)中，形成FITC标记的HLA-DRB1*0101 HA'八聚体。
用凝胶过滤色谱法在Sephadex S 300柱(Amersham Biosciences, Chalfont St.Giles, UK)上纯化所形成的产物，以主要回收八聚体。
实施例2:形成掺入CMV pp65肽(495-503): NLVPMVATV的标记的I类 MHC肽八聚体HLA-A*0201
合成纯度>95%的肽NLV':NLVPMVATV-(GGGSG)rK"，其中K"如
上所述。
按照Garboci & a/., PNAS 89 (1992), 3429-3433所述的方案从可溶性 a链HLA-A*0201和P2微球蛋白和NLV'肽的包涵体材料中重折叠出单 体的HLA-AW201/NLV'复合物。按照该相同方案中所述的那样实现单体 复合物的纯化。用Bradford法测定出复合物的蛋白浓度。
根据在此前所述的优选方法合成(F)MV8.2， 一种96个碱基的环状 寡核苷酸，其中依照标准的寡核苷酸合成方法，每第12个碱基都被2-
hydrazinopyridyl修饰，且各个位于两个2-hydrazinopyridyl部分之间中心 处的碱基都被修饰成包含(FITC)。选择碱基以便于修饰并使得二级结构 最小化。
将单体HLA-A8180201 NLV'与(F)MV8,2按8:1摩尔比混合于反应缓冲 液(pH 6.8)中，形成FITC标记的HLA-A*0201 NLV'八聚体。
用凝胶过滤色谱法例如在Sephadex S 300柱(Amersham Biosciences, Chalfont St.Giles, UK)上纯化所形成的产物，以主要回收八聚体。
在上面的每个实施例中，都用凝胶过滤色谱法在Sephacryl S-300柱 (Amersham Biosciences, Chalfont St.Giles, UK)上纯化所得产物，以主要 回收八聚体。可以浓縮所纯化的产物，或者直接使用，例如用于流式细 胞术。
要知道多价实体(F)MV8.1或(F)MV8.2可以互换地分别用于I型和II 类MHC复合物的多聚化。
权利要求
1.MHC寡聚体，包含至少两个具有肽结合沟的功能性MHC复合物，每个MHC复合物都具有结合于所述MHC复合物的肽结合沟的肽，其中每个肽都具有容许所述功能性MHC复合物通过一核心结构发生高度特异性寡聚化的修饰。
2. MHC寡聚体，包含至少两个具有肽结合沟的功能性MHC复合 物，每个MHC复合物都具有结合于所述MHC复合物的肽结合沟的 肽，在所述包含肽的功能性单体MHC复合物发生组装后，所述MHC 复合物通过它们的肽发生寡聚化。
3. MHC寡聚体，包含至少两个具有肽结合沟的功能性MHC复合 物，每个MHC复合物都具有结合于所述MHC复合物的肽结合沟的 肽，其中每个肽都包含选自由特异性附着位点和寡聚化结构域组成的组 的修饰，其中功能性MHC复合物通过以下方式发生寡聚化，(i) 每个肽在每个肽上所提供的或附着于其的特异性附着位点与多价 实体结合，或者(ii) 所述的肽通过每个肽上所提供的或附着于其的寡聚化结构域进 行排列，其中寡聚体中的MHC复合物与由多价实体或肽排列所提供的核心 结构相连接。
4. 权利要求3的MHC寡聚体，其中寡聚化通过肽与多价实体的 结合而发生。
5. 权利要求4的MHC寡聚体，其中结合通过多价实体所提供的 识别位点识别所述肽所具有的特异性附着位点而发生。
6. 权利要求3到5中任一项的MHC寡聚体，其中肽包含MHC 结合部分和一携带或形成所述修饰的独立部分。
7. 权利要求6的MHC寡聚体，其中肽还包含其MHC结合部分 和所述独立部分之间的多肽接头，所述接头的长度优选地是3到10个 氨基酸。
8. 权利要求5的MHC寡聚体，其中特异性附着位点和识别位点 选自特异性结合对的成员。
9. 权利要求8的MHC寡聚体，其中特异性结合对选自由半抗原/ 抗体、表位/抗体、配体/受体、底物或底物类似物/酶、辅因子或辅因子 类似物/酶、核酸/互补核酸、糖/凝集素、生物素/抗生物素蛋白家族蛋白 例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素、neutravidin 、和 Streptag⑧/Streptactin⑧组成的组。
10. 权利要求4到7中任一项的MHC寡聚体，其中附着通过肽与 多价实体的共价结合而发生，所述附着位点和识别位点是能够彼此形成 共价键的部分。
11. 权利要求IO的MHC寡聚体，其中所形成的共价键是选自由躬 键、腙键、噻唑烷键、噁唑烷键、硫醚键、二硫键、和肽键组成的组中 的类型。
12. 权利要求4至U 11中任一项的寡聚体，其中多价实体选自由天 然聚合物或其衍生物例如蛋白质、分支多肽(树状聚合物)、多聚体蛋 白、核酸、多糖例如葡聚糖、淀粉、纤维素、透明质酸、甲壳素、或海 藻酸或这些多糖的衍生物、寡核苷酸、环状寡核苷酸；合成聚合物；磷 脂膜例如小泡或脂质体；和无机颗粒组成的组。
13. 权利要求12的MHC寡聚体，其中多价实体是天然的或合成的 聚合物，所述识别位点是由多价实体的骨架提供的或者是与所述多价实 体相连的。
14. 权利要求11的MHC寡聚体，其中多价实体是分支多肽(树状 聚合物)，优选地在其两个或多个分支的预定位点上掺入识别位点。
15. 权利要求14的MHC寡聚体，其中肽的每个分支的长度都小于 24个氨基酸。
16. 权利要求IO的MHC寡聚体，其中多价实体是寡核苷酸或环状 寡核苷酸，环状寡核苷酸的周长优选地小于150个碱基。
17. 权利要求3的MHC寡聚体，其中寡聚化通过肽的排列而发生。
18. 权利要求17的寡聚体，其中每个肽都附着有寡聚化结构域， 所述寡聚化结构域优选地选自由肽寡聚化结构域和核酸组成的组。
19. 权利要求18的MHC寡聚体，其中寡聚化结构域是肽寡聚化结 构域，所述寡聚化结构域选自由抗体恒定区、角蛋白和形成寡聚体的巻 曲螺旋蛋白的寡聚化结构域组成的组。
20. 权利要求18的MHC寡聚体，其中每个肽都依次包含两个非重 叠的寡聚化结构域，其中所述寡聚体中的第n个肽的第二个寡聚化结构 域与所述寡聚体中的第(n+l)个肽的第一个寡聚化结构域发生二聚体化。
21. 权利要求20的MHC寡聚体，其中进一步地，所述寡聚体中的 最后一个肽的第二个寡聚化结构域与所述寡聚体中的第一个肽的第一个 寡聚化结构域发生二聚体化，以提供环状结构。
22. 权利要求20或21的MHC寡聚体，其中第一个和第二个寡聚 化结构域是核酸。
23，前述权利要求中任一项的MHC寡聚体，其中MHC寡聚体基 本上不包含未结合于MHC肽复合物的MHC结合肽区段。
24. 前述权利要求中任一项的MHC寡聚体，其中MHC复合物源 自I类MHC复合物的胞外部分。
25. 前述权利要求中任一项的MHC寡聚体，其中MHC复合物源 自II类MHC复合物的胞外部分。
26. 前述权利要求中任一项的MHC寡聚体，其中所述肽的MHC 结合部分基本上是均一的。
27. 前述权利要求中任一项的MHC寡聚体，其中至少一个单体功 能性MHC复合物是CD1，以及相应的肽是脂质。
28. 前述权利要求中任一项的MHC寡聚体，其中寡聚体所包含的 MHC-肽复合物中的所述肽的MHC结合部分的氨基酸侧链和/或MHC a 或(3链的氨基酸侧链在寡聚化过程中基本上都没有被修饰。
29. 药物或诊断组合物，包含前述权利要求中任一项的MHC寡聚 体，任选地与药学可接受载体组合。
30. 依据T细胞抗原受体的特异性来标记和/或检测哺乳动物T细 胞的方法，方法包括(i) 组合权利要求1到28中任一项的MHC寡聚体和包含T细胞的 悬浮液或生物学样品，和(ii) 检测是否存在所述复合物和T细胞的特异性结合。
31. 依据T细胞抗原受体的特异性来分离哺乳动物T细胞的方法， 方法包括(i) 组合权利要求1到28中任一项的MHC寡聚体和包含T细胞的悬浮液或生物学样品，和(ii) 将结合于所述复合物的T细胞与未结合的细胞分离。
32. 权利要求30或31的方法，其中依据特异结合MHC分子的特 殊类型的细胞表面分子来标记、检测或分离出非T细胞的淋巴细胞类 型。
33. 形成如权利要求1到28中任一项所定义的MHC寡聚体的方 法，所述MHC寡聚体包含至少两个具有肽结合沟的功能性MHC复合 物，每个复合物都具有结合于所述MHC复合物的肽结合沟的肽，其中 每个肽都具有容许功能性MHC复合物通过一核心结构发生高度特异性 寡聚化的修饰，所述方法包括步骤(i)提供一种或多种能够结合于每个功能性MHC复合物的肽沟的 肽，所述肽通过以下方式被修饰 (a) 提供特异性附着位点，或(b) 提供寡聚化结构域；(ii)提供包含在(i)中被修饰的肽的单体功能性MHC肽复合物，禾口 (m)通过以下方式使功能性MHC复合物发生寡聚化(a) 提供多价实体并将所述单体功能性MHC肽复合物在每个 肽上所提供的或附着于其的特异性附着位点与多价实体结合，或(b) 通过每个肽上所提供的或附着于其的寡聚化结构域对所述 的肽进行排列。
34. 权利要求33的方法，其中在存在在步骤(i)中被修饰的肽的情 况下，通过重折叠MHC a和P链来提供步骤(ii)中的单体功能性MHC-肽 复合物。
35. 权利要求33的方法，其中在存在在步骤(i)中被修饰的肽的情 况下，通过被重折叠的功能性MHC复合物的肽交换提供步骤(ii)中的单 体功能性MHC-肽复合物。
全文摘要
本发明公开了MHC寡聚体及其制备方法，所述MHC寡聚体包含至少两个具有肽结合沟的功能性MHC复合物，每个MHC复合物都具有结合于所述MHC复合物的肽结合沟内的肽，其中每个肽都具有容许所述功能性MHC复合物通过一核心结构发生高度特异性寡聚化的修饰。
文档编号G01N33/569GK101111520SQ200680003922
公开日2008年1月23日 申请日期2006年2月1日 优先权日2005年2月4日
发明者N·F·G·施瓦贝 申请人:普罗伊缪因有限公司