测定蛋白质的聚合度的方法

专利名称：：测定蛋白质的聚合度的方法
技术领域：
：本发明涉及识别蛋白质的聚合度的方法。
背景技术：
：解析蛋白质的高级结构例如在分析蛋白质组学研究中的蛋白质动态或与其它生物分子的相互作用时、由分子水平开发疾病诊断或治疗方法等时是极为有用的。特别是，明确目标蛋白质是单体还是多聚体，以及如果是多聚体则聚合度是怎样的、即是由几个亚基(subunit)构成的，这是蛋白质结构解析的重要且基本的课题。目前，用于解析目标蛋白质聚合度的方法有数个，它们被用在各种
技术领域：
中。例如，在科学(Science,Vol243,pp85-88,(1988))中记载了利用X射线结构解析来解析链霉亲和素是几聚体的方法。该文献中，高纯度地精制目标蛋白质，进行结晶化，并使用X射线结构解析装置等对其进行解析。在该方法中，高度精制蛋白质且进行结晶化的步骤是必须的。因此，该方法存在以下问题。第一，样品的准备需要很长的时间。第二，结晶化和解析需要非常高水平的技术。另外，由于想要解析的蛋白质存在不能结晶化的蛋白质，因此在为这种不能结晶化的蛋白质时，无法利用该以往的方法，这是很大的问题。而且，为了将成为试样的蛋白质进行结晶化，要求大量的蛋白质作为试样。另一个例子记载于结构(Structure,Vol6,pp223-231,(1998))中。该文献记载了使用NMR的钙周边蛋白(calcydin)的同型二聚体的结构解析。具体地说，记载了在同位素存在下表达该蛋白质，制作含有同位素的蛋白质后使用NMR来解析蛋白质结构的方法。该方法中，需要高度精制成为对象的同位素标记了的蛋白质，为了这种NMR解析而进行充分的精制时，多聚体所含的亚基间的相互作用暴露在与生物体内不同的环境中。结果，无法在维持生物体内所获得的活性的情况下分析在所需溶液中与反应有关的蛋白质是几聚体。另外，为了解析通过蛋白质解析获得的NMR数据，实施者要求有高水平的专业知识，而且其解析需要很长的时间。EMBO期刊(TheEMBOJournal,Vol16，pp3198-3206，(1997))中记载了利用SDS电泳的蛋白质解析方法。该文献与转录因子的DNA结合方式的解析有关。该方法中首先对于问题蛋白质，准备将该蛋白质进行固定化处理(即交联反应)而得到的样品、和未进行固定化处理的样品。接着，将它们进行SDS电泳，通过比较其结果，从而判定该问题蛋白质是否是多聚体。如该方法所示，在蛋白质聚合度的解析中利用SDS电泳时，对象聚合度的大小成为问题。即，在利用SDS电泳进行检测时，当聚合度过大时，例如达到6聚体、8聚体或更多聚体时，难以检测正确的聚合度。另外。利用SDS电泳时，需要对应该蛋白质的抗体。因此，不能识别无法准备抗体的蛋白质或未知蛋白质的多聚体形成。而且，上述任何以往方法也不能在维持其活性的状态下测定以溶液形式存在的处于生理状态的蛋白质的聚合度。另外，任何方法在实施时，均要花功夫花时间，且解析也需要大量的必要试样。非专利文献1:PatriciaC.Weber著、科学、Vol243,pp85陽88,(1989)非专利文献2:MallikaSastry著、结构、Vol16，pp223-231,(1998)非专利文献3:IgorAntoshechkin著、TheEMBOJournal、Vol16,pp3198-3206，(1997)
发明内容鉴于上述情况，本发明的目的在于提供使用微量试样、可以简便地在短时间内以比以往更接近于生物体内结构的结构来测定蛋白质聚合度的方法。另外，本发明的目的还在于提供以高通量进行反映生理动态结构的环境下的蛋白质聚合度解析的方法。本发明人进行了深入研究，结果发现了用于解决上述目的的方法。艮口，本发明提供以下所述的方法。(1)测定蛋白质的聚合度的方法，其包括-合成该蛋白质，以使得对于所述蛋白质中所含的全部亚基，1分子亚基被1分子荧光色素所标记；将所述蛋白质分解为至少亚基水平；在该分解前和分解后在微小区域内测定所述荧光色素的荧光强度；以及根据通过上述测定获得的关于荧光强度的信息来求得该蛋白质的聚合度。(2)上述(1)所述的方法，其中，所述合成通过基于编码所述蛋白质的mRNA的蛋白质合成来进行。(3)上述(1)或(2)所述的方法，其中，所述蛋白质的合成包括将所述mRNA的任意位置的密码子(codon)置换成与用于标记的tRNA的反密码子相对应的密码子，从而获得改变的mRNA;以及在含有所述改变的mRNA、用于标记的tRNA、与天然氨基酸对应的tRNA的无细胞蛋白质合成体系中，在能够合成蛋白质的条件下合成上述蛋白质。(4)上述(1)~(3)任一项所述的方法，其中，在合成所述蛋白质后还包括精制合成产物。(5)上述(3)或(4)所述的方法，其中，所述反密码子由3个碱基以上构成。(6)上述(3)(5)任一项所述的方法，其中，所述任意的密码子选自琥珀密码子、赭石密码子和乳白密码子。(7)上述(3)~(6)任一项所述的方法，其中，所述任意的密码子含有至少1个第1人工核酸，与其相对应的上述反密码子含有至少1个第2人工核酸。(8)上述(3)(7)任一项所述的方法，其中，所述用于标记的tRNA在3，末端上具有荧光标记过的氨基酸。(9)上述(1)(8)任一项所述的方法，其中，所述关于荧光强度的信息以在任意连续时间内产生的荧光强度的波动的形式获得，并对所得信息进行分析。(10)上述(1)~(9)任一项所述的方法，其中，所述分解通过在适当条件下使用蛋白质分解酶、表面活性剂或还原剂或者它们的组合来进行。(11)上述(1)(10)任一项所述的方法，其中，所述方法利用选自荧光相关光谱法、荧光互相关光谱法、荧光强度分布解析法、荧光强度多重分布解析法和荧光偏振解析法中的方法来实施。(12)上述(1)~(11)任一项所述的方法，其中，所述蛋白质为均聚物。通过本发明，可以提供使用微量试样、能够简便地在短时间内以比以往更接近生物体内结构的结构来测定蛋白质聚合度的方法。另外，通过本发明，还可以提供以高通量进行反映生理动态结构的环境下的蛋白质聚合度解析的方法。图说明图1为表示本发明优选的一个方式的蛋白质合成概念的示意图图2为表示成为测定对象的蛋白质的示意图。图3为表示通过以往识别方法识别了的蛋白质的示意图。符号说明1mRNA3、10薩A5荧光标记过的氨基！7多肽11氨基酸13核糖体2标记用密码子4反密码子6麵A8、9密码子12亚基20、30标记化蛋白质21、23、25、27、31、33、34、37亚基22、24、26、28、32、35、36、38、39荧光色素分子具体实施例方式根据1个方面，本发明为测定蛋白质的聚合度的方法，其包括合成该蛋白质，以使得对于所述蛋白质中所含的全部亚基，l分子亚基被l分子荧光色素所标记；将所述蛋白质分解为至少亚基水平；在该分解前和分解后在微小区域内测定所述荧光色素的荧光强度；以及根据通过上述测定获得的关于荧光强度的信息来求得该蛋白质的聚合度。根据本发明，测定该蛋白质聚合度的方法经过以下两个阶段首先，在对成为测定对象的蛋白质赋予标记的同时将其合成；接着，将所得的标记化蛋白质进行分解，并根据对每个亚基所赋予的标记来求得该蛋白质的聚合度。1.蛋白质的合成和利用荧光色素进行的标记根据本发明，本方法首先在对成为测定对象的蛋白质赋予标记的同时将其合成。即，合成该蛋白质时，完成利用荧光色素进行的标记。使用图1说明本发明优选的一个方式的蛋白质合成的概念。参照图1(A)。根据本发明的蛋白质合成中，预先准备改变的mRNAl(图l(A))。根据本发明的改变的mRNAl是将编码成为测定对象的蛋白质的氨基酸序列的天然mRNA的碱基序列的一部分改变而获得的。即，该碱基序列中所需位置的1个密码子被置换为与用于进行荧光标记的tRNA3的反密码子4对应的标记用密码子2(图l(A))。该例子中，如图l(A)所示，该反密码子4为具有"CCCG"的氨基酸序列的4个碱基。用于标记的tRNA3为了进行所需的标记，除了该反密码子4之外，还在3'末端具有荧光标记过的氨基酸5。换而言之，在原本由3个碱基构成的反密码子所存在的位置上含有由4个碱基构成的标记用反密码子，在原本对应反密码子的碱基序列而分配的天然氨基酸所存在的3'末端上具有作为非天然氨基酸的荧光标记过的氨基酸5(图l(A))。参照图1(B)。根据本发明的蛋白质合成在该mRNAl、用于该标记的tRNA3、和与含有tRNA6和10的天然氨基酸对应的tRNA存在的环境下且在能够合成蛋白质的条件下进行(图1(B))。图1(B)为示意地表示在该条件下进行的蛋白质合成的一部分的图。该蛋白质合成中，根据mRNAl的碱基序列形成多肽7。此时，在所需位置的标记用密码子2上结合用于该标记的tRNA3的反密码子4。如上所述，用于该标记的tRNA3替代通常的20种类的氨基酸，具有作为非天然氨基酸的经荧光标记的氨基酸5。另外，如具有氨基酸11的tRNA10所示，具有天然氨基酸的tRNA与存在于mRNAl的标记用密码子2以外的位置上的各密码子对应。因此，如图KC)所示，当蛋白质合成结束时，可以获得仅含有1分子荧光色素分子5的亚基12(图1(C))。在以适当浓度使如此获得的亚基存在于接近生理条件的水溶液中时，则发生适当的聚合，从而获得目标蛋白质。成为根据本发明所得的测定对象的蛋白质认为在接近生理条件的水溶液中处于图2(A)所示的状态。参照图2(A)的示意图。作为l个例子，表示了4聚体的标记化蛋白质20。如上合成的测定对象的蛋白质的每1分子亚基被1分子荧光色素所标记。即，亚基21具有荧光色素分子22、亚基23具有荧光色素分子24、亚基25具有荧光色素分子26、亚基27具有荧光色素分子28(图2(A))。如上所述，根据本发明的方法中，同时完成了所需蛋白质的合成和荧光标记。以下，说明根据本发明的方法中所包括的蛋白质的合成和利用荧光色素进行的标记。本发明中，成为测定对象的蛋白质无论其氨基酸序列的起源为何，可以是天然和/或合成蛋白质等任何蛋白质来源的蛋白质。另外，成为本发明对象的蛋白质可以是单体和多聚体(即聚合物)的任意蛋白质，本发明中测定的优选蛋白质为由l种单体构成的均聚物。本发明中使用的"聚合度"是指构成目标蛋白质的亚基的数量、即为表示目标蛋白质为几聚体的值。根据本发明，该蛋白质合成可以在本领域技术人员公知的任何无细胞体系中进行。例如，可以利用在能够合成大肠杆菌、小麦胚芽、昆虫培养细胞或兔网织红细胞等来源的蛋白质的环境下进行的无细胞蛋白质合成。这种环境可以含有蛋白质合成所必需的要素、例如核糖体、氨基酸、蛋白质性的翻译因子组、ATP、GTP、酶类等mRNA以外的必要物质。根据本发明的蛋白质合成例如可以利用商业上可获得的任何试剂盒。这种无细胞试剂盒例如可以从岛津制作所、东洋纺、Roche和Promega以及丸文株式会社等获得。根据本发明的改变的mRNA可以通过其本身公知的制作mRNA的任何方法获得。例如，在其本身公知的能够合成无细胞蛋白质的条件下，可以在该蛋白质合成前使其表达。此时，例如可以使用聚合酶链反应(以下称为PCR)等来准备所需的人工插入有一部分变异的基因，将其插入质粒载体后制备质粒，然后将其添加到该无细胞蛋白质合成的环境中。该方法是本领域技术人员公知的。而且，本发明中，还可以通过本领域技术人员公知的任何方法来制备所需的改变的mRNA。根据本发明使用的荧光色素可以是能够结合在tRNA的3'末端上的本身公知的任何荧光色素。这种色素的例子有TAMRA(羧基甲基罗丹明)、TMR(四甲基罗丹明)、罗丹明绿、Alexafluor(注册商标)488、YOYOl、EVOblue(注册商标)和Alexafluor(注册商标)647等。但是，本发明所用的荧光色素并非局限于这些。这里所用的"用于标记的tRNA"是指为了将该蛋白质进行荧光标记而使用的tRNA，其可以是具有荧光色素分子的tRNA。根据本发明的具有荧光色素分子的tRNA的制备例如可以如下完成使用PCR等人工合成核酸的方法来合成该tRNA，之后利用公知的核酸修饰方法，将荧光标记过的氨基酸结合于该tRNA上。但是，本发明并非局限于此，还可以通过其它任何公知的方法来制备具有荧光标记过的氨基酸的tRNA。这里所用的"荧光标记过的氨基酸"是指通过其本身公知的任一种方法而赋予了1分子荧光色素分子的氨基酸。本发明所用的接近生理条件的水溶液的例子可以是包括磷酸缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液等任何公知的缓冲液。上述方式中示出了用于标记的tRNA的反密码子为4个碱基的例子。但是，本发明中使用的用于标记的tRNA的反密码子并非局限于此，只要是能够识别编码天然氨基酸的密码子，则可以使用由3个碱基构成的密码子、也可以使用由5个碱基以上的碱基构成的密码子。例如，使用由3个碱基构成的密码子时，可以利用终止密码子，即琥珀密码子(即"UAG")、赭石密码子(即"UAA")和乳白密码子(即"UGA")的任一种，优选使用"UAG"的由3个碱基构成的琥珀密码子。另外，还可以在该由3个碱基、4个碱基或5个碱基以上构成的密码子中使用自然界中不存在的对应的l对以上的核酸(即人工核酸)。为了方便起见，将该对应的核酸的1对设为X和Y时，将作为第1核酸的X置换为mRNA的所需位置的1个碱基、使作为第2核酸的Y含有在用于标记的tRNA的反密码子中。由此，可以合成本发明的包含在上述所需位置上含有荧光色素的亚基的蛋白质。这里所用的"对应"是指选择性且特异性地结合。本发明所用人工核酸可以使用其本身公知的任何人工核酸。或者，在本发明还可以利用例如日本特开2005-110595所记载的方法、Schultz等人的方法(Schultzetal.(1989)Science,244，182-188)和Chambarlin等人的方法(Chambarlin,etal,(1989)J.Am.Chem，Soc.,111,8013-8014)等。这些文献通过引用而编入本说明书中。如上所述，本发明使用的用于标记的tRNA的反密码子只要是由3个碱基以上构成的反密码子即可。但是，为了充分地获得目标蛋白质的量，本发明使用的用于进行荧光标记的tRNA的反密码子优选为由3个碱基或4个碱基构成的反密码子。而且，考虑到与具有相对于密码子己经有所分配的天然氨基酸的反密码子的竞争时，更优选该反密码子由4个碱基构成。但是，如后所述，根据本发明，即便使用例如由3个碱基、5个碱基(例如参见Hohsaka等的文献、NucleicAcidsResearch.2001，vol.29,pp.3646-3651)以上构成的反密码子来合成目标蛋白质时、和/或所得蛋白量为以往无法检测的程度的少量时，对于本发明的检测来说也是充分的量(上述文献通过引用而编入本说明书中)。S卩，在为以往的利用X射线、NMR和SDS电泳的方法时，在X射线和NMR中需要约mg级程度的蛋白质、在SDS中需要昭级程度的蛋白质。但是，在根据本发明的方法中，只要是nM级(容量50pL)程度的蛋白质即可高精度地测定聚合度。nM级程度的蛋白质量与上述以往技术中所需要的蛋白质量相比，为非常少的量。3.求得蛋白质的聚合度在根据本发明的测定蛋白质聚合度的方法中，对如上合成的该蛋白质进一步求得其聚合度。使用图2的标记化4聚体蛋白质的例子来说明其原理。参照图2。如上所述，根据本发明，要测定的蛋白质如图2(A)所示，在每1个亚基上带有1个荧光色素分子(图2(A))。将其分解为至少亚基水平，并检测荧光色素分子的数量时，可知其中存在多少个亚基(图2(B))。换而言之，图2(A)中为标记化4聚体蛋白质以l分子存在的状态，通过分解其结构，该蛋白质所含的亚基解离，产生4分子的亚基(图2(B))。因此，通过比较图2(A)所示的分解前的分子数量与图2(B)所示的分解后的分子数量，可以求得目标蛋白质的聚合度。根据本发明，为了比较分解前后的分子数量，在该分解前和分解后在通过共聚焦光学体系制作的微小区域内对该荧光色素的荧光强度进行测定即可。根据本发明，例如可以利用金城政孝的荧光相关光谱法(fluorescencecorrelationspectroscopy)(蛋白质核酸酶voI.44,1431-1438(1999))。利用该方法时，可以测定在任意连续的时间内荧光色素分子所发出的荧光强度的波动，通过所得信息的自身相关，计算存在于微小区域内的荧光色素分子的数量。这里，"任意连续的时间"只要是进行荧光相关光谱法时可以测定荧光强度的波动的充分的时间即可。另外，根据本发明，作为用于通过该荧光相关光谱法来测定分子数量的装置，可以使用1分子荧光分析系统MF20(奥林巴斯公司制)。根据本发明的用于分解该蛋白质所使用的方法可以是本领域技术人员公知的用于分解蛋白质的任意方法。并非局限于此，根据本发明，例如可以是后述的利用物理作用和/或化学作用进行的改性，还可以使用下述分解剂盐酸胍和尿素等改性剂、蛋白酶K、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶等蛋白质分解酶、SDS、包括TritonX(注册商标)-100等的TritonX以及含有Tween(注册商标)20等的Tween等表面活性剂、二硫苏糖醇(DTT)或2-巯基乙醇等还原剂等。另外，根据本发明的利用物理作用进行改性的例子包括利用加热、冷冻和溶解、超声波、紫外线、X射线等进行的处理，利用化学作用的改性剂的例子为产生极端的pH变动的物质、产生浓缩盐溶液的物质、有机溶剂、金属盐、表面活性剂和离液剂等，离液剂的例子为尿素、胍盐等。根据本发明，可以将包括上述分解剂的使用和物理改性的分解方法的任一种单独使用或并用2种以上。本发明中，将上述蛋白质"分解至至少亚基水平"包含通过上述分解方法在维持亚基结构的状态下将该蛋白质解离、和通过亚基结构也分解而将该蛋白质分解的两种含义。如图2(A)所示，根据本发明，构成标记化蛋白质20的各亚基分别具有每1分子的荧光色素分子。因此，分解后无论是维持了亚基的结构、还是未维持，所得聚合度均相同。根据本发明的方法，在求得"l.蛋白质的合成和利用荧光色素进行的标记"中合成的蛋白质的聚合度之前，可以进行简单的蛋白质精制。这种精制例如可以如下实施在该蛋白质的C末端上形成组氨酸标签，利用镍柱进行回收，利用稀咪唑缓冲液除去多余的蛋白质等后，用高浓度的咪唑缓冲液洗涤该柱。精制后的蛋白质例如溶解在磷酸缓冲液(以下记载为PBS)等缓冲液中，进行分解操作和荧光强度的检测，从而求得聚合度。另外，根据本发明，通过荧光相关光谱法以外的方法，即通过在用共聚焦光学体系制作的微小区域内进行测定，测定荧光色素分子所发出的荧光强度，并基于所得信息的自身相关解析，由此获得与荧光色素分子1:1对应的亚基信息，例如分子大小、数量或与亮度有关的信息，从而也可以测定目标蛋白质的聚合度。这种测定中可以利用荧光互相关光谱法(即，Fluorescencecrosscorrelationspectroscopy)、荧光亏虽度分布角早丰斤法(艮卩，FluorescenceIntensityDistributionAnalysis)、荧光弓虽度多重分布分丰斤法(艮卩，FluorescenceIntensityMultipleDistributionAnalysis)禾口荧光偏振角军析法(艮卩，FluorescenceIntensityDistributionAnalysis-polarization)。无论使用任何方法，均可将作为本发明的1个特征的所需样品量减少至nM级。4.比较例将通过上述本发明方法之外的例如利用化学反应的以往标记方法来标记蛋白质时的例子示于图3。参照图3。图3(A)中表示了通过以往标记方法荧光标记过的4聚体的标记化蛋白质30。通过化学反应对蛋白质30赋予的荧光色素分子与亚基的存在无关地、随机地结合在标记化蛋白质上。此例中，亚基31上结合有荧光色素分子32，亚基33上没有结合荧光色素分子，亚基34上结合有荧光色素分子35和36的2个分子，亚基37上结合有荧光色素分子38和39的2个分子(图3(A))。因此，将其分解时，尽管亚基存在4个分子，但由荧光色素分子来源的信息可知存在3个分子(图3(B))。实施例1准备单体蛋白质的骆驼来源的单链抗体(以下记载为CA)、4聚体蛋白质的链霉亲和素(以下记载为SA)的基因，将各个基因插入至荧光标记蛋白质表达用质粒载体pROX-FL(奥林巴斯)的多克隆位点中。该质粒载体的一部分对序列表中记载的肽序列进行编码。之后，以大肠杆菌DH5ot作为宿主来制备质粒。使用该质粒、对应于4碱基密码子的TAMRA-tRNA(奥林巴斯)、RTS100E.coliHYkit(Roche)，在目标蛋白质的特定位置上以相对于1分子亚基为1分子的比例标记作为荧光色素的TAMRA。通过利用组氨酸标签的精制方法，将其精制。将这些标记化蛋白质稀释于溶液中进行制备，以达到最终浓度为nM级。作为使该标记化蛋白质分解的处理，使用了利用蛋白酶进行的分解反应。蛋白酶使用蛋白酶K(Promega)，反应条件是最终浓度为100pig/mL、37°C、1小时以上，作为缓冲液，使用了PBS+0.05%Tween20。样品分解前后的荧光分子数量如下测定在通过共聚焦光学体系制作的微小区域内测定荧光分子所发出的荧光的波动，使用奥林巴斯制1分子荧光分析系统MF20、利用荧光强度分布解析(即，FluorescenceIntensityDistributionAnalysis,以下记作FIDA)测量经荧光标记的分子的数量。所用光源为543nmHe-Ne激光，测定为进行5次5秒钟的测定。结果如下所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>单体蛋白质的CA中，分子数量的增加率为1.29。因此，将SA所得的4.94除以该值1.29而校正后的值用于评价。考虑到游离状态的荧光色素混存、和并非全部蛋白质形成4聚体的可能性时，相对于理论值4，3.83的数值是妥当的。根据本发明，可以识别蛋白质形成了几聚体。因此可知，根据本发明的测定蛋白质聚合度的方法可以有效地活用。实施例2使用奥林巴斯制1分子荧光分析系统MF20、利用荧光相关光谱法进行同样实验的测定，所述1分子荧光分析系统MF20可以在通过共聚焦光学体系制作的微小区域内测定荧光分子所发出的荧光的波动，通过所得信息的自身相关，从而获得与荧光标记过的分子数量相关的数据。所用光源为543nmHe-Ne激光，测定为进行5次10秒钟的测定。结果如下所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>单体蛋白质的CA中，增加率为1.20。因此，将SA所得的4.61除以该值1.20而校正后的值用于评价。考虑到游离状态的荧光色素混存、和并非全部蛋白质形成4聚体的可能性时，相对于理论值4，3.84的数值是妥当的。根据本发明，可以识别目标蛋白质形成了几聚体。因此可知，本发明的测定蛋白质聚合度的方法可以有效地活用。实施例3进行与实施例1同样的操作，将骆驼来源的单链抗体(以下记载为CA)和链霉亲和素(以下记载为SA)进行TAMRA标记。将这些蛋白质稀释于溶液中进行制备，以达到最终浓度为nM级，作为使多聚体形成分解的处理，进行了利用表面活性剂的反应。表面活性剂使用SDS，反应条件为加入SDS至最终浓度达到0.1。/()、在95'C下孵育5分钟。加上蒸发部分的纯水后进行测定。使用奥林巴斯制1分子荧光分析系统MF20、利用荧光强度分布解析来测定样品的表面活性剂处理前后的荧光分子数。所用光源为543nmHe-Ne激光、测定为进行5次5秒钟的测定。结果如下所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>单体蛋白质的CA中，增加率为1.12。因此，将SA所得的4.14除以该值1.12而校正后的值用于评价。考虑到游离状态的荧光色素混存、和并非全部蛋白质形成4聚体的可能性时，相对于理论值4，3.71的数值是妥当的。根据本发明，可以识别目标蛋白质形成了几聚体。因此可知，本发明的测定蛋白质聚合度的方法可以有效地活用。以下说明本发明的其它效果。根据本发明，本测定方法可以高敏感度地测定荧光分子的大小或数量的变化，由此可以高敏感度地测定与多聚体分解导致的荧光标记游离所产生的荧光色素数量有关的由该分解前至分解后的增加率。本发明中，通过合成在任意位置上荧光标记过的蛋白质并对其进行解析，不需要在X射线衍射法中使用的蛋白质结晶化的步骤，结果可以短时间且简便地测定蛋白质的聚合度。本发明中，只要可以准备基因，则可以由其合成荧光标记过的蛋白质，不必大量准备蛋白质、或进行高度精制的步骤。另外，根据本发明，几乎全部的蛋白质可以进行表达、和进行荧光标记，因此也可以适用于由于不能结晶化而无法测定蛋白质聚合度的物质。另外，本发明的成为对象的蛋白质的聚合度的测定由于在溶液中进行，因此可以保持荧光标记过的目标蛋白质的活性，或者在正在反应的溶液中在接近生理状态的状态下进行解析。本发明的蛋白质聚合度测定中，其数据解析也可以仅通过将该蛋白质形成的多聚体进行分解的处理、从而确认荧光标记过的分子数量增加了几倍这样的非常简单的方法来进行。因此，不需要高水平的专业知识，可以在短时间内进行测定。本发明的蛋白质聚合度的测定即使在溶液中混有其它物质或蛋白质的状态下也可以进行，而且还不需要将蛋白质高度精制的工夫，可以简单地进行测定。另外，本发明的蛋白质聚合度的测定由于使用荧光标记过的蛋白质来进行，因此不必准备在一部分以往的方法中所需要的相对于蛋白质的抗体等，因此，即便是无法准备抗体的蛋白质也可测定聚合度。而且，本发明的1个方式的蛋白质聚合度的测定由于是由基因合成荧光标记过的蛋白质后实施测定，因此对于目前无法精制的未知蛋白质也可以测定其聚合度。权利要求1.测定蛋白质的聚合度的方法，其包括合成所述蛋白质，以使得对于所述蛋白质中所含的全部亚基，1分子亚基被1分子荧光色素所标记；将所述蛋白质分解为至少亚基水平；在所述分解前和分解后在微小区域内测定所述荧光色素的荧光强度；以及根据通过所述测定获得的关于荧光强度的信息来求得所述蛋白质的聚合度。2.权利要求1所述的方法，其中，所述合成是通过基于编码所述蛋白质的mRNA的蛋白质合成来进行的。3.权利要求1或2所述的方法，其中，所述蛋白质的合成包括将所述mRNA的任意位置的密码子置换成与用于标记的tRNA的反密码子相对应的密码子，从而获得改变的mRNA;和在含有所述改变的mRNA、用于标记的tRNA、与天然氨基酸相对应的tRNA的无细胞蛋白质合成体系中，在能够合成蛋白质的条件下合成所述蛋白质。4.权利要求1~3任一项所述的方法，其中，在合成所述蛋白质后还包括精制合成产物。5.权利要求3或4任一项所述的方法，其中，所述反密码子由3个碱基以上构成。6.权利要求3~5任一项所述的方法，其中，所述任意的密码子选自琥珀密码子、赭石密码子和乳白密码子。7.权利要求3~6任一项所述的方法，其中，所述任意的密码子含有至少1个第1人工核酸，与其相对应的所述反密码子含有至少1个第2人工核酸。8.权利要求37任一项所述的方法，其中，所述用于标记的tRNA在3'末端上具有荧光标记过的氨基酸。9.权利要求18任一项所述的方法，其中，所述关于荧光强度的信息以在任意连续时间内产生的荧光强度的波动的形式获得，并对所得信息进行解析。10.权利要求1~9任一项所述的方法，其中，所述分解通过在适当条件下使用蛋白质分解酶、表面活性剂或还原剂或者它们的组合来进行。11.权利要求1~10任一项所述的方法，其中，所述方法利用选自荧光相关光谱法、荧光互相关光谱法、荧光强度分布解析法、荧光强度多重分布解析法和荧光偏振解析法中的方法来实施。12.权利要求1~11任一项所述的方法，其中，所述蛋白质为均聚物。全文摘要本发明的目的在于提供可以使用微量试样、简便地在短时间内以比以往更接近生物体内结构的结构来测定蛋白质的聚合度的方法。本发明提供测定蛋白质的聚合度的方法，其包括合成所述蛋白质，以使得对于所述蛋白质中所含的全部亚基，1分子亚基被1分子荧光色素所标记；将所述蛋白质分解为至少亚基水平；在所述分解前和分解后在微小区域内测定所述荧光色素的荧光强度；以及根据通过所述测定获得的关于荧光强度的信息来求得所述蛋白质的聚合度。文档编号G01N21/78GK101292029SQ20068003849公开日2008年10月22日申请日期2006年10月19日优先权日2005年10月19日发明者中田秀孝申请人:奥林巴斯株式会社