专利名称：氨基酸诊断/测定试剂盒及氨基酸的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种氨基酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定氨 基酸浓度的方法，属于医学/食品/工业/农业/环境检验测定技术领域。
技术背景氨基酸含量的测定在医学/食品/工业/农业/环境中都是比较重要的测 定项目。现有的测定方法有色谱法、电化学法、仪器分析法(氨基酸分析 仪)、分光光度计等方法，这些方法或是操作方法较为繁杂、特异性差、 或仪器设备成本较高等缺点。氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可直接测定出17种氨基 酸(仪器价格昂贵，不能普遍使用)，对于医学/食品/工业/农业/环境中来 说，多数情况下，都是很多种氨基酸同时存在，所以需要测定总的氨基酸 含量，它们不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基酸中所含的氮(氨基 酸氮)的百分率表示。大量食肉或饥饿时尿中氨基酸氮增加，孕妇及新生儿尿液氨基酸氮也 增加。氨基酸代谢异常，造成某些氨基酸在体内积累过多，使尿中氨基酸 氮增高；急性肝萎縮、肝功能衰竭、R e y e综合征、或某些因素造成蛋 白质分解加速的疾病，遗传性疾病所导致的代谢异常均可使尿中氨基酸氮 增加。酶法测定血、尿、体液、食品、土壤、工业产品中氨基酸氮含量具有特异性高、方法简便、成本低的特点。 发明内容本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量/连 续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化， 得以测定氨基酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的氨 基酸诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、 全自动生化分析仪上进行氨基酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高， 因而可以得到切实的推广应用。本发明氨基酸浓度测定方法原理如下氨基酸+水+氧氨基酸氧化酶氧代酸+氨离子+过氧化氢过氧化氢+辅酶NAD(P〗H氧化酶还原型辅酶+氧 这种方法应用氨基酸氧化酶(amino acid oxidase; EC 1.4.3.2; EC 1.4.3.3)偶联NAD (P) H氧化酶(NADPH oxidase ; EC 1.6.3.1)酶促反应速率比色法/终点法。氨基酸氧化酶酶解氨基酸反应产生过氧化氢， 再通过(偶)联合NAD (P) H氧化酶的作用，最终将辅酶(在340nm 处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以 测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度/速度，通过测量340nm处 吸光度上升的程度/速度，可以测算氨基酸的浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明氨基酸诊断/测定试剂盒较为理想缓冲液 100mmol/L稳定剂 500 mmol/L辅酶 3 mmol/L氨基酸氧化酶 10000 U/LNAD (P) H氧化酶 12000 U/L本发明的氨基酸诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括-缓冲液、稳定剂、辅酶、氨基酸氧化酶、NAD (P) H氧化酶。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、辅酶。 试剂2缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶、NAD (P) H氧化酶。 辅酶、氨基酸氧化酶、NAD (P) H氧化酶在试剂1或试剂2中的位 置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以 配制成液体试剂，直接使用。还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、辅酶。 试剂2缓冲液、稳定剂、NAD (P) H氧化酶。 试剂3缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶。辅酶、氨基酸氧化酶、NAD (P) H氧化酶在试剂l、试剂2或试剂3 中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用; 也可以配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定氨基酸浓度的方法，其辅酶 可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一本实施例的氨基酸诊断/测定试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 10Ommol/L 稳定剂 500 mmol/L辅酶 3 mmol/L氨基酸氧化酶 10000 U/LNAD (P) H氧化酶 12000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37X:，反应时间10分钟，起始吸 光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨基酸样品与 试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分 析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出氨基酸 的浓度大小。 实施例二本实施例的氨基酸诊断/测定试剂为双试剂，包括试剂1三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂辅酶100誰ol/L50 mmol/L3 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L10000U/LNAD (P) H氧化酶 12000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37T:，反应时间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨基酸样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出氨基酸的浓度大小。 实施例三本实施例的氨基酸诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂辅〖试剂250 mmol/L3 mmol/L(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂NAD (P) H氧化酶500 mmol/L12000U/L试剂3三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂100mmol/L500 mmol/L10000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定氨基酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37"C,反应时 间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm， 被测氨基酸样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应 方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右,加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出氨基酸 的浓度大小。申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色 原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类 同，不另一一例举。总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析 仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
权利要求
1.一种酶比色法及酶联法的氨基酸的浓度测定方法，其方法原理如下氨基酸+水+氧氨基酸氧化酶氧代酸+氨离子+ 过氧化氢过氧化氢+辅酶NAD(P)H氧化酶还原型辅酶+氧将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，测算出氨基酸的浓度大小测定结果。
2. —种氨基酸诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液 20-500 mmol/L稳定剂 1——4000 mmol/L辅酶 1- 6 mmol/L氨基酸氧化酶 1000——80000 U/LNAD (P) H氧化酶 1000——80000 U/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述氨基酸诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、辅酶、氨基酸氧化酶、NAD (P) H氧化酶组成单 剂试剂。
4. 根据权利要求2所述氨基酸诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、氨基酸氧化酶、NAD (P) H氧化酶组成 双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅酶、组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶、NAD (P) H氧化酶组成。辅酶、氨基 酸氧化酶、NAD (P) H氧化酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述氨基酸诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、氨基酸氧化酶、NAD (P) H氧化酶组成 多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶组成；试剂2，由缓冲液、 稳定剂、NAD (P) H氧化酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、氨基 酸氧化酶组成。辅酶、氨基酸氧化酶、NAD (P) H氧化酶在试剂l、 试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述氨基酸诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括 稳定剂1-4000 mmol/L或0.P/。-100。/()体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的氨基酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定氨基酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/工业/农业/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、氨基酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的程度/速度，从而测算出氨基酸的浓度大小。
文档编号G01N33/68GK101324583SQ20071002335
公开日2008年12月17日 申请日期2007年6月13日 优先权日2007年6月13日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司