专利名称：：人巨细胞病毒m抗原表位及其在医药研究领域中的应用的制作方法人巨细胞病毒M抗原表位及其在医药研究领域中的应用发明领域本发明涉及人巨细胞病毒外膜糖蛋白中的M抗原表位，以及所述M抗原表位在制备人巨细胞病毒诊断试剂或疫苗中的应用或在其它医药领域中的应用。发明背景人巨细胞病毒(humancytomegalovirus,HCMV)是一类在自然界普遍存在但又具有严格种属特异性的病毒，属P疱疹病毒亚科。人巨细胞病毒在人群中感染非常普遍，但大多数呈临床不显性感染或潜伏感染，多数人在儿童或少年期受HCMV感染后获得免疫。在孕妇，原发或新的HCMV复发感染均可引起新生儿宫内感染或围产期感染，可导致胎儿畸形，智力低下和发育迟緩等，严重者可引起全身性感染综合征，称为巨细胞包涵体病。近20年来，随着免疫低下状态人群包括艾滋病、放射损伤、器官移植和恶性肿瘤等患者的增多，HCMV感染及其引发的严重疾病有日益增加的趋势，这引起了人们对人巨细胞病毒分子生物学、流行病学、诊断技术、治疗与预防等研究的重视。在巨细胞病毒外层嚢膜上含有多种糖蛋白，包括糖蛋白B(gB)、H(gH)、M(gM)/N(gN)、0(g0)/L(gL)等。gB是主要的中和性抗原，gH的作用是辅助膜蛋白B结合细胞膜受体EGFR使病毒完成对细胞的侵袭过程。相对于gB、gH来说，gM研究的文献较少。gM或gM/gN复合物的中和性作用是最近才研究证实。gN的作用一方面与gM构成复合物在病毒感染过程中产生中和性抗体，另一方面与病毒的复制有关。gM是病毒的第三类膜蛋白，分子量约为42-45kDa，经计算机预测gM蛋白含有7个跨膜区段。在病毒外膜上gM与gN形成异源二聚体而存在。尽管其中和性抗原的性质已经得到确认，但到目前为止有关gM的表位研究还未见报道。gM的研究同样具有重要的意义。(JVirol.2006.80(9):4591-4600).目前临床诊断HCMV的主要方法是血清学诊断。血清学HCMV诊断主要是检测IgM和(或)IgG。HCMV病毒感染机体首先出现IgM抗体，IgM抗体检测阳性直接说明病毒正处于活动期或繁殖期，它是病毒感染的前期表现，所以IgM抗体检测在临床应用最多；但IgM抗体维持时间很短，从出现到消失仅仅一周左右的时间，如果检测不及时很可能造成病例假阴性结果。IgG抗体尽管出现较晚，其维持时间最长，有时可达几个月的时间。检测HCMVIgG的变化曲线是临床诊断的重要参考依据。在临床上将检测IgM和IgG相结合才能尽量避免假阴性或者假阳性结果。临床血清学方法检测HCMV试剂主要是商品化的ELISA试剂盒。由于国内试剂盒目前包被的抗原大部分为裂解后的病毒粒子，成分复杂，同一病毒科的成员具有很多相同的成分，所以检测过程中很容易出现假阳性结果，导致临床的误诊；而国外有些试剂盒已经开始包被重组的HCMV特异蛋白或人工合成的多肽，但其成本高，在临床检测过程中增加了患者医疗费用，导致国内临床检测时推广受到限制。近年来多主张釆用重组表达HCMV蛋白及多肽作为检测抗原，已发现具有较高的诊断价值。用重组表达的病毒特异蛋白及多肽作为抗原检测HCMV具有两方面的优势l)避免了HCMV病毒粒子带来的潜在危险；2)由于抗原是HCMV特异的蛋白或多肽，能够减少假阳性或假阴性结果。[JClinMicrobiol.2005，43(9):4713-4718]HCMV疫苗的研究包括亚单位疫苗、质粒载体DM疫苗、病毒载体DNA疫苗、合成蛋白(肽)疫苗。除了近几年研究的基因工程疫苗以夕卜，还包括已在临床上有限制应用的Towne减毒活疫苗。目前在国外，有的疫苗已完成n期临床试验研究[ClinInfectDis.2004，39:233-239],而国内至今没有疫苗进行临床试验的报道，只是对几种病毒成分做了相关实验室研究[军事医学科学院院刊.2003,27(5):38-41;青岛医学院学报.2003，39(1):12-15]。近年来抗原表位肽作为候选疫苗的研究越来越受到广泛的重视，但由于抗原表位肽免疫原性差及免疫佐剂研制的限制，抗原表位肽在临床上的应用研究还处于初级阶段。随着表位肽的研究进展，表位肽作为疫苗的应用具有广阔的前景。因此HCMV特异多肽的发现对提高临床检测HCMV阳性率及预防HCMV感染的实验研究具有重要的意义。
发明内容鉴于gM或gM/gN复合物中和性抗体能够部分抑制病毒的感染力，且目前还没有gM抗原表位的研究报道，我们以羊抗HCMV多克隆抗体为靶标，经过噬菌体线性随机肽库筛选获得了多克隆抗体一个结合肽，通过与gM蛋白序列比较，发现结合肽序列与gM蛋白第32-38位氨基酸序列具有较高的一致性。将结合肽偶联至钥孔血兰蛋白(KLH)后免疫Balb/c鼠，获得了针对结合肽的多抗血清。该多抗血清不仅能够结合天然的HCMV病毒粒子，而且还能够结合重组表达的gM30-78多肽。本发明的一个方面，涉及HCMV中的新M抗原表位，其是具有用单字符表示的如下氨基酸序列的多肽LVLSNFP。本发明的另一方面，涉及与上述M抗原表位序列具有一个或多个保守性氨基酸残基替换，且具有相同或相似的中和活性的多肽。在本发明的一个实施方案中，所述多肽具有用单字符表示的如下氨基酸序列LXLSQXP，其中X表示已知20中氨基酸中的任意一个。在本发明的又一实施方案中，所述多肽具有用单字符表示的如下氨基酸序列HLVLSNFP。在本发明中，有用的保守置换在表1中列出。将属于一个类别的氨基酸替换为相同类别的另一个氨基酸的保守置换落入本发明的范围内，只要这种置换实质上不改变所述表位多肽的生物活性。表1优选的氨基酸置换<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本发明的又一方面涉及含有所述M抗原表位的多肽在制备HCMV诊断试剂或针对HCMV的疫苗中的应用。微量病毒中和实验结果初步表明具有上述结构多肽的抗体具有中和活性。通过FITC标记HCMV即刻早期蛋白的表达情况，与阳性对照羊抗HCMV多抗B65275G和阴性对照正常小鼠血清、正常山羊血清及PBS相比，经过鼠抗结合肽多抗处理的HCMV粒子其感染HEL细胞后FITC荧光的数量明显比阴性对照减少，HCMV病毒粒子感染能力降低，表明鼠抗结合肽抗体能够部分中和病毒的活性。ELISA实验证实结合肽与重组表达的HCMVB抗原表位区AD1和AD2均能特异结合已知的HCMVIgG阳性的人血清。将结合肽与AD1、AD2混合检出的HCMVIgG阳性人血清率比单纯AD1/AD2混合物检出率高。下面以结合附图和针对M抗原表位的实施例对本发明作进一步详细说明。图1显示鼠抗M抗原表位多抗竟争抑制羊抗HCMV多抗结合HCMV病毒的ELISA结果。图2显示鼠抗M抗原表位多抗的微量HCMV病毒中和实验结果，其中A为HCMV多抗B65275G;B为M抗原表位多抗；C为B孔伊文斯兰复染结果；D为正常小鼠抗体；E为正常山羊抗体；F为无抗体阴性对照。图3显示gM30-78多肽结合鼠抗M抗原表位多抗WesternBlot结果，其中1为鼠抗M抗原表位多抗；2为His单抗。实施例1.羊抗HCMV多抗抗原表位的筛选首先用100ul羊抗HCMV多抗IgG包被于酶联板，置4'C过夜。经过3%的BSA封闭lh后，加入噬菌体展示随机十二肽库(NEB产品)，室温孵育lh，用TBST(50mmol/LTris-HCl，0.1%TWEEN20，pH7.5)洗涤非特异结合的噬菌体，再用G.2mmol/L甘氨酸-HClpH2.2洗脱特异结合的噬菌体，洗脱液用lmol/LTris-HC1pH9.0中和。按照产品试剂盒提供的方法，测定洗脱液中的噬菌体的滴度，以正常山羊血清IgG的洗脱噬菌体的滴度作为对照，测定P/N比值。同时将洗脱的与TRAP抗体IgG结合的噬菌体扩增，并测定其滴度，用于下一轮的筛选。经过4轮筛选后，测定的P/N比值有了明显的提高。将富集的噬菌体克隆进行ELISA鉴定，随机挑取20个阳性克隆进行测序。分析后得到包含抗原表位序列的多肽序列。实施例2.筛选到的抗原表位序列和M蛋白序列进行比较将筛选抗原表位序列和M蛋白的原始序列进行分析发现，抗原表位序列与M蛋白的32-38位氨基酸序列存在高度同源性表4立序列xzx，xfM蛋白一级序列31HZV诸F户38实施例3.抗原表位多抗竟争抑制羊抗HCMV多抗结合病毒粒子将M抗原表位通过共价键与钥孔血兰蛋白(KLH)偶联，免疫Balb/C鼠获得了M抗原表位多抗血清。经过ProteinA纯化后得到纯度较高的M抗原表位多抗。按照试剂盒的方法，将HCMV病毒包被ELISA板孔，经过3。/。的BSA封闭lh后，加入抗原表位多抗与不同浓度的羊抗HCMV多抗，室温孵育lh，用PBST(20mmol/LPBS，0.5%Tween-20，pH7.5)洗涤，然后加入HRP标记的兔抗小鼠二抗，用ECL液显示抗原模拟表位抗体结合病毒的0D值。实验结果发现随着羊抗HCMV多抗量的增加，抗原表位多抗结合病毒的能力呈下降趋势，直至最后达到与正常山羊血清水平。(参见图l)实施例4.抗原表位多抗微量病毒中和实验首先分别用标准羊抗HCMV多抗、M抗原表位多抗、正常小鼠多抗、正常山羊多抗以及PBS处理HCMV病毒粒子，然后将处理过的病毒感染HEL细胞。16小时后先用无水乙醇固定细胞，再加入单抗MAB8129与病毒表达的分子量为68kD的即刻早期蛋白反应，最后加入FITC标记的山羊抗小鼠抗体。通过计数荧光点数观察M抗原表位多抗抑制病毒的能力。结果表明1:64倍稀释的标准羊抗HCMV多抗几乎完全抑制了病毒侵入细胞的能力，与1:2倍稀释的正常小鼠多抗，正常山羊多抗以及PBS处理过的病毒相比，1:4倍稀释的M抗原表位多抗能够部分抑制病毒侵入HEL细胞。表明M抗原表位多抗具有中和病毒的活性。(参见图2)实施例5.抗原表位序列展示在细菌鞭毛上及免疫动物的效果观察利用鞭毛的在细菌表面的高拷贝数(每个细菌约二万个拷贝)的性质，我们将M蛋白抗原表位序列对应的多肽展示在大肠杆菌GI826鞭毛蛋白的硫氧环蛋白区，将重组菌免疫小鼠，检测特异抗体的产生，经过两次加强免疫后。WestenBlot实验结果显示产生的抗血清能够特异结合重组表达的gM30-78多肽，表明我们获得的抗原表位肽与合适的载体偶联后具有良好的免疫原性。实施例6.抗原表位联合重组表达的已知的B抗原表位AD1和AD2检测人血清应用我们从山东省圻南县计划生育服务站和北京儿童医院获得人血清40份，分别用两个不同生物公司生产的HCMVIgGELISA试剂盒检测此40份血清，结果有8份血清确定为IgG阳性(第6、10、11、17、18、40、41、42号)。在这8份HCMVIgG阳性的人血清中其中有3份血清(第6、11、41号)能够特异结合M抗原表位，有6份血清(第6、10、11、17、40、42号)与重组表达的已知的B抗原AD1/AD2表位混合物发生特异的结合反应。将M抗原表位与重组表达的AD1、AD2混合作为抗原，发现该混合物能够特异结合7份血清(第6、10、11、17、40、41、42号)。其中第41号血清只能与M抗原表位反应而不与AD1/AD2混合物反应，初步表明M抗原表位的发现提高了HCMV的检出率。(参见表l)表1、本发明所述M抗原表位及已知B抗原AD1/AD2表位(MAD)与HCMVIgG标准试剂盒测定阳性人血清的比较结果样品OD450.值标准试剂盒MAD10.203±0.020.189土0.0120.123±0.030.134±0.0130,172土0.010.09士0.0140.213±0.050.129士0.0250.134±0.030.2±0.0160.701±0.1020.642±0，70.205土0.020.135±0.0380.132±0.010.198士0.0490.2±0.010.19土0.01100.601±0,110.206±0.0211O'749士0.0970.808±0.109120.21士0.01o.no±o,oi130.121士0.020.203±0.0114(U35士0.040.124±0.05150.213±0.010.194±0.0216(U2士0.080.132±0.03170,628士0.127o.mo.oi180.151士0.03190.07±0.010.98±0,02200.152土0.0S0.14±0.05样品OD450值标准试刑盒MAD210.168士0.030.112±0,08220.08±0.020.112土0.01230.23±0.010.154±0,04250.167土0.040.2±0.02260.147士0.020.152±0.0228(U73士0.020.131士0.09290.159±0.01(U62士0.01300.18土0.030.122±0.02310.087土0.120,064±0,09320.052±0.10.095士0.12330.147±0,050,193±0.01340.051±0,080.078±0.01350.181±0.01(U67士0.03360.209±0.030.187士0.02370.156±0.010.143土0.0538(U93土0.020.187士0.04390.32土0.010.135±0.02400.539±0.090.102±0.01410.801±0.0780.525士0.045420.725±0.0720.216土0.0权利要求1.人巨细胞病毒M抗原表位或其具有一个或多个保守性氨基酸残基替换、添加或删除且具有相同或相似的中和活性的保守性变体，其中所述M抗原表位具有以单字符表示的以下氨基酸序列LXLSQXP其中X表示已知20中氨基酸中的任意一个。2.权利要求1所述的M抗原表位，其具有以单字符表示的以下氨基酸序列LVLSNFP。3.权利要求1所述的M抗原表位，其具有以单字符表示的以下氨基酸序列HLVLSNFP。4.权利要求1所述的M抗原表位，其特征在于所示序列中的氨基酸残基可以根据氨基酸的相似性进行相互替代，其中丝氨酸残基(S)和苏氨酸残基(T)之间可以相互替代；亮氨酸残基(L)和异亮氨酸残基(I)之间可以相互替代；谷氨酰胺残基(Q)和天冬酰胺残基(N)之间可以相互替代；苯丙氨酸残基(F)和酪氨酸残基(Y)之间可以相互替代。5.权利要求1-4中的任意一项的M抗原多肽在制备HCMV诊断试剂中的用途。6.权利要求l-4中的任意一项的14抗原多肽在制备针对110^的疫苗中的用途。全文摘要本发明涉及人巨细胞病毒外膜糖蛋白中的M抗原表位，以及所述M抗原表位在制备人巨细胞病毒诊断试剂或疫苗中的应用或在其它医药领域中的应用。文档编号G01N33/68GK101274957SQ20071030143公开日2008年10月1日申请日期2007年12月27日优先权日2007年12月27日发明者玉刘,光杨,川柳,沈倍奋,芳王,王本旭,邵宁生,高亚萍申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所