专利名称：：通过三维相互作用从多聚体形成多肽的单体形式中示差检测多聚体形式的方法
技术领域：
：本发明涉及通过三维相互作用从多聚体形成多肽的单体形式中示差检测多聚体形式的方法及其免疫测定试剂盒。
背景技术：
：通常已知组成蛋白质的多肽的多聚化是蛋白质功能所需要的。然而，在一些蛋白质中多聚体形式常常引起疾病或紊乱。尤其是，蛋白质在正常状态下作为单体存在而在异常状态(例如通过转变形成错折叠形式)下变成多聚体(或聚集形式)。已经充分确定错折叠并最终聚集(或积聚)的蛋白质，即那些非功能性相关构象的蛋白质缺乏正常的生物活性。未能正确折叠或未能保持正确折叠引起许多不同类型的生物功能障碍，并因此引起许多不同形式的疾病(MassimoStefani,etal.,Mo/.Med81:678-699(2003);和RadfordSE,etal.,ce〃.97:291-298(1999))。许多疾病最终起因于在生命系统中存在具有不正确结构的蛋白质分子(即不同于正常行使功能的生物体的蛋白质分子)。例如，与蛋白质异常聚集或错折叠有关的疾病或紊乱包括阿尔茨海默氏病、克罗伊茨费尔特-雅各布病、海绵状脑病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化、丝氨酸蛋白酶抑制剂缺乏症、肺气肿、肝硬化、II型糖尿病、原发性全身性淀粉样变性、继发性系统性淀粉样变性病、额颞骨痴呆(Fronto-temporaldementias)、老年全身性淀粉样变性、家族性淀粉样多神经病、遗传性大脑淀粉样血管病以及与血液透析相关的淀粉样变性病。已深入研究了与聚集相关的疾病的早期诊断。但是，还没有提出从其单体(正常)形式示差检测多聚体(聚集)形式的任何方法和途径。由于可传染的海绵状脑病(TSE)，人的偶发、变异、医源性和家族性的克罗伊茨费尔特-雅各布病、库鲁病、家族性致命性失眠和格-施-沙(Gerstmann-Straussler-Scheinker)综合征，绵羊和山羊的瘙痒病，猫的海绵状脑病，貂的海绵状脑病，鹿、麋鹿和驼鹿的慢性萎缩病以及牛的海绵样脑病是致命的神经变性疾病(PmsinerS.B.A^/.爿cad"5^95:13363-13383(1998);和HopeJ.Cmr.(9;^.Z)ev.10，568-57(2000))。已强烈认为异常同工型或瘙痒病型的朊病毒蛋白质(PrpSe)是TSE的主要致病原因(CaugheyB.7>ewA所oc/zem,5W.26:235-42(2001》。正常型朊病毒蛋白质(PrpC)包括a-螺旋和柔性无序部分并且作为单体形式存在(Zahn,R,,etal.，TVoc.7Vo"爿cat/.Sc/.USA97:145-150(2000))，其中，瘙痒病型(PrpSe)具有高度P-折叠构象并且作为多聚体(聚集)或至少二聚体形式存在(Caughey,B.，etal.，/Ao/.C77em.273:32230-35(1998))。从a-螺旋构象到(3-折叠构象的构象变化似乎是其神经病理学疾病的主要起因。PrPc对蛋白酶敏感(PrP则)，PrPSc对蛋白酶解具有部分抗性(PrP，并易于形成高分子量聚集物(BoltonD.C.358:164-5(2001))。在后特征使其难于分析导致形成PrPr"或表现其特征的构象转变。通过消化细胞型而仅保留瘙痒病型以ELISA检测，蛋白酶K(PK)消化法已用于辨别PrP(瘙痒病型)的各种形式的抗性。但是，PK消化法备受质疑。PrP构象、浓度、组织抗体、消化时间和緩冲液可影响PK的敏感性，这显著降低PK消化法的可靠性。因此，需要开发出具有更高可靠性且方便的从其单体形式(例如，PrPPrP的细胞型)中示差检测多聚体形式(例如，PrpSe,PrP的瘙痒病型)的新方法。贯穿本申请，参考了多篇专利和出版物，且各引用包括在括号中。为了更加充分描述本发明和本发明所属领域的技术现状，这些专利和出版物的全部内容在此作为参考并入本申请中。
发明内容因此，本发明的一个目的是提供一种从多聚体形成多肽的单体形式中示差检测多聚体形式的方法。本发明的另一目的是提供一种用于从多聚体形成多肽的单体形式中示差检测多聚体形式的试剂盒。通过以下详细说明和所附权利要求书及附图，本发明的其它目的和优点将变得明显。图la示意性表示本发明的MDS-3D-单珠(多聚体检测系统-三维画单珠)系统的实施例。图1b示意性表示本发明的MDS-3D-双珠系统的实施例。图1c示意性表示本发明的具有双标记的MDS-3D-双珠系统的实施例。图2显示根据本发明(同时法)与常规方法(分步法)检测多聚体朊病毒蛋白质的实验结果。"N，，与"Sc，，分别表示正常血浆与包含PrP&的血浆。"RLU"表示相对光单位。图3a表示选择适于MDS-3D-单珠系统的緩冲液类型的实验结果。图3b显示由Prpse血浆的信号与正常血浆的信号的比表示的图3a的结果的另一种呈现形式。图4显示使用3E7和MA1750抗体根据MDS-3D-双珠系统检测血浆中的多聚体朊病毒蛋白质的实验结果。"RFU"表示相对荧光单位。图5表示选择适于MDS-3D-双珠系统的緩冲液类型的实验结果。图6表示选择适于MDS-3D-双珠系统的血浆浓度的实验结果。图7表示选择适于MDS-3D-单珠系统的血浆浓度的实验结果。图8显示使用T2和MA1750抗体根据MDS-3D-双珠系统检测血浆中的多聚体朊病毒蛋白质的实验结果。图9显示使用不同浓度和类型的用于制备血浆样本的去污剂通过MDS-3D-单珠系统检测血浆中的多聚体朊病毒蛋白质的分析结果。图10表示使用不同类型的用于洗涤用血浆样本和抗体温育的珠的洗涤緩冲液通过MDS-3D-单珠系统检测血浆中的多聚体朊病毒蛋白质的分析结果。图11表示根据MDS-3D-单珠系统在浓度为30%和100%的血浆中检测多聚体朊病毒蛋白质的分析结果。图12表示根据MDS-3D-单珠系统在浓度为20%和25%的血浆中检测多聚体朊病毒蛋白质的分析结果。图13显示PK消化对根据MDS-3D-单珠系统检测血浆中的多聚体朊病毒蛋白质的影响。图14a表示使用不同重量比的抗体通过MDS-3D-单珠系统检测血浆中的多聚体朊病毒蛋白质的分析结果。图14b表示使用不同重量比的抗体通过MDS-3D-双珠系统检测血浆中的多聚体朊病毒蛋白质的分析结果。图15a和15b表示使用捕捉抗体混合物通过MDS-3D-单珠系统检测血浆中的多聚体朊病毒蛋白质的分析结果。图15c表示使用检测抗体混合物通过MDS-3D-单珠系统检测血浆中的多聚体朊病毒蛋白质的分析结果。左侧柱与右侧柱分别对应于(i)3E7-珠作为捕捉抗体并且T2-生物素和MAl-生物素作为检测抗体混合物与(ii)MAl-珠作为捕捉抗体并且T2-生物素和3E7-生物素作为检测抗体混合物。图16显示MDS与MDS-3D单珠系统的检测能力的比较。具体实施例方式在本发明的一个技术方案中，提供了一种在生物样本中从多聚体形成多肽的单体形式中示差检测多聚体形式的方法，其包括以下步骤(a)通过将捕捉抗体与固相载体的表面以三维方式结合制备载体-捕捉抗体结合物，其中，该捕捉抗体能够识别多聚体形成多肽上的表位；(b)制备检测抗体，其中，由该检测抗体识别的表位位于多聚体形成多肽中的一个位置而通过捕捉抗体与其表位结合引起位阻，以阻止检测抗体与多聚体形成多肽结合；(c)使载体-捕捉抗体结合物以及^f企测抗体与生物样本同时接触；以及(d)检测载体-捕捉抗体-多聚体形式-检测抗体复合物的形成。在本发明的另一技术方案中，提供了一种在生物样本中从多聚体形成多肽的单体形式中示差检测多聚体形式的试剂盒，其包括(a)捕捉抗体，该捕捉抗体识别多聚体形成多肽上的表位并与固相载体的表面三维结合；和(b)检测抗体，该检测抗体识别存在于多聚体形成多肽中的一个位置的表位，通过捕捉抗体与其表位结合引起位阻从而阻止检测抗体与多聚体形成多肽结合。本发明目标在于一种通过涉及抗原-抗体反应的免疫测定而在生物样本中从多聚体形成多肽的单体形式中示差检测多聚体形式的方法。此外，本发明使用两类抗体，捕捉抗体与检测抗体，二者都与多聚体形成多肽竟争结合。通过空间阻碍出现了这种竟争的抗体结合。具体而言，由于与多聚体形成多肽上的结合部位的竟争，与多聚体形成多肽上的表位结合的捕捉抗体抑制检测抗体与其多聚体形成多肽上的表位结合。本发明的特征之一是在三维接触情况下进行免疫测定。本发明中，确保捕捉和检测抗体与生物样本中的抗原具有三维接触机会。本发明人已经提出了一种从多聚体形成多肽的单体形式中示差检测多聚体形式的原型方法，称为"多聚体检测系统(MDS)"，并且提交了PCT专利申请(PCT/KR2005/004001)。鉴于实施例XV中显示的灵敏性和鉴别能力，本发明将改进MDS。本发明最突出的特征是使捕捉抗体和检测抗体与生物样本的抗原三维接触。因此，本发明的方法命名为"MDS-3D(三维)系统"。本文所用术语"多聚体形成多肽"指一种多肽，该多肽能够形成聚集(即多聚体)形式，特别是在构象改变之后，引起如阿尔茨海默氏病、克罗伊茨费尔特-雅各布病、海绵状脑病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化、丝氨酸蛋白酶抑制剂缺乏症、肺气肿、肝硬化、II型糖尿病、原发性全身性淀粉样变性、继发性系统性淀粉样变性病、额颞骨痴呆、老年全身性淀粉样变性、家族性淀粉样多神经病、遗传性大脑淀粉样血管病以及与血液透析相关的淀粉样变性病的广泛多种疾病。因此，术语"多聚体形成多肽"与术语"聚集体形成多肽"将可交替使用。本发明方法使用两类抗体，即捕捉抗体和检测抗体。本文所用术语"捕捉抗体"指能够与生物样本中的目的多聚体形成多肽结合的抗体。术语"检测抗体"指能够与捕捉抗体捕获的多聚体形成多肽结合的抗体。"抗体"指能够结合抗原的免疫球蛋白蛋白质。本文所用抗体指包括能够结合目的表位、抗原或抗原片段的完整抗体和任何抗体片段(例如，F(ab，)2、Fab，、Fab、Fv)。本发明中，由捕捉抗体和检测抗体特异性识别的表位在多聚体形成多肽中位于在要与表位结合的抗体之间引起位阻(竟争结合)的位置。优选地，由捕捉抗体识别的表位的氨基酸序列与由检测抗体识别的表位的氨基酸序列相同、重叠或毗连。应该理解，在由捕捉抗体识别的表位的氨基酸序列与由检测抗体识别的表位的氨基酸序列相同或重叠的情况下，要与其表位结合的捕捉抗体和检测抗体S1起位阻或者竟争结合。本文所用术语"重叠"指捕捉抗体和检测抗体的表位包括具有完全或部分重叠的氨基酸序列的表位。例如，T2和3E7抗体的表位分别具有牛朊病毒序列的第147-152位和第140160位氨基酸的氨基酸序歹'J。这种表位可描述成完全重叠的表位。此外，ICSM35和1E4抗体的表位分别具有牛朊病毒序列的第104-113位和第108-119位氨基酸的氨基酸序列。这种表位可描述成部分重叠的表位。至于引起位阻的毗连的表位，在多聚体形成多肽中一个表位(例如，由捕捉抗体识别的表位)可位于除另一表位(例如，由检测抗体识别的表位)之外的一位置，只要两种抗体与毗连的表位竟争结合。本发明的另一特征在于使捕捉抗体与用于制备载体-捕捉抗体结合物的固相载体的表面三维结合。例如，捕捉抗体与用于制备载体-捕捉抗体结合物的三维珠的表面结合。因此，本发明排除了捕捉抗体与板的表面的结合，因为考虑到这种结合是二维的。与载体三维结合的捕捉抗体使其与生物样本中的抗原三维接触，确保与生物样本中的抗原更多的接触机会。与捕捉抗体结合的固相载体可为具有三维结构的任何物质，优选为提通过重力、电荷或磁力可分离的物质。最优选，固相载体为磁珠。根据优选实施方式，检测抗体具有产生可检测信号的标记或亲和物质。该标记包括〗旦不限于酶的(例如，^咸性磷酸酶、过氧化物酶、(3-半乳糖苦酶和(3-葡萄糖苷酶)、放射性的(例如，1125和<:14)、荧光的(例如，荧光素)、发光的、化学发光的和FREET(荧光共振能量转移)标记。亲和物质包括生物素。标记抗体的各种标记和方法是本领域已知的(HarlowandLane,eds.爿w幼0(i/w爿丄a6orato^yMawwa/(1988)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.》在使用放射性标记检测抗体的情况下，本发明最终步骤中形成的抗原-抗体复合物可通过测量标记的放射性而检测。在用催化比色反应的酶标记检测抗体的情况下，抗原-抗体复合物可通过使用酶的底物而检测。例如，在用碱性磷酸酶标记检测抗体的情况下，溴氯吲哚基磷酸酯(BCIP)、硝基四偶氮蓝(NBT)、萘酚-AS-BI-磷酸酯和ECF(增强的化学荧光)可用作显色反应的底物；在用辣根过氧化物酶标记的情况下，可使用氯萘酚、氨乙基咔唑、二氨基联苯胺、D-萤光素、光泽精(双-N-曱基吖啶鐵硝酸盐(bis-N-methylacridiniumnitrate))、试卣灵二曱苯醚、鲁米诺、AmplexRed试剂(10-乙酰基-3,7-二羟吩噁。秦)、TMB(3，3,5,5-四曱基联苯胺)和ABTS(2,2-吖嗪-二[3-乙基苯噻唑啉磺酸酯])作为底物。在用亲和物质标记检测抗体的情况下，形成的抗原-抗体复合物可通过使用其与产生可检测信号的标记连接的结合辅助物而检测(例如，比色反应-催化酶)。例如，在用生物素标记检测抗体的情况下，可使用结合酶的链霉亲和素检测抗原-抗体复合物。上述标记使步骤(d)中定性和定量检测多聚体抗原-抗体复合物可行。在检测抗体连接标记的情况下，通过测量标记产生的信号进行步骤(d)。由捕捉抗体和检测抗体组成的优选抗体组包括作为识别牛朊病毒序列第140~160位氨基酸表位的捕捉抗体的一种抗体和作为识别牛朊病毒序列第147-152位氨基酸表位的检测抗体的其它抗体。另一优选抗体组包括作为识别牛朊病毒序列第104~113位氨基酸表位的捕捉抗体的一种抗体和作为识别牛朊病毒序列第108-119位氨基酸表位的检测抗体的其它抗体。本发明的显著特征在于使载体-捕捉抗体结合物和^r测抗体与生物样本以同时方式接触。如果生物样本开始与捕捉抗体接触然后与检测抗体接触，则载体-捕捉抗体结合物与多聚体形式的多肽中的大多数捕捉抗体表位结合，从而引起检测抗体的结合抑制。因此，在实行分步方案而非同时方案的情况下，检测抗体结合的信号非常弱。相反，在使捕捉抗体和检测抗体与生物样本同时接触的情况下，两类抗体处于竟争情况下并且其与抗原的结合取决于它们的浓度。关于载体-捕捉抗体和4企测抗体的术语"同时接触"指(i)使各载体-捕捉抗体和检测抗体与生物样本以同时方式接触；或(ii)使包含载体-捕捉抗体和4企测抗体的混合物与生物样本接触。根据优选实施方式，在步骤(c)中与载体结合的捕捉抗体和检测抗体以5:11:5的摩尔比、更优选3:11:3的摩尔比、还更优选2:11:2的摩尔比、最优选约1:1的摩尔比(捕捉抗体与检测抗体)使用。在根据MDS-3D双珠系统进行本发明方法的情况下，在步骤(c)中与载体结合的捕捉抗体和与载体结合的检测抗体以5:11:5的摩尔比、更优选3:11:3的摩尔比、最优选约2:1的摩尔比(捕捉抗体与检测抗体)使用。本发明使从任何多聚体形成多肽的单体形式中示差检测多聚体形式成为可能。根据优选实施方式，多聚体形成多肽包括与阿尔茨海默氏病相关的AP肽和Tau蛋白、与克罗伊茨费尔特-雅各布病和海绵状脑病相关的朊病毒、与帕金森氏病相关的a-突触核蛋白、与原发性全身性淀粉样变性相关的Ig轻链、与继发性系统性淀粉样变性病相关的血清淀粉样蛋白A、与额颞骨痴呆相关的Tau蛋白、与老年全身性淀粉样变性相关的运甲状腺素蛋白、与家族性淀粉样多神经病相关的运甲状腺素蛋白、与遗传性大脑淀粉样血管病相关的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、与血液透析相关的淀粉样变性病相关的P2-微球蛋白、与亨廷顿氏病相关的亨廷顿蛋白、与肌萎缩性侧索硬化相关的超氧化物歧化酶、与丝氨酸蛋白酶抑制剂缺乏症、肺气胂和肝硬化相关的丝氨酸蛋白酶抑制剂以及与II型糖尿病相关的糊精。最优选，多聚体形成多肽为引起克罗伊茨费尔特-雅各布病和海绵习犬脑病的朊病毒蛋白质。本发明突出用于检测多聚体朊病毒，即由朊病毒蛋白质构象改变形成的PrPSe。当本发明方法用于朊病毒蛋白质(PrP)时，单体形式为PrPX朊病毒的细胞或正常型)而多聚体形式为PrP&(朊病毒的瘙痒病或有传染性型)。本发明的特征之一在于采用与在抗原分子中具有非重复序列的表位结合的抗体。除非由抗体识别的表位具有非重复序列，否则本发明不能有效从多聚体形成多肽的单体形式中检测多聚体形式。根据优选实施方式，由捕捉抗体特特异性识别的表位和/或由检测抗体特异性识别的表位在多聚体形成多肽中不重复。本发明所用抗体可根据常规技术制备，例如融合方法(KohlerandMilstein，c/owna/q/7wmwwo/ogy,6:511-519(1976》、重组DNA方法(USP4,816,56)或噬菌体抗体文库(Clacksonetal,A^w，352:624-628(1991);和Marksetal,/Mo/.脂.，222:58，1-597(1991))。抗体制备的一般程序如以下文献所述Harlow,E.andLane,D.，爿丄aZora/o^yAfowwa/,ColdSpringHarborPress,NewYork,1988;Zola,H.,Mowoc/owaZ/4w幼oWes..Mawwa/0/7^c/zw々wes，CRCPress,Inc.,BocaRaton，Florida,1984;以及Coligan，CW/^AT尸707UCOLS/iV/MMWO丄(9GT,Wiley/Greene,NY,1991。通过无限增殖细胞系与产生抗体的淋巴细胞的融合进行用于单克隆抗体制品的杂交瘤细胞系的制备。这可通过本领域已知技术进行。多克隆抗体可通过注射上述抗原至适当动物、收集动物中包含抗体的抗血清和经由任何已知亲和技术分离特异抗体而制备。仅若混合的捕捉抗体或检测抗体能分别和与检测抗体或捕捉抗体的表位相同或重叠的表位起反应，本发明还包括使用抗体混合物作为捕捉抗体或检测抗体。如实施例XIII和XIV中所述，本发明使用混合的捕捉抗体或检测抗体可从PrPe中示差检测PrPSe。本文所用术语"生物样本"是待测材料的来自生物体的样本。生物样本指生物源的任何细胞、组织或流体，或者能根据本发明方便评价的任何其他介质，包括取自人的样本、取自动物的样本、取自为人和动物消耗的指定食物样本。优选地，待测生物样本为体液样本，包括血液、血清、血浆、淋巴、乳、尿、粪、目艮内液、唾液、精液、脑提取物(例如，脑匀浆)、脊髓液(SCF)、阑尾、脾和扁桃体组织的提取物。更优选生物样本为脑匀浆或血浆，最优选为血浆。在使用脑匀浆作为生物样本的情况下，本发明方法进一步包括用蛋白酶K(PK)或胰蛋白酶预处理生物样本的步骤，这是有利地。在使用血液或血浆作为生物样本的情况下，优选生物样本不用蛋白酶(例如，PK)预处理。蛋白酶处理导致本发明方法对多聚体形式、尤其是PrpSe的检测和鉴别能力显著下降。令人惊讶的是，本发明方法在检测血液或血浆样本中的PrpSc过程中完全排除了蛋白酶(例如，PK)消化的要求，如实施例X中所述。在使用血液或血浆作为生物样本的情况下，有利的是本发明方法进一步包括用肌氨酰或Triton系(例如，TritonX-1OO)去污剂(优选Triton系、最优选TritonX-100)预处理生物样本的步骤。就生物样本(优选血液，最优选血浆)的制备而言，优选的緩冲液包括TBST(含有吐温20的Tris-緩冲盐水)和三(羟曱基)曱基甘氨酸(Tricine)。优选地，步骤(c)中生物样本(优选血液，最优选血浆)的浓度范围为10v/v%~70v/v%，更优选20v/v%~40v/v%，最优选23v/v%~30v/v%。在本发明的还一技术方案中，提供一种在生物样本中从多聚体形成多肽的单体形式中示差检测多聚体形式的方法，其包括以下步骤(a)通过使捕捉抗体与磁珠的表面以三维方式结合制备磁珠-捕捉抗体结合物，其中，该捕捉抗体能够识别多聚体形成多肽上的表位结合物；(b)制备检测抗体，其中，由该检测抗体识别的表位位于所述多聚体形成多肽中的一个位置而通过捕捉抗体与其表位结合引起位阻，以阻止所述检测抗体与多聚体形成多肽的结合；(c)使所述磁珠-捕捉抗体结合物以及4企测抗体与生物样本同时接触；(d)利用步骤(c)的生成物分离^兹珠-捕捉抗体-多聚体形式-检测抗体复合物；和(e)检测磁珠-捕捉抗体-多聚体形式4企测抗体复合物的形成。优选地，本发明的方法在步骤(d)与步骤(e)之间进一步包括洗涤已分离的捕捉抗体-多聚体形式-检测抗体复合物的步骤。可使用如PBS(磷酸緩冲盐溶液)、PBST(含有吐温ZO的磷酸緩冲盐溶液)、PBSX(含有TritonX-100的磷酸緩冲盐溶液)、TBSX(含有TritonX-100的Tris-緩冲盐水)和TBST(含有吐温20的Tris-緩冲盐水)的各种洗涤緩沖液进行洗涤步骤。最优选，使用TBST进行洗涤步骤。图la示意性表示本发明的使用磁珠作为载体的实施例。将参照图la更加详细描述本发明。使磁珠上的捕捉抗体和HRP-检测抗体与包含Prpc和PrpSe的生物样本同时接触，HRP-结合的检测抗体不能与磁珠-捕捉抗体-结合的Prpe结合，而是仅与磁珠-捕捉抗体-结合的PrpSe结合。另夕卜，磁珠-捕捉抗体也不能与HRP-结合的检测抗体-结合的Prpe结合。捕捉抗体和检测抗体的表位在朊病毒蛋白质中具有非重复序列。由捕捉抗体识别的表位的氨基酸序列与由检测抗体识别的表位的氨基酸序列相同、重复或毗连。图la中，表位表示成三角形。因为由检测抗体识别的表位被捕捉抗体占据，所以检测抗体不能与具有仅一个表位的Prpe结合。然而，由于多聚体朊病毒蛋白质，PrpSe,包括多个特定表位，所以检测抗体可以与捕捉抗体-结合的PrpSe结合。在抗原-抗体反应之后，向反应生成物施加磁场以收集磁珠，接着洗涤收集的珠。使用HRP底物诱导颜色-，荧光-或显色反应并且测量其结果，提供定性和定量分析数据以验证是否形成PrpSe-抗体复合物。根据本发明试剂盒的优选实施方式，与载体结合的捕捉抗体和检测抗体以5:11:5的摩尔比、更优选3:11:3的摩尔比、还更优选2:11:2的摩尔比、最优选约1:1的摩尔比(捕捉抗体与检测抗体)包含在混合物形式中。该试剂盒可进一步包括^磁板、緩冲液、显色酶和底物。本发明的MDS-3D系统分为MDS-3D单珠系统和MDS-3D双珠系统。MDS-3D单珠系统使用捕捉抗体-结合珠(图la)而MDS-3D双珠系统使用捕捉抗体-结合珠和检测抗体-结合珠(图lb和lc)。参照图la已在上文中描述MDS-3D单珠系统。MDS-3D双珠系统中，检测抗体与固相载体的表面三维连接。与载体结合的检测抗体与多聚体多肽以三维方式接触。与检测抗体结合的固相载体可为具有三维结构的任何物质，优选，通过重力、电荷或^f兹力可分离的物质。最优选，固相载体为胶乳珠。载体可被标记。在载体具有标记的情况下(例如，载体为包含荧光物质的胶乳珠)，载体产生的可检测信号(指示多聚体多肽的存在)可无需标记才企测抗体而获得。MDS-3D双珠系统进一步分为"具有单标记的MDS-3D双珠系统，，(图lb)和"具有双标记的MDS-3D双珠系统"(图lc)。在具有单标记的MDS-3D双珠系统中，检测抗体或载体具有产生可检测信号的标记。在具有双标记的MDS-3D双珠系统中，检测抗体和载体都具有产生可#:测信号的标记。这种双标记策略能够双重4全测指示多聚体多肽存在的信号。参照图lb，将更加详细描述具有单标记的MDS-3D双珠系统。使磁珠上的捕捉抗体和荧光(Fluor)-检测抗体(与包含荧光物质的胶乳珠连接的检测抗体)与包含Prpe和PrPSe的生物样本同时接触，并且荧光-检测抗体不能与磁珠-捕捉抗体-结合的Prpc结合，而仅能够与磁珠-捕捉抗体-结合的PrPSe结合。捕捉抗体和检测抗体的表位在朊病毒蛋白质中具有非重复序列。由捕捉抗体识别的表位的氨基酸序列与由检测抗体识别的表位的氨基酸序列相同、重叠或毗连。图lb中，表位表示成三角形。因为由检测抗体识别的表位被捕捉抗体占据，所以检测抗体不能与具有仅一个表位的Prpe结合。然而，由于多聚体朊病毒蛋白质，PrPSe包括多个特定表位，所以检测抗体可以与捕捉抗体-结合的PrPSc结合。在抗原-抗体反应之后，向反应生成物施加,兹场以收集磁i朱，接着洗涤收集的珠。进行测量以分析荧光强度，验证是否形成PrpSe-抗体复合物。参照图lc将更加详细描述具有双标记的MDS-3D双珠系统。使磁珠上的捕捉抗体和荧光-HRP-检测抗体(与包含荧光物质的胶乳珠连接的HRP-结合的检测抗体)与包含PrPe和PrPSe的生物样本同时接触，荧光-检测抗体不能与磁珠-捕捉抗体-结合的Prpe结合，而仅能够与磁珠-捕捉抗体-结合的PrpSe结合。捕捉抗体和检测抗体的表位在朊病毒蛋白质中具有非重复序列。由捕捉抗体识别的表位的氨基酸序列与由检测抗体识别的表位的氨基酸序列相同、重叠或毗连。图lc中，表位表示成三角形。因为由检测抗体识别的表位被捕捉抗体占据，所以检测抗体不能与具有仅一个表位的Prpe结合。然而，由于多聚体朊病毒蛋白质，PrpSc包括多个特定表位，所以检测抗体可以与捕捉抗体-结合的PrpSe结合。在抗原-抗体反应之后，向反应生成物施加磁场以收集磁珠，接着洗涤收集的珠。进行测量以分析荧光强度和HRP反应，验证是否形成PrpSe-抗体复合物。以下具体实施例用来说明本发明，但是不能用来限制如所附权利要求书所定义的本发明的范围。实施例实施例I:使用MDS-3D-单珠系统检测血浆中的多聚体PrP混合2705pl羊血浆、22.5重组多聚体羊PrP(基因型ARQ，120倍稀释)和3605(il的2.5x去污剂(包含3%TritonX-IOO，1.5%脱氧胆酸钠和0.25°/。肌氨酰)以制备样本。还制备包含22.5|ilPBS替代重组多聚体羊PrP的阴性对照。制备捕捉抗体-结合的磁珠，其中l昭捕捉抗体与2.5pi磁珠结合。与磁珠结合的捕捉抗体为3E7或MA1-750单克隆抗体。针对3E7单克隆抗体的表位为Prpc第140-160位氨基S^f列(参照牛朊病毒序列)或第132~152位氨基酸序列(参照羊朊病毒序列)，发现其在朊病毒中是非重复序列。MA1-750抗体特异性识别PrPe上的表位，Ser-Arg-Pro-Leu-Ile-His-Phe-Gly-Ser-Asp-Tyr-Glu-Asp-Arg，发现其在朊病毒中是非重复序列。将捕捉抗体-结合的磁珠和检测抗体与血浆样本以同时的方式温育。然后，确定血浆样本中的重组多聚体羊PrP是否被本发明的MDS-单珠系统检测到。使用3B8/D5-HRP或T2-HRP作为检测抗体。如HirokoHayashi，etal.,/版5W"66(6):515(2004)中所述，T2抗体识别PrPl47~152表位(参照牛朊病毒序列)或PrPi4(M45表位(参照羊朊病毒序列)。针对3B8/D5单克隆抗体的表位是第132-152位氨基酸序列(参照羊朊病毒序列)和第140-160位氨基酸序歹'K参照牛朊病毒序列)。向血浆样本中同时加入捕捉抗体-结合的磁珠和检测抗体并在37。C温育1小时。然后，向反应混合物施加磁场以分离磁珠，接着用TBST洗涤该珠三次。进行ECL(增强的化学发光)检测。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>为了比较，将捕捉抗体-结合的磁珠开始与血浆样本温育然后与检测抗体温育。血浆样本的制备如上文所述。向血浆样本中加入捕捉抗体-结合的》兹i朱并在37。C温育1小时。然后，向反应混合物施加;兹场以分离》兹珠，接着用TBST洗涤该珠三次。然后将分离的珠与检测抗体在37。C温育1小时。向反应混合物施加磁场以分离磁珠，接着用TBST洗涤该珠三次。最后，进行ECL(增强的化学发光)检测。如图2中所示，在将磁珠-捕捉抗体(3E7抗体)和检测抗体(T2-HRP)与样本以同时的方式温育的情况下，针对多聚体PrP的检测信号显示出比分步方案高得多的检测信号，这说明同时方案极大地增强了多聚体朊病毒检测的灵敏性。另外，同时方案中的多聚体朊病毒信号强度与正常朊病毒信号强度的比比分步方案中的高得多，引出本发明显示极好的对多聚体朊病毒的鉴别能力的原因。实施例II:适于MDS-3D-单珠系统的緩冲液类型的确定为了确定本发明MDS-3D-单珠系统中适用的緩冲液类型，以1:1的重量比(0.8吗:0.8fig，基本相当于1:1的摩尔比)使用磁-结合的捕捉抗体(3E7-珠)和检测抗体(T2-HRP)完成MDS-3D-单珠系统。血浆样本制备如下混合120,uld-H20中的10%TritonX-IOO、580,ul緩冲液(TAPS,TBST或三(羟曱基)曱基甘氨酸,pH8.0)和300jil显示具有PrPsc临床征兆的羊血浆以提供总体积1ml包含1.2%TritonX-100和30%血浆的血浆样本。混合2|il(0.8昭)作为捕捉抗体的3E7-结合的磁珠和200|il(0.8吗)作为检测抗体的T2-HRP(TBST中4吗/ml)以制备混合抗体。向1ml血浆样本中加入200pi混合抗体并在37。C温育1小时。然后，向反应混合物施加磁场以分离磁珠，接着用TBST洗涤该珠三次。进行ECL检测(图3a和3b)。图3a和3b中，"N"和"Sc"分别表示正常血浆和包含PrpSe的血浆。如图3a和3b中所示，三(羟曱基)曱基甘氨酸緩冲液对包含Prpse的血浆显示出最强信号而对正常血浆显示出最弱信号。实施例III:使用MDS-3D-双珠系统检测血浆中多聚体PrP混合120pl10%TritonX-100、730(alTBST緩冲液(pH8.0)和150|il羊血浆以提供1ml包含1.2%TritonX-100和15%血浆的血浆样本。混合4jil作为捕捉抗体的3E7-结合的磁珠、2pi作为检测抗体的MAI750-结合的荧光胶乳珠和200(ilTBST緩冲液以制备混合抗体(3E7-珠:MA1750-荧光珠，2:1)。向1ml血浆样本中加入200(il混合抗体并在37。C温育1小时。然后，向反应混合物施加磁场以分离磁珠，接着用TBST洗涤该珠三次。最后，检测荧光信号。如图4中所示，MDS-3D-双珠系统能够示差检测血浆中的PrPSc。实施例IV:适于MDS-3D-双珠系统的緩冲液类型的确定混合4|il作为捕捉抗体的3E7-结合的磁珠和1|^1作为检测抗体的MA1750-结合的荧光胶乳珠以制备混合抗体(3E7-珠:MAl750-荧光珠，4:1)。混合120|il10%TritonX-腦、730pl緩冲液(TBST或三(羟曱基)曱基甘氨酸，pH8.0)和150jil羊血浆以制得血浆样本。其他程序与实施例ni相同。如图5中所示，使用MDS-3D-双珠系统，在血浆样本中检测Prpse，TBST显示出比三(羟曱基)曱基甘氨酸緩沖液更高的信号和鉴别能力。此外，使用T2和MA1抗体分别作为捕捉抗体和检测抗体制成MDS-3D-双珠系统，然后进行上述程序。如图5中所示，使用另一抗体组合的MDS-3D-双珠系统还能够检测血浆中的PrPSc。实施例V:适于MDS-3D-双珠系统的血浆浓度的确定混合2作为捕捉抗体的3E7-结合的磁珠和1^tl作为检测抗体的MA1750-结合的荧光胶乳珠以制备混合抗体(3E7-珠:MAl750-荧光珠，2:1)。制备浓度为30%、15%和7.5%的血浆样本。使用三(羟曱基)曱基甘氨酸(pH8.0)緩冲液。其他程序与实施例III相同。如图6中所示，本发明的MDS-3D-双珠系统能够示差检测浓度为30%、15%和7.5%的全部血浆样本中的PrPSc。然而，当降低血浆浓度时Sc/N的比降低，当降低血浆浓度时，信号强度增加。因此，可以理解MDS-3D-双珠系统中适宜的血浆浓度为约15%。实施例VI:适于MDS-3D-单珠系统的血浆浓度的确定为了确定MDS-3D-单珠系统中适宜的血浆浓度，以1:1的比(0.8吗:0.8i!g)使用磁-结合的捕捉抗体(3E7-珠)和检测抗体(T2-HRP)以完成MDS-3D-单珠系统。制备浓度为30%、15%和7.5%的血浆样本。使用三(羟曱基)曱基甘氨酸(pH8.0)緩冲液。其他程序与实施例II相同。如图7中所示，本发明的MDS-3D-单珠系统能够示差检测浓度为30%、15%和7.5%的全部血浆样本中的PrPSc。当血浆浓度降低时，针对正常血浆和PrP&血浆的Sc/N的比、信号强度都降低。因此，可以理解，适于MDS-3D-单珠系统的血浆浓度约为30%。此夕卜，以1:2的比例使用3E7-珠抗体和T2-HRP抗体并且使用三(羟甲基)曱基甘氨酸(pH8.0)緩冲液制备浓度为30%和100%的血浆样本。其他程序与实施例II相同。如图11中所示，观察到100%血浆浓度比30%血浆浓度产生低得多的信号强度和鉴别。另夕卜，以1:1的比例使用3E7-珠抗体和T2-HRP抗体并且使用三(羟甲基)曱基甘氨酸(pH8.0)緩冲液制备浓度为20%和25%的血浆样本。包含20%和25%血浆样本的反应体积分别为300[xl和4(X)|al。其他程序与实施例II相同。如图12中所示，观察到25%血浆浓度比20%血浆浓度产生高得多的信号强度和鉴别。实施例VII:使用MDS-3D-双珠系统检测血浆中的多聚体PrP以2:1或4:1的比例使用作为捕捉抗体的T2-结合的磁珠和作为检测抗体的MA1750-结合的荧光胶乳珠以完成MDS-3D-双珠系统。使用15°/。血浆样本和TBST(pH8.0)緩冲液。其他程序与实施例III相同。如图8中所示，发现T2-珠与MA1750-珠以4:1的比例的Sc/N的比和信号强度比以2:1的比例的高。实施例VIII:使用不同浓度和类型的去污剂通过MDS-3D-单珠系统才全测血浆中的多聚体PrP除了去污剂条件，以与实施例II相同的方式使用不同浓度和类型的去污剂通过MDS-3D-单珠系统检测显示出具有PrPse临床征兆的羊血浆样本中的多聚体PrP。如图9中所示，TritonX-100的浓度(1%,1.5%和2。/。)显示出对多聚体PrP相似的检测和示差结果。另夕卜，尽管结果偏差相对较高，Np-40(USBCorp.,USA)也显示了相当的检测和示差结果。Np-40是一种非离子去污剂且表示[辛基苯氧基]聚乙氧基乙醇。实施例IX:使用不同类型的洗涤緩冲液通过MDS-3D-单珠系统检测血浆中的多聚体PrP除了抗体重量比(3E7-珠:T2-HRP,l:2)和洗涤条件之外，以与实施例II相同的方式，使用不同类型的用于洗涤与血浆样本和抗体温育的珠的洗涤緩冲液通过MDS-3D-单珠系统检测含有Prpse的羊血浆样本中的多聚体PrP。如图IO中所示，与其他緩沖液，PBST(含有吐温20的磷酸緩冲盐溶液)、PBSX(含有TritonX-100的磷酸緩冲盐溶液)和TBSX(含有TritonX-100的Tris-緩冲盐水)相比，TBST(含有吐温20的Tris-緩冲盐水)洗涤緩冲液显示出最优异的多聚体PrP的^^r测和示差结果。实施例X:PK消化对使用MDS-3D-单珠系统检测血浆中的多聚体PrP的影响除了抗体重量比(3E7-珠:T2-HRP，1:4)之外，以与实施例II相同的方式，进行或没有PK(蛋白酶K)消化，通过MDS-3D-单珠系统检测含有Prpse的羊血浆样本中的多聚体PrP。如图13所示，PK消化极大降低了针对血浆样本中的PrpSe的信号强度。在这一点，可确认，本发明的MDS-3D-单珠系统能够在检测血液或血浆样本中的PrpSe时完全排除PK消化的需要。实施例XI:使用不同重量比的抗体通过MDS-3D-单珠系统检测血浆中的多聚体PrP以与实施例II相同的方式，使用不同重量比的抗体通过MDS-3D-单珠系统检测含有Prpsc的羊血浆样本中的多聚体PrP。3E7-珠捕捉抗体与T2-HRP检测抗体的重量比为4:1、2:1、1.33:1和1:1。如图14a中所示，在以相同的量使用两种抗体的情况下，本发明的MDS-3D-单珠系统显示出最优异的对血浆样本中的PrPsc的检测和鉴别能力。实施例XII:使用不同重量比的抗体通过MDS-3D-双珠系统检测血浆中的多聚体PrP以与实施例III相同的方式，使用不同重量比的抗体通过MDS-3D-双珠系统检测含有Prpse的羊血浆样本中的多聚体PrP。3E7-珠捕捉抗体与MA1750荧光J朱4企测抗体的重量比为4:1和2:1。如图14b中所示，在以2:1的比例使用捕捉抗体与检测抗体的情况下，本发明的MDS-3D-双珠系统显示出最优异的对血浆样本中的PrPsc的检测和鉴别能力。实施例XIII:使用捕捉抗体混合物通过MDS-3D-单珠系统检测血浆中的多聚体PrP以与实施例II相同的方式，使用捕捉抗体混合物通过MDS-3D-单珠系统检测含有PrPse的羊血浆样本中的多聚体PrP。使用由3E7-珠与T厶珠抗体(图Ua)或SE:珠与MAl-珠抗体(图1化)组成的捕捉抗体混合物作为捕捉抗体。捕捉抗体混合物与检测抗体T2-HRP的重量比为1:1。如图15a和15b所示，捕捉抗体混合物同样显示出优异的对血浆样本中的PrPse的检测和鉴别能力。实施例XIV:使用检测抗体混合物通过MDS-3D-单珠系统检测血浆中的多聚体PrP以与实施例II相同的方式，使用检测抗体混合物通过MDS-3D-单珠系统检测含有Prpse的羊血浆样本中的多聚体PrP。所用抗体组为(i)3E7-珠作为捕捉抗体且T2-生物素与MAl-生物素作为检测抗体混合物以及(ii)MAl-珠作为捕捉抗体且T2-生物素和3E7-生物素作为检测抗体混合物。如图15c中所示，检测抗体混合物同样显示出优异的对血浆样本中的prpse的检测和鉴别能力。实施例XV:在相同条件下MDS与MDS-3D-单珠系统的检测能力的比较_本发明人已经提出了从多聚体形成多肽的单体形式中示差检测多聚体形式的原型方法，称为"多聚体检测系统(MDS)"，并提交了PCT专利申请(PCT/KR2005/004001)。为了以可靠方式比较MDS与MDS-3D单珠系统的PrP"检测和鉴别能力，在相同实验条件下，按照各程序检测含有Prpse的羊血浆样本中的多聚体PrP。分别使用3E7和T7抗体作为捕捉抗体和检测抗体。如图16中所示，明显看出，与MDS相比，本发明的MDS-3D单珠系统显示出更高的对羊血浆样本中的PrP"的灵敏度和鉴别能力。实施例XVI:适于使用其他抗体组的MDS-3D-单珠系统的血浆浓度的确定除了抗体组的类型和血浆浓度之外，以与实施例II相同的方式通过MDS-3D-单珠系统检测含有PrPsc的羊血浆样本中的多聚体PrP。使用ICSM35-生物素链霉亲和素珠作为捕捉抗体以及1E4-HRP作为检测抗体。羊血浆的浓度为25%。ICSM35抗体(D-Gen，Inc.)识别对应于第96105位氨基酸序列(参照羊朊病毒序列)或第104~113位氨基酸序列(参照牛朊病毒序歹'j)的表位。1E4抗体(SanquinReagents,Inc.)识别对应于第100-111位氨基酸序歹'J(参照羊朊病毒序列)或第108~119位氨基酸序列(参照牛朊病毒序列)的表位。如图17中所示，识别部分重叠表位的另一抗体组同样显示出优异的对血浆样本中的PrPse的灵敏性和鉴别能力。已描述了本发明的优选实施方式，可以理解，对本领域技术人员来说落入本发明实质范围的变形和修改是明显的，并且本发明的范围由所述权利要求书及其等同物确定。权利要求1、一种在生物样本中从多聚体形成多肽的单体形式中示差检测多聚体形式的方法，该方法包括以下步骤(a)通过将捕捉抗体与固相载体的表面以三维方式结合制备载体-捕捉抗体结合物，其中，所述捕捉抗体能够识别所述多聚体形成多肽上的表位；(b)制备检测抗体，其中，由所述检测抗体识别的表位位于所述多聚体形成多肽中的一个位置而通过捕捉抗体与其表位结合引起位阻，以阻止所述检测抗体与多聚体形成多肽的结合；(c)使所述载体-捕捉抗体结合物以及检测抗体与生物样本同时接触；(d)检测载体-捕捉抗体-多聚体形式-检测抗体复合物的形成。2、根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测抗体与所述固相载体的表面以三维方式结合。3、根据权利要求1所述的方法，其中，所述多聚体形成多肽选自由A(3肽、P-淀粉状蛋白、Tau蛋白、朊病毒、oc-突触核蛋白、Ig轻链、血清淀粉样蛋白A、运曱状腺素蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、(32-微球蛋白、亨廷顿蛋白、超氧化物歧化酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂和糊精组成的组中。4、根据权利要求3所述的方法，其中，所述多聚体形成多肽为朊病毒o5、根据权利要求4所述的方法，其中，所述单体形式为Prpe而所述多聚体形式为PrpSe。6、根据权利要求1所述的方法，其中，由所述捕捉抗体识别的表位的氨基酸序列与由所述检测抗体识别的表位的氨基酸序列相同、重叠或邮匕连。7、根据权利要求1所述的方法，其中，由所述捕捉抗体识别的表位在所述多聚体形成多肽中不重复。8、根据权利要求1所述的方法，其中，由所述检测抗体识别的表位在所述多聚体形成多肽中不重复。9、根据权利要求1所述的方法，其中，与所述捕捉抗体结合的固相载体为》兹珠。10、根据权利要求2所述的方法，其中，与所述检测抗体结合的固相载体为胶乳珠。11、根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测抗体具有产生可才企测信号的标记。12、根据权利要求2所述的方法，其中，与所述捕捉抗体结合的标记。13、根据权利要求11所述的方法，其中，通过;f企测与所述检测抗体连接的标记产生的信号进行所述步骤(d)。14、根据权利要求12所述的方法，其中，通过检测与所述载体-捕捉抗体结合物连接的标记产生的信号进行所述步骤(d)。15、根据权利要求11或12所述的方法，其中，所述与检测抗体连接的标记为化学的、酶的、放射性的、荧光的、发光的、化学发光的和FREET标记。16、根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物样本为脑匀浆或血液。17、根据权利要求16所述的方法，其中，所述生物样本为血液。18、根据权利要求17所述的方法，其中，所述生物样本为血浆。19、根据权利要求16所述的方法，其中，在使用脑匀浆作为所述生物样本时，所述方法进一步包括用蛋白酶K或胰蛋白酶预处理所述生物样本。20、根据权利要求1所述的方法，其中，在所述步骤(c)中以2:11:2摩尔比的捕捉抗体与检测抗体使用与载体结合的捕捉抗体和检测抗体。21、一种用于在生物样本中从多聚体形成多肽的单体形式中示差检测多聚体形式的试剂盒，其包括(a)捕捉抗体，该捕捉抗体识别所述多聚体形成多肽上的表位并与固相载体的表面三维结合；以及(b)检测抗体，该检测抗体识别存在于所述多聚体形成多肽中的一个位置的表位，通过所述捕捉抗体与其表位结合引起位阻从而阻止所述检测抗体与多聚体形成多肽结合。22、根据权利要求21所述的试剂盒，其中，所述检测抗体与固相载体的表面以三维方式结合。23、根据权利要求21所述的试剂盒，其中，所述多聚体形成多肽选自由A卩肽、P-淀粉状蛋白、Tau蛋白、朊病毒、a-突触核蛋白、Ig轻链、血清淀粉样蛋白A、运曱状腺素蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、P2-微球蛋白、亨廷顿蛋白、超氧化物歧化酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂和糊精组成的组中。24、根据权利要求23所述的试剂盒，其中，所述多聚体形成多肽为朊病毒。25、根据权利要求24所述的试剂盒，其中，所述单体形式为Prpe而所述多聚体形式为PrPSe。26、根据权利要求21所述的试剂盒，其中，由所述捕捉抗体识别的表位的氨基酸序列与由所述检测抗体识别的表位的氨基酸序列相同、重叠或曰比连。27、根据权利要求21所述的试剂盒，其中，由所述捕捉抗体识别的表位在所述多聚体形成多肽中不重复。28、根据权利要求21所述的试剂盒，其中，由所述检测抗体识别的表位在所述多聚体形成多肽中不重复。29、根据权利要求21所述的试剂盒，其中，与所述捕捉抗体结合的固相载体为磁珠。30、根据权利要求22所述的试剂盒，其中，与所述检测抗体结合的固相载体为胶乳珠。31、根据权利要求21所述的试剂盒，其中，所述检测抗体具有产生可检测信号的标记。32、根据权利要求22所述的试剂盒，其中，与所述捕捉抗体结合的才示i己。33、根据权利要求31或32所述的试剂盒，其中，所述与检测抗体连接的标记为化学的、酶的、放射性的、荧光的、发光的、化学发光的和FREET标记。34、根据权利要求21所述的试剂盒，其中，所述生物样本为脑匀浆或血液。35、根据权利要求34所述的试剂盒，其中，所述生物样本为血液。36、根据权利要求35所述的试剂盒，其中，所述生物样本为血浆。37、根据权利要求34所述的试剂盒，其中，在使用脑匀浆作为所述生物样本时，所述试剂盒进一步包括蛋白酶K或胰蛋白酶。38、根据权利要求21所述的试剂盒，其中，以2:11:2摩尔比的所述捕捉抗体与检测抗体的混合物形式包含与载体结合的捕捉抗体和才企测抗体。全文摘要本发明涉及在生物样本中从多聚体形成多肽的单体形式中示差检测多聚体形式的方法，其包括以下步骤(a)通过将捕捉抗体与固相载体的表面以三维方式结合制备载体-捕捉抗体结合物，其中，所述捕捉抗体能够识别所述多聚体形成多肽上的表位；(b)制备检测抗体，其中，由所述检测抗体识别的表位位于所述多聚体形成多肽中的一个位置而通过捕捉抗体与其表位结合引起位阻，以阻止所述检测抗体与多聚体形成多肽的结合；(c)使所述载体-捕捉抗体结合物以及检测抗体与生物样本同时接触；和(d)检测载体-捕捉抗体-多聚体形式-检测抗体复合物的形成。文档编号G01N33/49GK101427132SQ200780014413公开日2009年5月6日申请日期2007年4月20日优先权日2006年4月21日发明者吴炫姃,安性洙,林君泽申请人:人民生物公司