专利名称：监测大分子构象转变和靶与探针分子生化反应方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种监测大分子构象转变和生化反应的方法及装置，特别涉及一 种采用微悬臂梁阵列监测大分子构象转变和靶分子与探针分子生化反应的方法 及装置。
背景技术：
经过表面化学处理后修饰了大分子或探针分子的微悬臂梁，当环境改变(如 温度、PH等)导致大分子构象转变或当有生化反应在其表面发生时(如待检测 样品中的靶分子与微悬臂梁上的探针分子发生生化反应时)，微悬臂梁的表面应 力(也就是表面能)会发生变化从而导致微悬臂梁产生弯曲变形，通过检测这种 变形就可以知道整个分子构象转变或生化反应进行过程的信息。与传统的荧光标 记和同位素标记相比，具有非标记、整个反应过程的实时监测、灵敏度高等特点。 在发明专利一种监测分子构象转变的方法(申请号200510134675.6)和一 种利用微悬臂梁进行生化检测的方法及装置(申请号200410103903.9)中分别 提出了利用光杠杆原理检测分子构象转变或生化反应导致微悬臂梁的弯曲变形。 激光束聚焦在微悬臂梁的自由端，反射光束被光电位置敏感器(PSD)接收并形 成可见反射光斑，当微悬臂梁弯曲变形时，反射光束发生偏转，相应的PSD上光 斑的位置会发生位移，此位移就对应微悬臂梁的弯曲变形。但是在该发明的光路 下有以下缺点当反应容器内的缓冲溶液被引起分子构象转变的环境溶液或待测 溶液置换时，由于溶液折射率的微小变化，会导致反射光束发生偏转，即检测的 信号中耦合有溶液折射率改变导致的噪声信号(Bumbu G G, Wolkenhauer M, et al. Micromechanical cantilever technique: A tool for investigating the swelling of polymer brushes [J]. Langmuir 2007, 23: 2203-2207);而且只 适用于单根微悬臂梁，即一次实验只能检测一根微悬臂梁的变形信号。
在发明专利一种微悬臂梁阵列生物芯片(申请号200610078269.7)提出了 利用光学滤波的方法对微悬臂梁阵列中微悬臂梁的位移进行检测。平行光束照射 在微悬臂梁阵列，反射光束经过4f滤波系统后被电荷耦合器件(CCD)接收并形 成可见反射光斑阵列，当微悬臂梁弯曲变形时，CCD上光斑的光强会发生变化，
此变化就对应微悬臂梁的弯曲变形，从而确定微悬臂梁上生化反应的情况。但是 这种检测方法受杂散光和光源光强变化的影响较大。
发明内容
本发明是为避免上述所存在的不足之处，提供一种通过同时检测多根微悬臂 梁变形信号来监测大分子构象转变和靶分子与探针分子生化反应的方法及装置， 检测得到的信号没有耦合折射率改变和光源光强变化导致的噪声信号；通过线偏 光照明技术，大大降低了杂散光的影响。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是
一种监测大分子构象转变和靶分子与探针分子生化反应的方法，其特征是将
大分子、不同或相同的探针分子中的任一种或多种修饰在微悬臂梁阵列中不同微 悬臂梁的单侧表面；在大分子未发生构象转变、探针分子未结合靶分子的情况下，
光源发出的平行光入射到所述的微悬臂梁上，其垂直于微悬臂梁上受光面的平行 光被反射后，被光学接收装置接收形成反射光斑阵列，各反射光斑与各微悬臂梁 的受光面一一对应；当环境条件改变导致微悬臂梁单侧表面的大分子构象转变或 者微悬臂梁单侧表面的某种探针分子与待测溶液中的靶分子发生结合时，该微悬 臂梁发生弯曲变形，转角改变，反射光会随之发生偏转，相应的反射光斑的位置 也会随之发生位移；在引起分子构象转变的环境条件下，检测已修饰大分子的微 悬臂梁的位移与未修饰所述大分子的微悬臂梁位移之差，来判断大分子的构象转 变情况；根据相同背景条件下探针分子未结合靶分子时与结合靶分子后，各微悬 臂梁对应的反射光斑的位置变化与位移大小，来判断待测溶液中与探针分子对应 的靶分子的有无或者浓度的大小。
所述的监测大分子构象转变和靶分子与探针分子生化反应的方法，其特征在 是所述引起分子构象转变的环境条件包括温度、压力、光线照射、外加电磁场 的改变等物理因素；以及包括有机溶剂、脲、胍、pH值、离子浓度等化学因素。
所述的监测大分子构象转变和靶分子与探针分子生化反应的方法，其特征
是所述的相同背景条件包括温度、ra值、离子浓度等。
所述的监测大分子构象转变和靶分子与探针分子生化反应的方法，其特征 是所述大分子包括各种合成大分子和天然大分子；所述探针分子包括抗原、抗 体、凝集素、糖、亲和素、生物素、受体、配位体和DNA等。
所述合成大分子如聚N-异丙基丙烯酰胺，和天然大分子如蛋白质。
所述的监测大分子构象转变和靶分子与探针分子生化反应的方法，其特征 是为了提高探测灵敏度，所述的微悬臂梁具有一定的初始转角，垂直于微悬臂 梁上受光面的平行光被反射后，被光学接收装置接收。
所述的监测大分子构象转变和靶分子与探针分子生化反应的方法，其特征是 所述的受光面是位于微悬臂梁上的反光板，反光板位于微悬臂梁的自由端。
所述的监测大分子构象转变和靶分子与探针分子生化反应的方法，其特征 是所述微悬臂梁厚度可为O. 1-2um，长度可为40-1000 um，宽度大于等于20 U m。
所述的监测大分子构象转变和靶分子与探针分子生化反应的方法，其特征 是所述微悬臂梁阵列可按常规方法在硅片或玻璃片基板(厚度可为200- 1000 ym)上用SiNx、 Si02、 Si等薄膜材料刻蚀制作而成，如用MEMS工艺制作。
所述的监测大分子构象转变和靶分子与探针分子生化反应的方法，其特征 是光源发出的光经过滤波针孔后，再经过准直透镜变成平行光，平行光经过起 偏器后得到线偏振光束，线偏振光束投射到偏振分光镜上，经过偏振分光镜反射 后，经过1/4波片，到达所述的微悬臂梁受光面被反射返回，再次经过前述的 1/4波片，共两次经过l/4波片，偏振方向改变::/2，然后透过所述的偏振分光 镜后，被光学接收装置接收，形成反射光斑阵列，同时其他偏振态的杂光被抑制。
所述的监测大分子构象转变和靶分子与探针分子生化反应的方法，其特征 是所述光学接收装置为电荷耦合器件(CCD)。
所述的监测大分子构象转变和靶分子与探针分子生化反应的方法，其特征 是所述光源为400nm-700nm范围内的单色光源。
一种监测大分子构象转变和靶分子与探针分子生化反应的装置，其特征在 于包括有光源，光源后的光路中依次有滤波针孔、准直透镜、起偏器、偏振分 光镜，偏振分光镜后的反射光路中安装有反应容器，反应容器顶部盖有l/4波片， 反应容器内安装有微悬臂梁阵列，将大分子、不同或相同的探针分子中的任一种 或多种修饰在微悬臂梁阵列中的不同微悬臂梁的单侧表面，所述的偏振分光镜后 的透射光路中安装有光学接收装置。
所述的监测大分子构象转变和靶分子与探针分子生化反应的装置，其特征在
于所述的偏振分光镜后的透射光路中有透镜位于光学接收装置之前，光学接收 装置的靶面位于反光板的像平面之外。
已有技术中，通常微悬臂梁是由双层材料组成， 一层是氮化硅或硅，另一层 是金， 一般是在金表面修饰大分子或探针分子。
本发明采用由多个微悬臂梁组成的微悬臂梁阵列，将大分子、不同或相同的 探针分子中的一种或多种修饰在微悬臂梁阵列中不同微悬臂梁的单侧表面，也即 是将大分子修饰在微悬臂梁阵列中一个或多个微悬臂梁的单侧表面；或者将一种 或多种(不同种)探针分子分别修饰在微悬臂梁阵列中一个或多个微悬臂梁的单 侧表面。
本发明中，根据引起分子构象转变的环境条件下，检测已修饰大分子的微悬 臂梁的位移与未修饰所述大分子的微悬臂梁位移之差，来判断大分子的构象转变 情况；根据相同背景条件下探针分子未结合靶分子时与结合耙分子后，各微悬臂 梁对应的反射光斑的位置变化与位移大小，判断待测溶液中的与探针分子对应的 耙分子的有无或者浓度的大小；需要事先在某一引起分子构象转变的环境条件下 对分子构象转变与反射光斑的位移之间的关系进行标定或者在某一背景条件下 对靶分子浓度与反射光斑的位移之间的关系进行标定。得到标定好的数据库后， 再根据实验得到的数据进行对比判断。
本发明的创新点在于
1、 实现了对微悬臂梁阵列中每根微悬臂梁变形的同时检测，从而实现了对 每根微悬臂梁上生化反应的监测。将不同的探测分子利用逐点喷涂的方法修饰到 不同的微悬臂梁的单侧表面上，可以探测多种相应的靶分子，即实现多种生化反 应的监测。
2、 将大分子修饰在部分微悬臂梁的单侧表面，其余微悬臂梁不修饰，可以 同时得到引起分子构象转变的相同环境条件下，已修饰所述大分子的微悬臂梁的 位移和未修饰所述大分子的微悬臂梁位移。
3、 通过平行光束垂直入射到受光面，消除了溶液折射率的变化产生的噪声 信号。
4、 通过线偏光照明技术，大大减小了杂散光的影响。
5、 由于检测的是位移变化，检测灵敏度不受光强变化的影响。6、由于微悬臂梁具有初始转角，光学接受装置上的可见反射光斑主要是由 受光面(反光板)反射得到，提高了检测精度。
图1是本发明方法光学检测实施方式之一结构示意图。 图2是实施方式之一的光斑位移示意图。 图3是本发明方法光学检测实施方式之二结构示意图。 图4是实施方式之二的光斑位移示意图。
图5是光束经过偏振分光镜5和1/4波片6后偏振态的变化示意图。 图6是微悬臂梁阵列及其放大图。
图7是靶分子与探针分子发生生化反应导致微悬臂梁弯曲变形示意图。
图8是大分子发生构象转变，引起微悬臂梁变形的示意图。
图9是平行光照射在具有初始转角的微悬臂梁上的反射示意图。
图10是在实施方式之二下CCD上得到的可见反射光斑图。
图11是可见反射光斑在CCD上的位移示意图。
图中标号1、光源，2、滤波针孔，3、准直透镜，4、起偏器，5、偏振分光镜， 6、 1/4波片，7、反应容器，8、微悬臂梁阵列，9、蠕动泵，10、恒温系统，11、 透镜，12 、光学接受装置，13、微悬臂梁，14、反光板。
以下通过具体实施方式
，并结合附图对本发明作进一步描述。
具体实施例方式
图2显示的是实施方式之一的光斑位移示意图，实线为初始状态下反射光 束的路径，虚线为微悬臂梁发生弯曲变形后反射光束的路径，CCD耙面上相应的 光斑发生位移。
图4显示的是实施方式之二的光斑位移示意图，实线为初始状态下反射光 束的路径，虚线为微悬臂梁发生弯曲变形后反射光束的路径，CCD耙面上相应的 光斑发生位移。
图5显示的是光束经过偏振分光镜5和1/4波片6后偏振态的变化示意图， 线偏振照明光投射到偏振分光镜5后，P偏振光发生透射，S偏振光被反射，反 射光经过l/4波片6， 1/4波片6的快轴方向与S偏振光的偏振方向成45"，因此 S偏振光变成圆偏光入射到微悬臂梁阵列8上并反射返回，再次经过前述的1/4
波片6，偏振方向改变Jl/2变成P偏振光，刚好被偏振分光镜5透射，同时其他 偏振态的杂光被抑制。
图6显示的是微悬臂梁阵列及其放大图，微悬臂梁13可以是单腿支撑的矩 形梁，也可以是双腿支撑的三角梁，在微悬臂梁13的自由端连接有反光板14。
图7显示的是微悬臂梁单侧表面修饰的探针分子与待测溶液中的靶分子发 生生化反应，引起微悬臂梁变形的示意图。
图8显示的是微悬臂梁单侧表面修饰的大分子发生构象转变，引起微悬臂梁 变形的示意图。
图9显示的是平行光照射在具有初始转角的微悬臂梁上的反射示意图，平行 入射光垂直于反光板的表面，照射在微悬臂梁上的光线发生散射，只有照射在反 光板的光线才能垂直反射被CCD靶面接收。
图10显示的是在实施方式之二下CCD上得到的可见反射光斑图，每个光斑 都与微悬臂梁的受光面一一对应。
图11显示的是可见反射光斑在CCD上的位移示意图。实线光斑代表微悬臂 梁变形前光斑的位置，虚线光斑代表微悬臂梁变形后光斑的位置。光斑的左、右 移动分别与微悬臂梁的上、下弯曲变形相对应，光斑没有移动代表微悬臂梁没有 发生弯曲变形。
监测靶分子与探针分子生化反应
微悬臂梁阵列8置于顶部为1/4波片6的反应容器7中，微悬臂梁的单侧 表面上修饰探针分子，通过与容器底部接触的恒温系统10控制反应容器的温度， 其温度稳定度为士0.01K，待测溶液通过蠕动泵9进出反应容器7。当含有靶分 子的溶液进入反应容器7时，探针分子和耙分子发生生化反应，导致微悬臂梁的 弯曲变形，此变形可由光学检测装置检测。
监测分子构象转变
例1:
微悬臂梁阵列8置于顶部为1/4波片6的反应容器7中，部分微悬臂梁的 单侧表面上修饰聚N-异丙基丙烯酰胺，通过与容器底部接触的恒温系统10控制 反应容器的温度，其温度稳定度为土0.01K。当通过恒温系统10改变反应容器的 温度时，聚N-异丙基丙烯酰胺分子的构象会发生改变，从而导致微悬臂梁的弯
曲变形，此变形可由光学检测装置检测。 例2:
微悬臂梁阵列8置于顶部为1/4波e 6的反应容器7中，部分微悬臂梁的 单侧表面上修饰胰蛋白酶，反应容器7内充满PBS溶液，通过与容器底部接触的 恒温系统IO控制反应容器的温度，其温度稳定度为土0.01K。当通过蠕动泵9将 PBS溶液置换为盐酸胍溶液时，胰蛋白酶分子的构象会发生改变，从而导致微悬 臂梁的弯曲变形，此变形可由光学检测装置检测。
光学检测实施方式之一
参见图l、图2和图5，滤波针孔2放置在光源1的后方，滤波针孔2正好 位于准直透镜3的前焦点，光线被准直透镜3准直为平行照明光束，在形成的平 行照明光束中加入起偏器4后得到线偏振照明光。线偏振照明光投射到偏振分光 镜5后，P偏振光发生透射，S偏振光被反射，反射光经过l/4波片6，而且1/4 波片6的快轴方向与S偏振光的偏振方向成45"，因此S偏振光变成圆偏光入射 到微悬臂梁阵列8上，垂直于微悬臂梁13上反光板14的平行入射光被垂直反射 返回，再次经过前述的1/4波片6，共两次经过l/4波片6，偏振方向改变n/2 变成P偏振光，刚好被偏振分光镜5透射，同时其他偏振态的杂光被抑制。透过 偏振分光镜5的测量光由光学接受装置12接收，形成可见反射光斑阵列且光斑 与微悬臂梁的受光面一一对应。根据光斑阵列的位移来判断对应微悬臂梁的弯曲 变形，光斑的位移可以通过相关算法得到。由于微悬臂梁具有初始转角，照射在 微悬臂梁13上的光束会发生散射，光学接受装置12上的可见反射光斑主要是由 反光板14反射得到。
光学检测实施方式之二
参见图3、图4和图5，与光学检测实施方式之二相比，在偏振分光镜5和 光学接受装置12之间放置透镜11，即携带微悬臂梁变形信息的测量光透过偏振 分光镜5后经过透镜11再由光学接受装置12接收。且光学接受装置靶面与像 平面没有重合，有一定的散焦。只有这样，当微悬臂梁发生弯曲变形时，光学接 受装置12接受的可见反射光斑才会产生位移。
假设微悬臂梁的端部转角改变e，对应CCD靶面上光斑的位移为As，贝lj: 实施方式之一Aya2^.丄，Z为反光板到CCD靶面的距离；
实施方式之二 A5a2fflf(;-1)， "、 /和"分别为反光板到透镜11的距
离、透镜ll的焦距和散焦距离。
在典型的光路参数A =50mm， /=100mm， " =2/， d=0. 5/下，两种实施方 式的检测灵敏度相同。由于衍射的存在，实施方式之一得到的光斑比实施方式之 二大好几倍，为了在CCD靶面上将各个光斑分离开，在实施方式之一下使用的微 悬臂梁阵列中微悬臂梁之间的距离要足够大。
权利要求
1.一种监测大分子构象转变和靶分子与探针分子生化反应的方法，其特征是将大分子、不同或相同的探针分子中的任一种或多种修饰在微悬臂梁阵列中不同微悬臂梁的单侧表面；在大分子未发生构象转变、探针分子未结合靶分子的情况下，光源发出的平行光入射到所述的微悬臂梁上，其垂直于微悬臂梁上受光面的平行光被反射后，被光学接收装置接收形成反射光斑阵列，各反射光斑与各微悬臂梁的受光面一一对应；当环境条件改变导致微悬臂梁单侧表面的大分子构象转变或者微悬臂梁单侧表面的某种探针分子与待测溶液中的靶分子发生结合时，该微悬臂梁发生弯曲变形，转角改变，反射光会随之发生偏转，相应的反射光斑的位置也会随之发生位移；在引起分子构象转变的环境条件下，检测已修饰大分子的微悬臂梁的位移与未修饰所述大分子的微悬臂梁位移之差，来判断大分子的构象转变情况；根据相同背景条件下探针分子未结合靶分子时与结合靶分子后，各微悬臂梁对应的反射光斑的位置变化与位移大小，来判断待测溶液中与探针分子对应的靶分子的有无或者浓度的大小。
2、 根据权利要求1所述的监测大分子构象转变和靶分子与探针分子生 化反应的方法，其特征在是所述引起分子构象转变的环境条件包 括温度、压力、光线照射、外加电磁场的改变等物理因素；以及包 括有机溶剂、脲、胍、PH值、离子浓度等化学因素；所述的相同背 景条件包括温度、PH值、离子浓度等。
3、 根据权利要求1所述的监测大分子构象转变和靶分子与探针分子生 化反应的方法，其特征是所述大分子包括各种合成大分子和天然 大分子；所述探针分子包括抗原、抗体、凝集素、糖、亲和素、生 物素、受体、配位体和DNA等。
4、 根据权利要求3所述的监测大分子构象转变和靶分子与探针分子生 化反应的方法，其特征是所述合成大分子如聚N-异丙基丙烯酰胺， 和天然大分子如蛋白质。
5、 根据权利要求1所述的监测大分子构象转变和耙分子与探针分子生 化反应的方法，其特征是所述的微悬臂梁具有一定的初始转角，垂 直于微悬臂梁上受光面的平行光被反射后，被光学接收装置接收。
6、 根据权利要求1或5所述的监测大分子构象转变和靶分子与探针分 子生化反应的方法，其特征是所述的受光面是位于微悬臂梁上的反 光板，反光板位于微悬臂梁的自由端。
7、 根据权利要求1所述的监测大分子构象转变和靶分子与探针分子生 化反应的方法，其特征是光源发出的光经过滤波针孔后，再经过 准直透镜变成平行光，平行光经过起偏器后得到线偏振光束，线偏 振光束投射到偏振分光镜上，经过偏振分光镜反射后，经过l/4波 片，到达所述的微悬臂梁受光面被反射返回，再次经过前述的1/4 波片，共两次经过l/4波片，偏振方向改变Ji/2，然后透过所述的 偏振分光镜后，被光学接收装置接收，形成反射光斑阵列，同时其 他偏振态的杂光被抑制。
8、 一种监测大分子构象转变和靶分子与探针分子生化反应的装置，其特征在于包括有光源，光源后的光路中依次有滤波针孔、准直透镜、起偏器、偏振分光镜，偏振分光镜后的反射光路中安装有反应容器，反应容器顶部盖有1/4波片，反应容器内安装有微悬臂梁阵歹lj，将大分子、不同或相同的探针分子中的任一种或多种修饰在微 悬臂梁阵列中的不同微悬臂梁的单侧表面，所述的偏振分光镜后的透射光路中安装有光学接收装置。
9、 根据权利要求9所述的监测大分子构象转变和靶分子与探针分子生化反应的装置，其特征在于所述的偏振分光镜后的透射光路中有透镜位于光学接收装置之前，光学接收装置的靶面位于反光板的像平面之外。
全文摘要
本发明公开了一种监测大分子构象转变和靶分子与探针分子生化反应的方法及装置，将大分子、不同或相同的探针分子中的任一种或多种修饰在微悬臂梁阵列中不同微悬臂梁的单侧表面，光源发出的平行光入射到微悬臂梁上，反射光被光学接收装置接收形成反射光斑阵列并与微悬臂梁一一对应，当大分子发生构象转变或探针分子与待测溶液中的靶分子发生结合时，该微悬臂梁发生弯曲变形，反射光会随之发生偏转，相应的反射光斑的位置也会随之发生位移，根据各微悬臂梁所对应的反射光斑的位置变化与位移大小，来判断大分子的构象转变情况或待测溶液中与探针分子对应的靶分子的有无或者浓度的大小。该发明能实现多根微悬臂梁位移信号的同时监测，同时消除了折射率改变和光源光强变化产生的噪声信号；通过对测量光束偏振态的控制大大降低了杂散光的影响，提高了测量精度。
文档编号G01N21/17GK101373175SQ200810022379
公开日2009年2月25日 申请日期2008年6月28日 优先权日2008年6月28日
发明者伍小平, 红 刘, 张青川, 凯 李, 陈大鹏, 渊 黄 申请人:张青川