专利名称：肌钙蛋白Ⅰ血清快速检测试剂盒(胶体金法)的制作方法
肌转蛋白I血溏快速检獮试剂盒(胶体金法)
扶术領械
本发明提供了一种心肌梗死快速检测的肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒 及检测方法。
背承技术
心肌缺血性损伤,特别是急性心肌梗塞(AMI)是威胁人类生命的主要疾病 之一，临床化学家和临床科学家一直努力寻找和探索特异性好、灵敏度高的血 清指标。心肌肌铐蛋白I (cardiac troponin I,cTnI)具有高度的心肌特异 性，当心肌细胞受损时，血液中的cTnl出现时间早，持续时间长，与心肌损 伤程度及预后密切相关，因此，它可作为心肌损伤的一种特异性指标。
发明内容
本发明提供了一种心肌梗死快速检测的肌钙蛋白I血清快速检測试剂盒 及检测方法。
本发明通过如下技术解决方案实现的 一种肌钙蛋白I血清快速检測试 剂盒，其特征在于 一种肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒，其特征在于心 肌钙蛋白I (cTnl)的分子量为22.5KD,其连同肌钙蛋白T和肌钙蛋白C构 成结构复合物。在心脏中的细胞间钙信号肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的转化 过程中起着重要作用。人的cTnI与骨骼肌中的形式在结构上有所不同，它的 氨基端上多了一个氨基酸残基。使得cTnl成为一个特异性的标志物。在心肌 梗死(AMI)发生后，cTnl便迅速释放入血液循环中 1. cTnl标记用单克隆抗体的预处理 1.1 透析(纯化水，24小时)
1.2离心去上清(4~10C 10000转/分钟、5分钟)
1.3 BCA法则浓度(物料平衡)
1.4 PH的调节((Umol/LK2C03量的确定) 1.5最佳标记量的确定
1.6分装(5000人份量/支)、-20度冻存2. 试剂的配制
2.1 1%的柠橡酸三钠的配制
2.2 1%的氯金酸的配制
2.3 0.01%的氯金酸的配制
2.4 0.1ml/LK2CO3的配制
2.5 10%的氯化钠的配制
2.6 1%的叠氮钠的配制
2.7 1Cm的BSA的配制
2.8 lmol/lH5S的配制
2.9 0.05mol/lPBS的配制 2.10胶体金复溶液的的配制
3. 胶体金的制备
3.1 量取0.01%的HAuCL4溶液 3.2加热至沸腾
迅速加入1 %+ 棣酸三钠溶液，搅拌均匀
(比例100ml 0.01%的HAuCL4溶液加1.6 ml 1 %柠檬酸三钠溶液) 3.3继续加热10分钟
冷却至室温,用超纯水恢复至原体积 3.4 0.22ym微孔滤膜过滤除菌 3.5送检、装瓶、貼标签
4. cTnl免疫金的制备和干燥 4.1 cTnl标记抗体的稀释
按照每生产5000人份4咖宽的cTnl试纸条需1支cTnl标记抗体计算，领取相应
量的抗体，用0.05mo1/1 PBS稀释到0.5mg/ml。
4.2生产前小试 a取lml胶体金
b调PH (0. lmol/L K2C03的量，混匀5min) c根据生产指令加入CTnIAbl,混匀10min d加入100ull(WffiSA,混匀10min e离心1000转/min， 30min(要求环境温度4_10°C)
f 30%复溶，浸泡聚簾膜0.801/条(0.6cmX30cm) g温度20"301C，相对湿度30-35%干燥5小时h 送质检部检验
4.3 cTnl抗体标记
1) 标记小试质检质检合格，取胶体金,电磁搅拌
(以生产1000人份5mm宽的肌钙蛋白I胶体金试纸条约需50ml胶体金来计算。)
2) 调PH (0. lmol/L K2CCb的量)，混匀5min
3) 根据最适标记量加入CTnIAbl，混匀10min
4) 加入100ull0%BSA,混匀lOmin
5) 离心1000转/min, 30min， 4-IO'C
6) 30%复溶，浸泡聚酯膜25.3迈l/张(20cmX30cm)
7) 温度20"30r,相对湿度30-35%干燥5小时
8) 抽一条0.6cm宽送质检部做膜金匹配检渕
9) cTnl免疫金送中间品室暂存
5. cTnl包被板的制备 5.1包被抗体的稀释
羊抗鼠IgO. 05mol/LPBS稀释到1. 2mg/ml工作浓度
cTnl捕获抗体用0.05mol/LPBS稀释到1. lmg/ml工作浓度
5. 2包被前小试
1) 各取20ul试包被1条20cm长的膜，线浓度1.0ul/cm
2) 2"C-8t)过夜
3) 貼膜
4) 温度20"30t:、相对湿度30~35%干燥5小时 虽后送质检部检验质检合格。
5. 3包被生产
1) cTnl包被小试质检合格单2) 羊抗鼠IgG、 cTnl捕获抗体工作浓度包被质控线和检测线*线浓度1.0ul/cm
3) 2°C-8C过夜
4) 贴膜
5) 温度2Ch3(TC、相对湿度30-35%干燥5小时
6) 抽l板送质检部作膜金匹配
7) 密封后送中间品库暂存
本发明的有益效果是肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒，性能极其稳定，用户使用极 其方便、能准确快速检测。
制作肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒的工艺流程图
注L 所代表的过程必须在净化车间内操作
2. "所代表的过程必须在温度20-30度、湿度30-35度操作，另外
cTnl包被f的制备以及cTnl免疫金的制备的干燥过程也必须在温度20-30度、
湿度30-35度进行。
3 " +"代表关键控制点
具体实施例方式
肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒的配制操作如下
心肌钙蛋白I (cTnl)的分子量为22.5KD，其连同肌钙蛋白T和肌钙蛋 白C构成结构复合物。在心脏中的细胞间钙信号肌动蛋白-肌球蛋白相互作用 的转化过程中起着重要作用。人的cTnl与骨骼肌中的形式在结构上有所不同， 它的氨基端上多了一个氨基酸残基。使得cTnl成为一个特异性的标志物。在 心肌梗死(AMI)发生后，cTnl便迅速释放入血液循环中。释放的模式和CK-MB 相同(在AMI发生4-6个小时以后)。然而，CK-MB的水平在36-48小时后恢 复正常，cTnl可以持续升高6-10天。在正常健康人体内，cTnl水平是非常 低的，在骨骼肌受损的病人体内也检测不到cTnl。因此cTnl是诊断心肌梗死 的一个特异性指标。
本试剂盒采用双抗夹心免疫法，当标本加入样品槽后，通过结合垫和金 抗体结合，复合物沿膜流动和抗体在检测区域反应。如果标本中存在有可检 出浓度或更浓的标志物，就会在检测区出现一条色带。如果没有就会保持无 色。标本继续移动至控制区域，出现粉红-玫瑰红的色带，说明试验正常结果 *双。
产品名称肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)规 格25人份/盒适用范围
本试剂盒是免疫层析基础上的一步法体外诊断试剂盒。用来对发生心肌 梗死时人血清中的心肌钙蛋白I进行定性检测。检测原理胶体金法
应用双抗体夹心法原理，以胶体金作为指示标记，交联抗肌钙蛋白I抗体， 另一抗体为捕获抗体，与血液中的肌钙蛋白I结合并显色。测试时，样本向 检测区及质控区移动，如果样品中含有肌钙蛋白I，它就会和试剂中的金标抗 体组成抗原抗体复合物，再和检测区中的相对应的捕获抗体形成紫红色的色 带。如果样品中肌钙蛋白I水平低于最低检测限，检测区中就不会有色带出 现。在任何情况下，质控区色带都应出现。质控区色带的出现表明反应系统 ，泉
主要组成成分
测试卡片和一份干燥剂、 一个滴管一起装于铝箔袋中，每个试剂盒有25 个相同的铝箔袋。自备材料
1、 血清收集设备
2、 计时装置样本要求
1、 必须在标准实验室环境下采集血清标本。
2、 标本采集后最好马上就做检测。如不能在24小时内检测，血清标本应 冷冻起来，在试验以前使标本回复到室温。
3、 可以加0.1%的叠氮钠作为防腐剂，不会影响试验结果。质控方法
1. 控制线是内对照试剂和步骤控制。只要正确操作试剂有效控制线总会出现。
2. 建议每次都使用对照品以确保试剂盒的有效性。本试剂盒内没有提供
对照品，可外购。操作步骤
1. 使用前，将所有的试剂成分和病人样本置于室温。
2. 把测试卡片从铝箔袋中取出。
3. 用微量移液器吸取150^1样本。
4. 移液器垂直，加标本2-3滴(100-150nl)至样品槽中。
5. 15分钟读取显示结果。对试验结果的解释
阳性
15分钟后出现两条色带，说明结果阳性试验有效。只要在检测区域出现有色 带即可以读取结果。
9注很低浓度的cTnl会在长于15分钟的时候出现两条带。 阴性
如果在检测区域没有条带而控制区域有条带，说明结果阴性而试验有效。 无效试验
如果在控制区域没有做絲，说明 ^效，标本娜一个新的卡片重新测试。产品性能指标
本试剂盒在cTnl》L 5ng/ml时出现阳性结果。注意事项
l.处理样品时，请戴一次性手套。 2;测试时，测试卡应水平放置，不要倾斜。 3;加样15分钟后显示的结果无诊断意义。
4;测试结束，请彻底清洗双手剩余标本和废弃物应用1: 25稀释的84消毒液 浸泡30分钟以上才能丢弃。 5.—个吸管只能吸取一个样品，以免交叉污染。
6;若用微量滴管头滴加样本，应迅速一次性加入到样品槽中，避免断续加入。 7.本试剂结果仅供定性的辅助诊断，对实验结果解释需与临床症状相结合。
贮存2-8'C保存。
有效期12个月。
医疗器械注册证书编号
产品标准编号O/YZ 021-200权利要求
1.心肌钙蛋白I(cTnI)的分子量为22.5KD，其连同肌钙蛋白T和肌钙蛋白C构成结构复合物，在心脏中的细胞间钙信号肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的转化过程中起着重要作用，本试剂盒采用双抗夹心免疫法，当标本加入样品槽后，通过结合垫和金抗体结合，复合物沿膜流动和抗体在检测区域反应。如果标本中存在有可检出浓度或更浓的标志物，就会在检测区出现一条色带。如果没有就会保持无色。标本继续移动至控制区域，出现粉红-玫瑰红的色带，说明试验正常结果有效。
2. 根据权利要求1所述的肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)， 其特征在于心肌钙蛋白I (cTnl)的分子量为22.5KD，其连同肌钙蛋白T 和肌钙蛋白C构成结构复合物。
3. 根据权利要求1所述的肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法) 的配制，其特征在于1%的柠檬酸三钠，1%的氯金酸，0. 01%的氯金酸，0. 1 ml/L K2C03 ， 10%的氯化钠，1%的叠氮钠，10y。的BSA， 1 mo1/1 PBS， 0. 05 mo1/1 PBS，胶体金复溶液。
4. 根据权利要求1所述的肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)， 包括如下工艺步骤第一步cTnl标记用单克隆抗体的预处理 1.1透析(纯化水，24小时)1.2离心去上清(ri(TC， 10000转/分钟、5分钟) 1.3BCA法则浓度(物料平衡)1. 4PH的调节(0. lmol/LK2C03量的确定) 1.5最佳标记量的确定l.S分装(5000人份量/支)、-20度冻存 第二步胶体金的制备2. 1量取0. 01%的HAuCL4溶液(加热至沸腾) 2. 2迅速加入1 %拧檬酸三钠溶液，搅拌均匀(比例100ml 0. 01%的HAuCL4溶液加1. 6 ml 1 %柠檬酸三钠溶液)(继续加热io分钟)2. 3冷却至室温，用超纯水恢复至原体积 2.4 0. 22 y m微孔滤膜过滤除菌2. 5送检、装瓶、贴标签 第三步cTnl免疫金的制备和干燥3. 1 cTnl标记抗体的稀释按照每生产5000人份4mm宽的cTnl试纸条需1支cTnl标记抗体计算， 领取相应量的抗体，用0.05mo1/1 PBS稀释到0.5mg/ml。 3.2生产前小试 取lml胶体金1) 调PH (0. lmol/L K2C03的量，混匀5min)2) 根据生产指令加入CTnIAbl,混匀10min3) 加入100ull0%BSA,混匀10min4) 离心1000转/min， 30min (要求环境温度4-10。C)5) 30%复溶，浸泡聚酯膜0.8ml/条(0.6cmX30cm)6) 温度20-301C，相对湿度30-35%干燥5小时7) 送质检部检验 3.3 cTnl抗体标记1) 标记小试质检质检合格2) 取胶体金,电磁搅拌(以生产1000人份5mm宽的肌钙蛋白I胶体金试纸条约霈50ml胶体金 来计算。)3) 调PH (0. lmol/L K2C03的量)，混匀5min4) 根据最适标记量加入CTnIAbl，混匀10min5) 加入100ullO%BSA,混匀10min6) 离心1000转/min, 3(kin, 4-10t7) 30%复溶，浸泡聚酯膜25. 3ml/张(20cmX30cm) '8) 温度20-301C，相对湿度30-35%干燥5小时9) 抽一条0. 6cm宽送质检部做膜金匹配检测10) cTnl免疫金送中间品室暂存 第四歩cTnl包被板的制备 4.1包被抗体的稀释羊抗鼠IgO. 05mol/LPBS稀释到1. 2mg/ml工作浓度cTnl捕获抗体用0.05mol/LPBS稀释到1. lmg/ml工作浓度4. 2包被前小试1) 各取20ul试包被l条20cm长的膜，线浓度1.0ul/cm2) 2r-8t;过夜3)貼膜4)温度20-301C、相对湿度30~35%干燥5小时,送质检部检验质检合格。 4. 3包被生产1) cTnl包被小试质检合格单2) 羊抗鼠IgG、 cTnl捕获抗体工作浓度包被质控线和检测线，线浓度 1. 0ul/cm3) 2'C-8r过夜4) 贴膜5) 温度20-30X:、相对湿度30-35%干燥5小时6) 抽l板送质检部作膜金匹配7) 密封后送中间品库暂存
全文摘要
本发明属于生物科技领域，本发明公开了一种肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)制作及工艺，采用了金标法测定人血清样品中cTnI的量，心肌钙蛋白I(cTnI)的分子量为22.5KD，其连同肌钙蛋白T和肌钙蛋白C构成结构复合物，在心脏中的细胞间钙信号肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的转化过程中起着重要作用，本试剂盒采用双抗夹心免疫法，当标本加入样品槽后，通过结合垫和金抗体结合，复合物沿膜流动和抗体在检测区域反应。如果标本中存在有可检出浓度或更浓的标志物，就会在检测区出现一条色带。如果没有就会保持无色。标本继续移动至控制区域，出现粉红-玫瑰红的色带，说明试验正常结果有效。本发明的有益效果是肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒，性能极其稳定，用户使用极其方便、能准确快速检测。
文档编号G01N33/532GK101566634SQ200810036418
公开日2009年10月28日 申请日期2008年4月22日 优先权日2008年4月22日
发明者宣生良 申请人:上海一滴准生物科技有限公司