灯台叶药材及其制剂的药物检测方法

专利名称：：灯台叶药材及其制剂的药物检测方法
技术领域：
：本发明涉及药物分析检测
技术领域：
，具体地说是灯台叶药材及其制剂的药物检测方法。
背景技术：
：灯台树AlstoniaScholaris(L.)R.Bro.为夹竹桃科植物，主要分布云南南部，资源丰富。灯台叶是多民族使用的天然药物，用于治疗肺热咳嗽、痰多、支气管炎等呼吸系统疾病，药材已为《云南省药品标准》、《中国药典》收载。利用灯台叶为原料，已开发了灯台叶颗粒剂、片剂、胶囊剂、口服液等制剂产品。对于灯台叶的化学研究，朱伟明博士论文"五种药用植物资源化学的初步研究"，朱华博士论文"五种药用植物的化学与活性成分研究"(中国科学院昆明植物研究所，2001年、2006年)中对生物碱成分进行了系统研究和文献综述。在药物质量分析方面，《云南省药品标准》对灯台叶药材仅用简单的生物碱沉淀反应进行鉴别，无含量测定项目；卫生部颁中药标准灯台叶颗粒无理化检测项目，灯台叶片采用酸碱滴定法测生物碱，并折算为指标成分鸭脚树叶碱含量，但测定方法的专属性差，已经不能适应中药现代化的技术要求。为改进灯台叶药材及其制剂质量分析技术方法，已经有一些研究报道或相关专利申请。朱光荣申请"鸭脚树叶碱在控制灯台叶药材及其制剂质量中的应用"专利(授权，CN100356172C);昆明振华制药厂有限公司对灯台叶主要生物碱成分鸭脚树叶碱的检测方法进行研究，申请"测定碱鸭脚树叶碱含量的高效液相色谱方法"专利(公开，CN1975412A);昆明植物研究所申请"治疗呼吸道相关疾病的药物及其制备方法和应用"(公开，CN101084951A)、"治疗呼吸道相关疾病的药物及其应用"专利(公开，CN101084894A);中国药品生物制品检定所申请"一种治疗咳嗽哮喘的中药组合物"专利(公开，CN101028323A)。这些相关的研究及专利，均只是涉及到灯台叶中含有的生物碱类成分，尤其是主要成分碱鸭脚树叶碱的分析方法及其在药物质量控制中应用。
发明内容本发明的目的是提供一种分析检测灯台叶药材以及以灯台叶为原料生产的各种制剂中有效成分化合物1和2的方法。该方法以薄层色谱定性检测灯台叶药材及其制剂中化合物l、2，并以分光光度法测定其含量来实现对灯台叶药材及其制剂的质量分析与控制。本发明人对灯台叶的进一步研究证实，灯台叶除生物碱成分外还含有较多的黄酮苷类成分，并首次发现存在二个含量较高的黄酮苷类成分山奈酚-3-0-j3-D-半乳糖-(2—l)-O-p-D-木糖苷、槲皮素-3-0-P-D-半乳糖-(2—l)-O-p-D-木糖苷(以下称化合物l、2，其结构见附图l)。经药理试验证明化合物1和2是灯台叶及其制剂抗炎、止咳、镇痛的有效成分。对化合物1和2的存在及含量进行分析和检测，可以作为控制灯台叶及其制剂质量的重要指标。(1)用薄层色谱法检测灯台叶药材及其制剂中化合物1和2:以硅胶G为吸附剂，用乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水的混合溶液为展开剂；展开剂所含四种溶剂的体积比为乙酸乙酯丁酮甲酸水=5:3~5:o.5~i:o.5~i。其最佳配比为乙酸乙酯丁酮甲酸水=5:3:ii。其中，展开剂中的乙酸乙酯可用CrC4的脂肪酸和d-C4的脂肪醇形成的酯替代，丁酮可用c3-c6的低级脂肪酮替代，甲酸可用c2-c6的低级脂肪酸替代。(2)用分光光度法测定灯台叶药材及其制剂中化合物1和2的含量在亚硝酸钠存在下以硝酸铝为显色剂，在稀氢氧化钠溶液中显色后于510nm测定吸收值，其含量以吸收值和化合物1和2混合的标准溶液在相同显色条件下的吸收值比较而确定。以上所述的制剂是以灯台叶为原料生产的各种制剂，包括灯台叶颗粒剂、片剂、胶囊剂、口服液等。化合物1和2的可用植物化学方法从灯台叶中提取分离，用光谱分析方法测定结构，用动物实验证明其药理作用。光谱数据如表一，结构式见附图l。表一化合物1和2的主要光谱数据<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>化合物1和2的药理活性证明(1)化合物1和2对氨水所致小鼠咳嗽的影响选取1822g小鼠，用300mL玻璃烧杯反扣于玻璃板上，同时向器皿中迅速推入25%浓氨水0.04mL，观察小鼠2min内的咳嗽次数，以2min内出现3次以上典型咳嗽动作者为筛选合格动物。取筛选合格的小鼠60只，雌雄各半，按性别、体重随机分为6组，每组10只。各组动物分别按表二给药剂量灌胃1次，空白对照组灌等容纯水。于灌胃后30min将小鼠逐一放入玻璃板上用300mL玻璃烧杯反扣，同时向器皿中迅速推入25%浓氨水0.04mL,记录2min内小鼠的咳嗽次数，结果及统计分析见表二。结果表明，磷酸可待因组(阳性药物)、化合物l、2的高剂量均能明显减少浓氨水致小鼠的咳嗽次数；化合物l、2具有止咳作用。表二化合物1和2对浓氨水致小鼠咳嗽的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(2)化合物1和2对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响选取1822g小鼠60只，雌雄各半，按性别和体重随机分为6组，每组10只。各组动物分别按表三给药剂量灌胃1次，空白对照组灌等容纯水，于给药后30min按O.lmL/只的量于小鼠右耳两面均匀涂抹二甲苯致炎。lh后脱臼处死小鼠，沿耳廓基线剪下双耳，将两耳叠放对齐，用9mm打孔器于同部位等面积切下耳片，称重，按照下列公式计算肿胀度和抑制率，结果及统计分析见表三。肿胀度=右耳片重量(致炎侧)一左耳片重量(正常侧)抑制率=[(空白对照组耳廓肿胀度—其它各组耳廓肿胀度)/空白对照组耳廓肿胀度]xl00%结果表明，阿司匹林(阳性药物)、化合物1高剂量、化合物2低、高剂量均能明显抑制由二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀；化合物l、2具较强抗炎作用。表三化合物1和2对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(3)化合物1和2对小鼠气管酚红分泌排出的影响精确称取酚红配制为不同浓度的溶液，用光度计在546nm处测定吸收值(OD)，以酚红浓度(pg/mL)为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线。选用1822g小鼠60只，雌雄各半，按性别和体重随机分为6组，每组10只。各组动物分别按表四剂量灌胃给药1次，空白对照组灌等容纯水，于给药30min后分别按照0.1mL/10g体重腹腔注射0.5。/。酚红，再于30min后脱颈椎处死动物，剥离气管周围组织，剪下自甲状软骨下至支气管分叉处的一段气管，放入盛有2mL生理盐水的试管中，再加入O.lmL氢氧化钠(lmol/L)，超声处理5min，离心分离，吸取上清夜在波长546nm处测定OD值。根据标准曲线计算小鼠气管分泌物中排出酚红的浓度，结果及统计分析见表四。结果表明，氯化铵(阳性药物)、化合物1高剂量、化合物2低、高剂量均均能明显增加小鼠气管的酚红排泌量；化合物l、2具有祛痰作用。表四化合物1和2对小鼠气管酚红排出的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(4)化合物1和2对醋酸致小鼠扭体性疼痛的影响选取1822g小鼠60只，雌雄各半，按性别和体重随机分为6组，每组10只。各组动物分别按表五给药剂量灌胃1次，空白对照组灌等容纯水。于灌胃45min后，分别以0.6%的冰醋酸生理盐水溶液以0.1mL/10g的量小鼠腹腔注射，观察并记录试验小鼠在10min内的扭体反应次数，按照下列公式计算抑制率，结果及统计分析见表五。抑制率=[(空白组扭体次数一试验组扭体次数)/空白组扭体次数]xl00%结果表明，阿司匹林(阳性药物)、化合物l、2低、高剂量均能显著抑制醋酸所致小鼠的扭体性疼痛；化合物l、2具有镇痛作用。表五化合物1和2对醋酸致小鼠扭体性疼痛的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本发明克服了现有技术方法仅能检测灯台叶及其制剂中生物碱类成分，而没有检测另一类更为重要的活性成分黄酮苷的不足之处，提供一种能准确检测灯台叶药材及其制剂中二个黄酮苷类有效成分化合物1和2的定性鉴别和定量分析方法，可用于准确评价灯台叶药材质量，也可用于检测以灯台叶为原料生产的各种制剂(灯台叶颗粒剂、片剂、胶囊剂、口服液等)的质量分析，能直接应用于实际生产过程及产品的质量分析。图1是化合物1和2的化学结构式。图2是不同产地灯台叶药材薄层色谱分析图谱。图3是本发明分光光度法测定含量的标准曲线。具体实施方式以下的具体实施例可进一步说明本发明及其应用，但并不构成对本发明权利要求所保护的范围的限制。其工作原理和过程为①薄层色谱定性检测同一结构的化合物，在同一薄层色谱板上，以同一流动相溶剂展开，应表现一致的色谱行为；用对照品和被检测样品直接在薄层色谱板上进行展开后对照，根据是否在和对照品相同的位置出现相同的斑点，可确定样品中是否存在和对照品一致的化学成分。薄层色谱方法的关键技术要点，在于针对不同的产品、不同的成分，通过系统的研究和比较，筛选、确定具有最佳分离效果的展开剂系统。②分光光度定量检测灯台叶中含有的黄酮类化合物，在亚硝酸钠存在下和硝酸铝试剂产生络合反应，在稀氢氧化钠溶液中显色后在510nm有最大吸收，其吸收值和含量呈线性关系，可根据其吸收值和标准溶液在相同显色条件下的吸收值比较而确定其含量。实施例l:灯台叶药材的分析检测-11、化合物1和2的分离和结构鉴定(1)提取分离灯台树药材50kg粉碎后用95%乙醇回流提取，减压回收溶剂得浸膏。醇提浸膏加水搅散后依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收正丁醇部分得到黄酮苷混合物。黄酮苷混合物经MCI柱脱色，用甲醇为洗脱剂富集黄酮苷类。富集的黄酮苷类再经葡聚糖凝胶LH-20色谱反复分离，用甲醇为洗脱剂，结合重结晶等常规纯化方法，得到化合物1和2。(2)结构鉴定化合物1:黄色粉末，易溶于甲醇、水，不溶于氯仿、乙酸乙酯等，但可溶于稀碱溶液。熔点214217"C。通过理化及光谱测试确定化合物l的结构为山奈酚-3-0-p-D-半乳糖_(2—1)-0-(3-D-木糖苷。化合物2:黄色粉末，易溶于甲醇、水，不溶于氯仿、乙酸乙酯等，但可溶于稀碱溶液。熔点215219'C。通过理化及光谱测试确定化合物2的结构为槲皮素-3-0-l3-D-半乳糖-(2-l)-O-P-D-木糖苷。2、化合物1和2的薄层色谱定性检测(1)对照品和样品溶液的制备分别称取从灯台叶中提取分离的黄酮苷类化合物1和2适量，以乙醇溶解制成约lmg/mL的溶液，即为对照品溶液。晒干的灯台叶粉碎过40目筛网，取粉末2g加20mL乙醇溶剂，浸泡l小时后超声处理30min提取，过滤，滤液回收溶剂得乙醇浸膏。乙醇浸膏用pH-8.5的稀氨水20mL溶解，过滤；滤液以稀盐酸中和到pH=4，再以20mL正丁醇萃取黄酮苷，回收正丁醇溶液，残渣用lmL甲醇溶解，为供薄层色谱分析的样品溶液。(2)灯台叶样品的薄层色谱分析与判断以硅胶G板为吸附剂，用乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水按5:3:1:l的体积比例配制展开剂；分析比较来自15个产地的17份灯台叶药材样品，薄层色谱图见附图2。不同产地灯台叶药材(样品1-10、12-13、15-16)均能检出化合物1和2;已完全霉变的2份灯台叶药材(样品ll、14)未能检出化合物1和2;部分霉变的l份灯台叶药材(样品17)检出少量的化合物1和2。依据薄层色谱定性检测的结果判断灯台叶药材样品1-10、12-13、15-16是合格药材，样品ll、14、17(霉变或部分霉变)是劣质药材。2、化合物1和2的含量测定(1)对照品和样品溶液的制备精确称取化合物1和2各12.5mg，置于50mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得浓度为0.5mg/mL的对照品溶液，备用。灯台叶药材粉碎过60目筛网，精密称取lg，置100mL圆底烧瓶中，准确加入乙醇50mL，称定重量，浸泡1小时后，回流提取1小时，放冷，用乙醇补足减失的重量，过滤，取续滤液备用。精密吸取提取液10mL减压回收乙醇，残渣加入？^1=8.5的稀氨水20mL溶解，过滤，续滤液备用。(2)标准曲线分别准确吸取0.5mg/mL对照品溶液0、1、2、3、4、5、6、7mL，置25mL量瓶中，分别补充适量纯化水至10mL。各加入5n/。的亚硝酸钠溶液lmL,摇匀；放置6分钟后，加入10M硝酸铝lmL，摇匀；放置6分钟后，再加入4M的氢氧化钠10mL，摇匀后，用纯化水定容至刻度；放置15分钟后，以空白溶液为参比，在510nm处测定其吸光度A，数据如表六。数据回归处理，得回归方程A-6.3036xC+0.0182,r=0.9999，标准曲线见附图3。表六分光光度法测定含量的线性关系<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(3)样品测定准确吸取灯台叶各样品溶液2mL，置25mL量瓶中，补加8mL纯化水，加5%的亚硝酸钠溶液lmL，摇匀；放置6分钟后，加入10M硝酸铝lmL，摇匀；放置6分钟后，再加入4%的氢氧化钠10mL，摇匀后，用纯化水定容至刻度；放置15分钟后，以空白溶液为参比，在510nm处测定其吸光度A。测出的样品吸光度A，依据标准曲线计算黄酮苷化合物1和2的总含量。不同产地的灯台叶药材的测定数据见表七。表七不同产地灯台叶药材中黄酮苷类化合物的含量<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>检测结果表明，不同灯台叶药材的效成分含量是有差别的，灯台叶药材样品1-10、12-13、15-16的黄酮苷类化合物含量在2.096%~5.118%之间，以含量较高的样品3、6、8、13、16质量最好。而霉变或部分霉变的样品11、14、17的含量仅在0.436%~0.7378%之间，属劣质药材。含量测定的定量分析结果和薄层色谱检测的定性分析结果具有一致性。黄酮苷类的含量，代表了灯台叶药材质量的优劣，可直接用于客观评价灯台叶药材质量。实施例2:灯台叶药材的分析检测-2方法同实施例l，但薄层色谱分析的展开溶剂改变为乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水=5:5:h1。检测结果和实施例l判断一致。实施例3:灯台叶药材的分析检测-3方法同实施例l，但薄层色谱分析的展开溶剂改变为乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水=5:3:0.5:1。检测结果和实施例l判断一致。实施例4:灯台叶药材的分析检测-4方法同实施例l，但薄层色谱分析的展开溶剂改变为乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水=5:3:1:0.5。检测结果和实施例l判断一致。实施例5:灯台叶药材的分析检测-5方法同实施例1，但薄层色谱分析的展开溶剂改变为甲酸丁酯-丙酮-乙酸-水=5:3:1:1。检测结果和实施例l判断一致。实施例6:灯台叶药材的分析检测-6方法同实施例1，但薄层色谱分析的展开溶剂改变为正丁酸甲酯-戊酮-甲酸-水=5:4:1:1。检测结果和实施例l判断一致。实施例7:灯台叶药材的分析检测-7方法同实施例1,但薄层色谱分析的展开溶剂改变为正丁酸甲酯-戊酮-丁酸-水=5:5:1:1。检测结果和实施例l判断一致。实施例8:灯台叶药材的分析检测-8方法同实施例1，但薄层色谱分析的展开溶剂改变为乙酸乙酯-丁酮-正己酸-水=5:4:1:1。检测结果和实施例l判断一致。实施例9:灯台叶颗粒的检测灯台叶颗粒2g加20mL热水溶化，以稀盐酸中和到pH=4后再以20mL正丁醇萃取黄酮苷，回收正丁醇溶液，残渣用lmL甲醇溶解，为样品溶液。对照品溶液制备，点样、展开、判断等同实施例l，展开溶剂为乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水=5:3:1:1。结果为灯台叶颗粒中能检出黄酮苷类化合物1和2。精密称取lg灯台叶颗粒，精密加入pH-8.5的稀氨水20mL溶化，过滤，准确吸取续滤液2mL，置25mL量瓶中，以下补水、显色、测定等同实施例1。灯台叶颗粒中含黄酮苷化合物1和2的总量为2.17%。实施例10:灯台叶胶囊的检测方法同实施例9，取灯台叶胶囊内容物检测，结果为灯台叶胶囊中能检出黄酮苷类化合物1和2;灯台叶胶囊中含黄酮苷化合物1和2的总量为1.75%。实施例lh灯台叶口服液的检测方法同实施例9，取灯台叶口服液检测，结果为灯台叶口服液中能检出黄酮苷类化合物1和2;灯台叶口服液中含黄酮苷化合物1和2的总量为1.58%。实施例12:灯台叶片的检测方法同实施例9，取灯台叶片研粉后检测，结果为灯台叶片中能检出黄酮苷类化合物1和2;灯台叶片中含黄酮苷化合物1和2的总量为2.32%。权利要求1.一种灯台叶药材及其制剂的药物检测方法，其特征在于以薄层色谱定性检测灯台叶药材及其制剂的有效成分山奈酚-3-O-β-D-半乳糖-(2--1)-O-β-D-木糖苷、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖-(2--1)-O-β-D-木糖苷，以分光光度法测定其含量来实现对灯台叶药材及其制剂的质量分析与控制。2、按照权利要求1所述的灯台叶药材及其制剂的药物检测方法，其特征在于薄层色谱检测方法是以硅胶G为吸附剂，用乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水的混合溶液为展开剂；展开剂所含四种溶剂的体积比为乙酸乙酯:丁酮:甲酸:水=5:3~5:o.5~i:o.5~i。3、按照权利要求2所述的灯台叶药材及其制剂的药物检测方法，其特征在于展开剂所含四种溶剂的体积比为乙酸乙酯丁酮甲酸水=5:3:l:l。4、按照权利要求2所述灯台叶药材及其制剂的检测方法，其特征在于展开剂中的乙酸乙酯用d-C4的脂肪酸和Q-C4的脂肪醇形成的酯替代，丁酮用C3-C6的低级脂肪酮替代，甲酸用C2-C6的低级脂肪酸替代。5、按照权利要求1所述的灯台叶药材及其制剂的药物检测方法，其特征在于所述的含量测定的分光光度方法是在亚硝酸钠存在下以硝酸铝为显色剂，在稀氢氧化钠溶液中显色后于510nm测定吸收值，其含量以样品溶液的吸收值和山奈酚-3-0-l3-D-半乳糖-(2—1)-0-p-D-木糖苷、槲皮素-3-0-P-D-半乳糖-(2—l)-O-p-D-木糖苷混合的标准溶液在相同显色条件下的吸收值比较而确定。6、按照权利要求1所述的灯台叶药材及其制剂的药物检测方法，其特征在于所述的制剂是以灯台叶为原料生产的各种制剂，包括灯台叶颗粒剂、片剂、胶囊剂、口服液。全文摘要本发明是一种灯台叶药材及其制剂的药物检测方法。其特征在于以薄层色谱定性检测灯台叶药材及其制剂的有效成分山奈酚-3-O-β-D-吡喃半乳糖-(2-1)-O-β-D-吡喃木糖苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖-(2--1)-O-β-D-吡喃木糖苷，以分光光度法测定其含量来实现对灯台叶药材及其制剂的质量分析与控制。本发明克服了现有技术方法仅能检测灯台叶及其制剂中生物碱类成分，而没有检测另一类更为重要的活性成分黄酮苷的不足之处，本发明的方法能准确检测灯台叶药材及其制剂中二个黄酮苷类有效成分化合物1和2和其含量的确定。可用于准确评价灯台叶药材质量，也可用于检测以灯台叶为原料生产的各种制剂(灯台叶颗粒剂、片剂、胶囊剂、口服液等)的质量分析，能直接应用于实际生产过程及产品的质量分析。文档编号G01N30/90GK101269097SQ200810058340公开日2008年9月24日申请日期2008年4月30日优先权日2008年4月30日发明者惠婷婷,朱丽萍,文郭,饶高雄申请人:昆明振华制药厂有限公司