专利名称：：石斛色谱指纹图谱测定方法石斛色谱指纹图谱测定方法
技术领域：
：本发明涉及一种应用色谱指纹图谱技术，对药用石斛中提取的含酚类和黄酮类的化学成分制订色谱指纹图谱测定方法，以便于在原料采购、产品生产工艺流程中的各个步骤的质量进行监控。
背景技术：
：石斛是一类常用的贵重中药材，历代本草和各版药典均有收载，中外学者对多种石斛的化学成分进行了研究和探索，发现该属植物所含的化学成分类型多样，包括多糖类、生物碱、黄酮类、醌类、倍半萜类、香豆素类及甾体糖苷类化合物等成分。近年来，众多学者对从多种石斛属植物中分离得到的成分进行了药理活性研究和临床应用。酚类化合物和黄酮类化合物是石斛中的主要活性成分之一，如石斛中异黄酮类化合物异甘草苷，具有清除自由基、抗氧化的活性(罗丹等，2006)，因此，采用现代质控方法，制订石斛中酚类和黄酮类化学成分质量控制标准是石斛生产厂家重点考虑的。而目前尚没有采用高效液相(HPLC)指纹图谱技术对石斛酚类和黄酮类化合物进行质量控制的报道，因此，本方法对控制石斛原料和产品的质量有重要意义。
发明内容本发明的目的在于克服现有质量控制技术的不足之处，且方法简单，可以方便快捷得到色谱图，并可利用该指纹图谱全面监控石斛的质量，以确保产品质量稳定的石斛色谱指纹图谱测定方法。本发明的目的是这样实现的石斛色谱指纹图谱测定方法，步骤如下①、将药用石斛剪断后，低温干燥，粉碎，过筛备用；②、取适量样品于锥形瓶中，添加适量一元醇，超声20min，过滤，滤渣用一元醇淋洗多次，合并滤液，滤液挥至近干，③、用一元醇溶解，定容，再用0.45iim微孔滤膜过滤后作为供试品溶液；、分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，进行分析；上述步骤中检测条件为色谱柱C18柱(ODS柱)流速lml/min检测波长254nm柱温25。C流动相乙腈(A)-l。；醋酸(B).洗脱梯度5%—32%A(O—30min)，32—65%A(30—55min)，65—32%A(55—60min)。如上所述的石斛色谱指纹图谱检测方法，其特征在于步骤①中过筛是过40-3003目筛。如上所述的石斛色谱指纹图谱测定方法，其特征在所述的于一元醇为甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇中的任意一种。如上所述的石斛色谱指纹图谱测定方法，其特征在于所述的药用石斛为金钗石角斗DendrobiumnobileLindl.、环草石角斗D.loddigesiiRolfe.、黄草石角斗D.chrysanthumWall.、马新更石斛D.fimbriatumHook.Var.oculatumHook.、铁皮石斛D.candidumWall,exLindl.中的任意一种。本发明与石斛传统的质量控制方法相比，有如下突出优点1、可以方便快捷的得到色谱图，而且原材料易得，工艺简单，技术先进。据文献记载，可以作为药用石斛的石斛属植物有近100种。传统的质量控制方法，如外观性状鉴定、显微鉴定、薄层鉴别、生物碱和总多糖含量测定等方法并不能满足上述近缘种鉴别的要求。而上述药用石斛的药用价值并不相同，造成了市场上石斛药材质量的参差不齐、以次充好的状况。中药色谱指纹图谱技术通过多成分、多指标来控制产品的质量，相比上述质量控制指标，结果更加可靠，原材料易得，工艺简单。2、酚类和黄酮类为药用石斛的有效部位之一，因此本发明制订指纹图谱质量控制方法，能有效表征药用石斛的质量。3、本发明采用高效液相色谱法(HPLC)制订了药用石斛的指纹图谱，与采用气相色谱法(GC)和分子生物学方法相比，本发明操作方法简单、分析速度快、成本低、重现性好，特别适合大批量样品的分析。4、利用本发明的测定方法，可得到石斛样品的指纹图谱色谱图。再借助计算机相似度辅助评价软件，将样品图与共有模式图谱比较，通过相似度计算，即可评价原料品种、产地、真伪优劣，以及判断产品质量的稳定性。图1是Spherisorb0DS2C18色谱柱的指纹图谱；图2.1是PhenomenexC18(250mm*4.6mm*5iim，Luna)色谱柱的指纹图谱；图2.2是Spherisorb0DS2C18色谱柱和Prodigy0DS3色谱柱的指纹图谱；图2.3是Prodigy0DS3色谱柱、ZorbaxSBC18色谱柱和PhenomenexC18色谱柱的指纹图谱；图3是空白实验色谱图；图4是供试品溶液稳定性的色谱图；图5是供试品溶液重性色谱图；图6是供试品溶液精密度色谱图；图7是金钗石斛酚类、黄酮类指纹图谱；图8是20批金钗石斛酚类和黄酮类成分指纹图谱的共有模式；图9是图8中编号20的指纹图谱；图10是图8中编号4的指纹图谱；图11是图8中编号5的指纹图谱；图12是背景扣除后得到24.848min色谱峰的光谱图；图13是背景扣除后得到25.281min色谱峰的光谱图。具体实施方式从实验目标出发，在实验中我们选择并比较了不同的C18(0DS柱)色谱柱Spheris-orb0DS2(150mm*4.6mm*5um，waters)色谱柱、PhenomenexC18(250mm*4.6mm*5um，Luna)色谱柱、ZorbaxSBC18(250mm*4.6mm*5um，Aglient)色谱柱、Spherisorb0DS2(250mm氺4.6mm氺5um，waters)色i普柱、Prodigy0DS3(250mm氺4.6mm氺5um，Phenomenex)色谱柱对金钗石斛酚类和黄酮类成分的色谱组分的分离效果的影响。如图1所示Spherisorb0DS2(150mm氺4.6mm氺5um，waters)色i普柱，Spherisorb0DS2柱出峰数量、峰高、峰型均较好而出峰密集、分离度远远达不到实验要求，因此实验最终没有采用150mm*4.6mn^5iim类型的色谱柱。实验过程中采用的250mm*4.6mm*5ym类型色谱柱分离效果好，出峰时间合适，符合色谱分离最优化原则，故而采用此类型色谱柱进行实验。通过不同250mm*4.6mn^5iim类型色谱柱所得色谱图比较(图2.1、2.2、2.3)，最终确定分离效果最好的Prodigy0DS3(250mm*4.6mm*5ym，Phenomenex)色谱柱进行待测样本分析(Spherisorb0DS2(250mm*4.6mm*5iim，waters)色谱柱柱效降低严重拖尾)。图2.3中，1为Prodigy0DS3(250mm氺4.6mm氺5um，Phenomenex)色i普柱2为ZorbaxSBC18(250mm*4.6mm*5um，Aglient)色谱柱；3为PhenomenexC18(250mm*4.6mm*5um，Luna)色谱柱。—个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。基于此几项要求，并在实验所得金钗石斛酚类和黄酮类成分分离效果最好的前提条件下，选择了乙腈-1%。乙酸系统作为流动相。通过实验比较，此流动相比单纯的乙腈-水系统、甲醇-水系统干扰小、成分峰数目多、分离度大，故而选用乙腈-1%。乙酸系统作为建立金钗石斛酚类和黄酮类成分的指纹图谱的实验流动相。HPLC有等强度(isocratic)和梯度(gradient)洗脱两种方式。等强度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和PH值等，用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。采用梯度洗脱可以縮短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度，但是常常引起基线漂移和降低重现性。由于金钗石斛酚类和黄酮类成分分析数目多、分析时间长，考虑到实际应用中重复操作的时效性和可行性，因而实验首选梯度洗脱的方式。通过调配梯度洗脱程序最终所得分析结果在保证分离效果的同时分析时间合适。对于梯度洗脱方式引起的基线漂移和降低重现性这些情况，实验做了方法学验证(见下文)，结果良好。对于有光谱吸收的样品，吸收信号的强度随波长而变化，只有在其有最大吸收的波长下进行检测才可能获得最大检测灵敏度。从全波长扫描3D图选择最大吸收波长，兼顾出峰数量多，信号响应值大，基线平稳情况，254nm波长为检测最佳波长。因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择lml/min。以甲醇作空白实验，所得色谱指纹图谱中没有组分流出，而且基线非常平稳，如图3所示。此方法建立的金钗石斛酚类和黄酮类成分的色谱指纹图谱能够表达该品种的化学特征，即唯一性。稳定性实验，取某一批号的金钗石斛原样，按拟定方法提取，分别在0h，Id和2d不同时间进行测定。直观上，这些指纹图谱的色谱组成无明显变化，如图4。用相似度计算在同一台仪器测得的色谱指纹图谱与其共有模式图谱的相似度分别为0.9724,0.9877,0.9919。重复性实验，取同一批号的金钗石斛，按照拟定的方法制备4份待测样品。图5示出了它们的色谱指纹图谱。观察这些指纹图谱的色谱组成，无明显变化。用相似度方法(均值)计算在同一实验室同一台仪器测得的色谱指纹图谱与其共有模式图谱的相似度分别为0.9881,0.9951,0.9953,0.9944,0.9952。仪器精密度实验，取同一供试品溶液，连续进样6次，考察仪器精密度和指纹图谱色谱组分保留时间的一致性。图6为精密度试验所得的色谱指纹图谱。计算各指纹图谱与其共有模式图谱的相似系数(均值)为0.9876，0."04，0."51，0."21，0.9860，0."45。根据上述检测，得到最终检测条件色谱条件色谱柱Prodigy0DS3(250mm*4.6mm*5um，Phe謹e證)色谱柱流速lml/min检测波长254nm柱温25。C流云力相acetonitrile(A)-l%。aceticacid(B).洗脱梯度5%-32%A(30min)，32-65%A(25min)，65-32%A(5min)金钗石斛酚类和黄酮类供试品溶液进样量为20ii1，样本组分在55min出峰完毕。仪器，根据各生产厂家的经济情况、各药检部门所拥有的仪器及仪器的性能参数、实际可操作性等情况，推荐下列仪器用于金钗石斛中酚类和黄酮类成分的指纹图谱研究和质量控制美国AgilentHP1100高效液相色谱仪(G1322A型真空脱气机、G1311A型四元泵、G1315A型二极管阵列检测器、G1328A型手动进样装置)；B32005T型超声波清洗仪。本发明实施例中选用的是AgilentHP1100高效液相色谱仪。实验试剂分析纯甲醇、色谱纯乙腈、分析纯36%乙酸，分析纯乙醇，二次蒸馏水，异丙醇、正丙醇、正丁醇。数据处理软件，在整个金钗石斛酚类和黄酮类指纹图谱研究过程中，用于指纹图谱数据处理和质量评价的工具为中南大学中药现代化研究中心编写的中药质量评价图谱/数据库(ExtendableData-baseforQimlityAssessmentofTraditionalChineseHerbalMedicine)和计算机辅助相似性评价系统(ComputerAidedSimilarityEvaluation,CASE)。金钗石斛酚类和黄酮类成分指纹图谱的样本采集，20个金钗石斛样本均由本专利权人提供，均采自于贵州省赤水市。其中io个样本采摘于旺隆镇金钗石斛规范化种植基地；另外10个样本分别采摘于长沙镇长兴村、丙安乡三佛村、丙安乡爱华村、旺隆镇鸭岭村、长沙镇长兴村、旺隆镇红花村、长沙镇合云村、丙安乡丙安村、长沙镇高洞村、复兴镇。6色谱条件Prodigy0DS3(250mm*4.6mm*5um，Phenomenex)色谱柱，流速lml/min，检测波长254nm，柱温25。C;流动相acetonitrile(A)_1%。aceticacid(B)，洗脱梯度:5%-32%A(0-30min)，32-65%A(30-55min)，65-32%A(55_60min)供试品溶液进样量为20iil，样本组分在55min出峰完毕。金钗石斛酚类和黄酮类成分指纹图谱的建立，按拟订提取方案提取20个批次的金钗石斛样品作为供试品溶液。用HPLC-DAD联用方法得到金钗石斛酚类和黄酮类成分的指纹图谱。通过对上述20批指纹图谱数据进行基线校准和保留时间漂移校准后，如图7所示l长沙镇；2丙安乡三佛村；3丙安乡爱华村；4旺隆镇鸭岭村；5长沙镇长兴村；6旺隆镇红花村；7长沙镇合云村；8丙安乡丙安村；9长沙镇高洞村；10复兴镇；11_20旺隆镇规范化种植基地。通过计算得到的20批金钗石斛酚类和黄酮类成分的相关系数和相合系数，如表1所示，其中编号为4、5的两个样品与其余18个样品相比较相差较大，若选取20个样品的指纹图谱建立共有模式则有悖共有模式建立的意义，故而选取除编号为4，5外的18个样品建立共有模式，如图8所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>背景扣除后得到24.848min色谱峰的光谱图如图12所示，以甲醇为溶剂，黄酮的紫外光谱在240-400nm间一般有两个主要吸收带，处于290_380nm区的吸收带称带I，240-280nm区的为带I1。图12与图13显示，在275nm与330nm处均有样品的吸收带，据前述可简易定性24.848min与25.281min色谱峰均为黄酮类物质。通过上述实验，得出本发明石斛指纹图谱测定方法，步骤如下①、将药用石斛剪断2-3cm后，6(TC干燥，粉碎，过80目筛，备用；②、取2g样品于锥形瓶中，添加20ml甲醇浸泡，超声20min，布氏漏斗过滤，滤渣用甲醇淋洗3次，每次3ml，合并滤液，滤液挥至近干；③、用甲醇溶解，定容2ml，再用0.45iim微孔滤膜过滤后作为供试品溶液溶解；、分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，即得；上述步骤中检测条件为色谱柱Phe謹e證ProdigyODS3(250mm*4.6mm*5um)色谱柱流速lml/min检测波长254nm柱温25。C流动相乙腈(A)_1%。醋酸(B).洗脱梯度5%-32%A(0-30min)，32-65%A(30-55min)，65-32%A(55-60min)。本发明还可以将供试品溶液的指纹图谱与对照品共有模式图谱经计算机辅助相似度评价软件比较。实验试剂分析纯甲醇(江苏汉邦科技有限公司)、色谱纯乙腈(江苏汉邦科技有限公司)、分析纯36%乙酸(湖南师范大学化学试剂厂)，分析纯乙醇(江苏汉邦科技有限公司)，二次蒸馏水(HPLC纯)；0.45iimPTFEfilers，异丙醇、正丙醇、正丁醇。本实施例中采用50ml锥形瓶。药用石斛可以是金钗石斛DendrobiumnobileLindl.、环草石斛D.loddigesiiRolfe.、黄草石角斗D.chrysanthumWall.、马鞭石角斗D.fimbriat咖Hook.Var.oculatumHook.、铁皮石斛D.candidumWall,exLindl.中任意的一种。上述药用石斛的测定方法步骤、工艺条件、检测条件、数据处理软件都相同。权利要求石斛色谱指纹图谱测定方法，步骤如下①、将药用石斛剪断后，低温干燥，粉碎，过筛备用；②、取适量样品于锥形瓶中，添加适量一元醇，超声20min，过滤，滤渣用一元醇淋洗多次，合并滤液，滤液挥至近干，③、用一元醇溶解，定容，再用0.45μm微孔滤膜过滤后作为供试品溶液；④、分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，进行分析。上述步骤中检测条件为色谱柱C18柱(ODS柱)流速1ml/min检测波长254nm柱温25℃流动相乙腈(A)-1‰醋酸(B).洗脱梯度5％→32％A(0→30min)，32→65％A(30→55min)，65→32％A(55→60min)。2.根据权利要求1所述的石斛色谱指纹图谱检测方法，其特征在于步骤①中过筛是过40-300目筛。3.根据权利要求1所述的石斛色谱指纹图谱测定方法，其特征在所述的于一元醇为甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇中的任意一种。4.根据权利要求l所述的石斛色谱指纹图谱测定方法，其特征在于所述的药用石斛为金钗石斛DendrobiumnobileLindl.、环草石斛D.loddigesiiRolfe.、黄草石斛D.chrysanthumWall.、马新更石角斗D.fimbriatumHook.Var.oculatumHook.、铁皮石角斗D.candidumWall,exLindl.中的任意一禾中。全文摘要本发明公开了一种石斛色谱指纹图谱测定方法，步骤如下①将药用石斛剪断后，低温干燥，粉碎，过筛备用；②取适量样品于锥形瓶中，添加适量一元醇，超声20min，过滤，滤渣用一元醇淋洗多次，合并滤液，滤液挥至近干，③用一元醇溶解，定容，再用0.45μm微孔滤膜过滤后作为供试品溶液；④分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，进行分析。本发明可以方便快捷的得到色谱图，而且原材料易得，工艺简单，技术先进。据文献记载，可以作为药用石斛的石斛属植物有近100种。而且本发明通过多成分、多指标来控制产品的质量，相比上述质量控制指标，结果更加可靠，原材料易得，工艺简单。文档编号G01N30/02GK101726547SQ20081021849公开日2010年6月9日申请日期2008年10月15日优先权日2008年10月15日发明者徐吉银,成金乐,易伦朝,李先霞,梁逸曾申请人:中山市中智药业集团有限公司