专利名称：一种胶体金试纸条及其制备方法和应用的制作方法
一种胶体^K条及其制备旅和鹏
狱领域
本发明属ra防兽医^^^域，具体是涉及一种胶体^K条及其先恪皿和自。 背景駄
猪Wi毒(swine influenza virus, SIV)属于正粘病#^斗A型tW^毒属，能弓l跡同日龄、 '鹏脷品种的猪姓急性、热性和高度撤虫性HWi传鵷，其I(S^上以魏、高热、 、 0 困难、 衰竭和死亡为特征。1918年美国首 M隨了猪M的暴发，1930年shope从猪体中首次分离了HlNl
MM猪Wi毒。迄今为止，猪繊B3S布美、欧、亚、非等世赂地。目前，a^a现的siv包括
H1N1、 H1N2、 H1N7、 H3N2、 H3N6、 H4N6、 H5N1和H9N2等亚型，但以经典H1N1、麟H1N1和纵H3N2 鹏雜为主。我国猪繊于1969年由台湾17 11， 1991年首7:fe^猪群中分离到HlNlMS猪鹏 病毒。郭元吉(1985)、倪汰忠(2000)、张苏华(2002)、魏燕(2003) ^ 国不同地区做了血清 翔査，结果表明，随年份的递增，我国猪繊阳性 加。
目前，对w^毒,测方法，i^r病毒分离、血辭诊断以及針生物^m鹏毒分离
时间长，要求斜牛高，分离率低，而^ft患鈴'鹏与咴fiS^份血^fflfim懶!l^^确认，又不倉扱 时进fiH会断，因此，U^两种方法在4顿中穀i瓶大的限制，而免iS^标法(Iranunochromatography Assay) ^^^+￥^初 ^的，因其'鹏、操ffi^便、i^f鵂定、可室温f紘、不易污染的特点得 至lj广泛的自。它^5^和技术、印i^、 feS标己fe^n层析fe^的组合。将^MC体、胶体金 禾Mft体固相化，与样娜附賴斗等组合在"^，伟恪出^a祈会i^条，鹏时只需^E该试条下 插入样品溶液，数^1>就可以判 果。与^5滲搶法比较，稳定'断，操作更简便、快速，且由于为
刊条形式，无箭繊呆存，艇也方便，腿目前关豫繊讓病毒的检测未见顿用的^a^
者其它的检测工具。
发明内容
本发明的目的^MI—种胶体^R条及其帝'恪方法和自，會^^忠见有^^的±^需求。 一种胶体^K条，^ffi在于有一^W、 ^!寸上面的中^^占^SM， ^> 中^"一条 包被猪繊H1N1病^ft体^^测凝卩一^SI颇鼠IgG抗体^g律蛾,包鹏的上面左右分另胖嫩一涂 S^标抗体的自乡书繊和fl7條；涂S^标抗体的l^^imi:面粘贴一样品垫。
± 体^￡条的鹏方法，^ttffi在于鄉恪包鹏，将用包被缓冲W^的猪繊H1N1病毒 的单克隆抗体MtMHlNl病毒的多克隆抗，卩抗鼠IgG抗# ，并将二者分别喷于5^^邗t)i中部上，分别形^^测线和控帝践，再制备涂l^标抗体的鹏辩贜，然后将包鹏占贴繊寸上，
在包鹏的上面左右分别糊占一涂総示抗体的,书t^fl吸纖涂敏标抗体的鹏維Wh面 粘贴一样品垫， ^fe，切割即得胶体^R条。 i^体^S条在检测猪WHlNl病毒中的卿。
本发明利用现代国际ft^的胶体^Sl析技术，^t共一种王m^户、基层自测等用W^测猪流 感H1N1病毒的胶体叙^K条，该]#^条具#|#异性强、灵鹏高、检Wig^^^,且不^gffl仪器 设备，^:f纖，操作简便，倉na^于恥"fe^户、基层及个A^^^MHlNl病毒的^Mo
附图为本发明i^K条的纵剖结构祿图。
具体实航式
胶体^E条的制备
發鹏應l病毒的单克隆抗体细麟的帝恪和跪
慢11 ^有讓的鸡臓鎌，并加入氯化钠，使其终被为0,5mol/L，再加入腦(錢百分 数)的聚乙二醇6000 (PEG6000)， 4卩过夜，8000r/min离心30射中，iB^^:淀，綱^:棚磷 ^S缓冲液(PBS)溶解，4。C过夜，1000Qr/min离心l小时,所M^淀即为繊的病毒，储終20。C低 温鹏中备用。
从-20'C^aftKfl^出M的病^WS,给B腦/C小鼠多点皮下鄉(0. 5ml /只)，间隔15天， 共兔虔3次，融合前3日，在小繊腔以Jd^i的病毒0.25nil的if[JgSit行攻击。用含10%体积百 分数小牛血清的DMEM培养SP2/0细鹏Q，的BALB/C鼠的淋，胞，分别按2X107和2乂108比例 用聚乙二醇1500 (PEG1500)融合，将融合孑Lh清液分别加在睹流感HlNl病^d0、包被的聚乙烯96孔 紅，用ELISA法检测，确定细胞阳性孔。将检测所得9个阳性株以有限^^St行亚克隆，驗获. 得4株。将亚克[t^得的单鄉胞軒体外进行传微薪，并进行反复液氮冻存和复苏，产生猪繊 H皿病毒单克^[体阳性率l(m，且^t稳定分泌杭体的畲幼，其ELISA效ifT^IJ 1:1000以上。在无 菌劍牛下每只小^Jtl空^lt液^^蜡0.5ml，一周jg^只小ra^^JT:fe^为1-3XItf / 0.2ml的 杂魏细胞。^ffl麟7-10琉跡1I^E前一^^7K， -2(TC下保存。細M^沉淀法粗 提，进而用HITraprProteinA^g化，经SDS-PAGE电泳縱，iZM示单""S白带。細NaSCN竞争 ELISA魏，测定其E&的下離，来间接反映其抗体亲合力的大小。选媒中亲和力,的3株，进行 3EMf^，用免,散^J^II^^上清液的单^S行Ig亚类的检测，，3株单克隆抗体的亚类分 别是IgGl有一株；IgG2a有一株；IgG2b有一株。用相力口 ELISA 、^(寸非lgM的3株单抗fim^结合位^t行检测。结果表明，这3株中，有三种不同的抗原结合位点，对^t流感H皿病毒多具有很好的 特异性。
包繊4的制备
包被缓净液的帝格将0,05M、 pH9.6的碳^^冲液(PBS)，用0.22uM^滤，置4。C备用，摘 期7天。
封闭缓冲液的制备将0.01M、 pH7.0的PBS，用a22u^l过，置4。C备用，有效期7天。 配帝對闭工作液将含2XBSA、 2%腳謝、O.OIM、 pH7.0的PBS，用0.22u^il，置4。C备用， 有娜3天。
检测线6制备调^m鹏，喷體为25微升/35鹏，用包被缓冲M^^f鹏H皿病毒的 单克隆抗体，浓度为70ug/ml，在硝酸纟形繊中部i^(J线，室温晾干20辦。
控制践7帝恪iW^J^几，喷M:为25微升/35M^，用包被缓冲 ^^抗鼠IgG抗体，,为 2呢/ml，在5^^fitRh^线，，与检测^F行，两线间隔5咖，自lfc^匀，室温晾干20，。该 两綱的液体分别渗入硝酸辦蝶中，即分别为检测线6和控制线7。
包鹏4制备用J^f闭工作液将含有检测线6和控制线7的硝酸辦蝶37'C封闭60^H中，取 出后置37。C烘干^S两小时，^j"^备用。
涂S^标抗体的鹏辩繊3的带腊
m^酸的配制将10g^^TOl000mi;5^水溶解a5^17。溶液，置4。C备用，W^期3天。
機l钠的S2fi:用双蒸水溶^t^H钠，@2^1%溶液，置4。C备用，有$鄉3天。
0.1M碳,的配制将13.8g碳,用1000ml麟水配制成0.1M碳,溶液，0.22umM， 置4。C备用，裕娴7天。
^H3^涤液的配制将20g BSA用1000ml O.OIM、 pH7.0 PBS Ififi^2XBSA溶液，0.22uE^， 置4。C备用，有 15天。
金标抗体保存液的配置将10g BSA、 5g鹏謝粉、0.5g NaN3和lml Tween-20在1000 ml 0. OIM、 pH7.0PBS中溶解，用0.22uM^1，置4'C备用，^S!15天。
胶体金的鄉J:用驗嫌1%敏^#成0.01%，置封户煮沸，按每100新0.01%敏, 入4新1%機^3^,继续煮沸，節贼体呈^L色即停lti口热，mPM^斷补足勿]C。夕卜7鹏 纯净，透亮，无沉淀和激孚物。
金标抗体的伟恪用0.1M ^ 调胶体金pH輕7.6,按10微^C体/^^胶体劍[]^^t繊 H1N1病毒的单克隆抗体，混匀，静置30併中，12000rpm离心30分钟，弃上清，沉翻^H己洗涤液洗涤两次，雜一 條去上清，将沉湖十分之一初始胶体金mR的金标抗体保^^溶解，置4。C备用，
将fei^ 的胶体金购地!赃^^辩Wi:， WF溶液铺10平方鹏，千燥，繊，置4。C备用。 胶体^R条的制作
^/Sl寸l、样品垫2和贩J^5是本领:^ifflWM料。将±^包 4、 S^标抗体的^^辩赚 3、謝l、样品垫2和吸條5依次粘贴總，辭IK^，驗将该1# 刀割跡同驗的微条 即可。
战的胶体^K条在检测猪繊fflNl病毒中的鹏
用本胶体^K条检测血液样品中猪MH1N1病毒时，如果检测血液样品中含有猪皿H1N1病毒, 将该液#^加在本鄉条的样品垫2上，该液^/^&^K条;aAi^K条上^^标抗体的^^辩隹 膜3中时，血液样品中含有的猪流感H1N1病毒与本^K条上涂S^标抗体的鹏辦離3中的猪 H1N1病毒的单克隆iJt体形^fg应的复，，前行与包 4上的猪ffi H1N1病毒的单克隆抗体^^ 、MH1N1病毒的多克隆抗体形職红機条，即在检测线6鄉雌红色絲，纖前行与包鹏4 中的抗鼠IgG抗体形^mt機条，艮P^S帝践7 ^^^mt色絲。如^S帝践7不出5赠红色絲， 则说明该^K^St如果1^测血液样品中不含有^W H1N1病毒，贝i脸测线6处不会出11^E色，， 而控制线7^i、定仍出现紫红色鄉；如^^J线7不出5J^L色絲，贝(脱明该鄉条錢。
本^K她可以用来检溷赌口J^^肛门拭子中含有的液解品，把口J^t肛门拭子中的液体离 心后，将所得的液欄加在本微条的样品垫2上，出现的结果和±^1相同。
权利要求
1、一种胶体金试纸条，其特征在于有一底衬(1)、该底衬(1)上面的中部粘帖一包被膜(4)，该包被膜(4)中部有一条包被猪流感H1N1病毒抗体的检测线(6)和一条包被抗鼠IgG抗体的控制线(7)，包被膜(4)的上面左右分别粘帖一涂覆金标抗体的玻璃纤维膜(3)和吸水纸(5)；涂覆金标抗体的玻璃纤维膜(3)上面粘贴一样品垫(2)。
2、 根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于所述的检测线(6) 中包被的猪流感HlNl病毒的抗体为高纯度的抗单克隆抗体和/或多克隆抗 体。
3、 权利要求1所述的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于先制备包 被膜(4):将用包被缓冲液稀释的猪流感H1N1病毒的单克隆抗体或抗猪 流感H1N1病毒的多克隆抗体和抗鼠IgG抗体稀释，并将二者分别平行地 喷于硝酸纤维膜中部上，渗入硝酸纤维膜后分别形成检测线(6)和控制线(7);再制备涂敷金标抗体的玻璃纤维膜(3);然后将包被膜(4)粘贴在 底衬(1)上面的中部，在包被膜(4)的上面左右分别粘帖一涂覆金标抗 体的玻璃纤维膜(3)和吸水纸(5);涂覆金标抗体的玻璃纤维膜(3)上 面粘贴一样品垫(2)，做成大板，切割即得胶体金试纸条。
4、 权利要求1所述的胶体金试纸条在检测猪流感H1N1病毒中的应用。
全文摘要
一种胶体金试纸条及其制备方法和应用，该试纸条有一底衬、该底衬上面的中部粘帖一包被膜，该包被膜中部有一条包被猪流感H1N1病毒抗体的检测线和一条包被抗鼠IgG抗体的控制线，包被膜的上面左右分别粘帖一涂覆金标抗体的玻璃纤维膜和吸水纸；涂覆金标抗体的玻璃纤维膜上面粘贴一样品垫。本发明利用现代国际最先进的胶体金免疫层析技术，提供一种现地农户、基层自测等用的检测猪流感H1N1病毒的胶体金试纸条，该试纸条具有特异性强、灵敏度高、检测速度快等优点，且不需使用仪器设备，成本低廉，操作简便，能广泛应用于现地农户、基层及个人对于猪流感H1N1病毒的检测。
文档编号G01N33/569GK101614737SQ200910016309
公开日2009年12月30日 申请日期2009年6月2日 优先权日2009年6月2日
发明者凌红丽, 崔尚金, 蒋贻海, 贾德强, 高亚东 申请人:青岛康地恩药业有限公司;青岛宝依特生物制药有限公司