专利名称：一种乳酸链球菌素的hplc检测方法
技术领域：
本发明涉及发酵液中目标产物的检测，尤其涉及一种乳酸链球菌素的高效液相色 谱(High Performance Liquid Chromatography, HP1X)检测方法。
背景技术：
乳酸链球菌素(Nisin，又称乳球菌肽或乳链菌肽)是由乳酸链球菌(Lactococcus lactis ssp. lactis)在代谢过程中合成和分泌的具有较强抑菌作用的小分子肽，也是目前 研究最多、应用较广的细菌素之一。Nisin是目前在国际上允许商业化生产的少数天然食 品防腐剂之一，广泛应用于乳制品、发酵饮料、罐藏食品、肉类及肉制品的防腐保鲜，它能够 有效抑制引起食品腐败变质的革兰氏阳性细菌(G+)及病原菌的繁殖。与其他防腐剂相比， Nisin是由天然存在的Lactococcus菌产生且对蛋白酶特别敏感，在消化道中很快被a -胰 凝乳蛋白酶分解。因此它对人体基本无毒性，也不与医用抗生素产生交叉抗药性，能在肠道 中无害地降解。其结构见图1。 Nisin于1928年被Rogerst Whittier首先发现。最早实现工业化生产的是英国 Aplin&Berrett公司，随后美国、英国等50多个国家和地区也相继批准Nisin为天然食品防 腐剂。我国对Nisin的研究始于1989年。我国实现工业化生产的菌种L. laticsAL2产生 的是NisinZ。 1990年，Nisin被列入我国国标GB2780-86的1990年增补品中。
早期，在Tramer等提出琼脂扩散法之前，人们普遍采用的是试管稀释技术和浊度 测定法(Turbidity Assay) 。 1964年Tramer和Fowler建立了琼脂扩散法的基本方法，但 由于nisin的分子量较大，酸性条件下溶解性较好，而在中性环境下溶解度很小，所以很难 在琼脂中扩散。后来Wolf等进一步对琼脂扩散法进行了优化。他们优化的参数有指示 菌、琼脂的深度和浓度、Tween20的浓度、培养基中所加的缓冲剂等。Wolf等的改进方法 与Tramer等的最初的方法相比，精确度提高了 57%，准确性提高了 12%，因此目前用于检 测食品中乳链菌肽含量的最常用的方法是琼脂扩散法(分析检验食品科学2005， Vol. 26， No. 7175，管碟法测定nisin效价的改进；食品科学2007， Vol. 28， No. 03175，琼脂扩散法测 定乳链菌肽效价的优化；国外医药抗生素分册2004年9月第25巻第5期，细菌素Nisin的 检测方法)。 HPLC与琼脂扩散法比较具有快速，准确，重复性好等优点。现有HPLC技术提到 用RP-HPLC Hi-Pore RP-318 (BioRad) 、250xl0mm的柱，在30°C使用流动相A为10 % (V/ V)乙腈添加O. 1X三氟乙酸，流动相B为90%乙腈添加0.07%三氟乙酸梯度洗脱。流 动相B的起始浓度为25%终止浓度为28%，且在梯度洗脱中浓度的变化为逐渐递增的 (Eur. J. Biochem. 201，581-584，1991， Identification and characterization of the lantibiotic nisin Z， ,tural nisin variant)。用此方法分析样品的时程长，近1小 时，梯度洗脱基线漂移，造成积分困难，样品测定结果的重现性、准确性等差。发明人按该方 法而HPLC谱中没有目标峰。 因此，本领域迫切需要提供一种运行时间短、基线稳定、分离度良好的检测乳酸链球菌素的HPLC方法。
发明内容
本发明旨在提供一种乳酸链球菌素的高效液相检测方法。 在本发明中，提供了一种乳酸链球菌素的检测方法，所述的检测方法为高效液相 色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)，其流动相中含有乙腈和水，乙腈 的起始浓度为5-25vol. %，最终浓度为35-lOOvol. %。 在另 一 优选例中，流动相中的乙腈在15-40分钟从5-25vol. %递增至 35-100vol. %。 在另 一 优选例中，流动相中的乙腈在20-35分钟从10-22vol. %递增至 35-80vol. %。 在另 一 优选例中，流动相中的乙腈在15-30分钟从10-22vol. %递增至 50-70vol. %，然后在5-10分钟从50-70vol. %递增至90-100vol. %。
在另 一 优选例中，流动相中的乙腈在15-30分钟从10-22vol. %递增至 50-70vol. %，然后在1-3分钟保持50-70vol. %，再在5-10分钟从50_70vol. %递增至 90-100vol. %。 在另一优选例中，所述的方法包括步骤 (1)所述流动相中的乙腈在2-5分钟内保持为5-25vol. % ; (2)所述流动相中的乙腈在15-40分钟从5-25vol. %递增至35-lOOvol. % ;禾口 (3)所述流动相中的乙腈在1-5分钟从35-100vol. %递减至5_25vol. %。 在另一优选例中，步骤(2)中所述流动相中的乙腈在20-35分钟从10-22vo1. %递
增至35-80vol. %。 在另一优选例中，步骤(2)中所述流动相中的乙腈在15-30分钟从10-22vo1. %递 增至50-70vol. %，然后在5-10分钟从50-70vol. %递增至90-100vol. %。
在另一优选例中，步骤(2)中所述流动相中的乙腈在15-30分钟从10-22vo1. %递 增至50-70vol. %，然后在1-3分钟保持50-70vol. %，再在5-10分钟从50_70vol. %递增 至90-100vol. %。 在另一优选例中，步骤(1)中所述流动相中的乙腈在2-5分钟内保持为 5-25vol. %。 在另一优选例中，步骤(1)中所述流动相中的乙腈在2-5分钟内保持为 10-22vol. %。 在另一优选例中，在步骤(1)前还包括步骤 将乳酸链球菌发酵液和盐酸混合、离心得到含有乳酸链球菌素的上清液。
在另一优选例中，本发明使用的HPLC的流动相中还含有0. 05-0. 2vol. %的有机 酸；更佳地，含有0. 08-0. 12vol. %的有机酸；所述的有机酸选自甲酸、乙酸、三氟乙酸、或 丁酸；优选为三氟乙酸。在另一优选例中，所述HPLC使用反相C4色谱柱，检测波长为200-220nm。 据此，本发明提供了一种运行时间短、基线稳定、分离度良好的检测乳酸链球菌素
的HPLC方法。
图1是乳酸链球菌素结构图。 图2是Nisin对照品(标准品)的HPLC检测图谱。
图3是Nisin样品的HPLC检测图谱。
具体实施例方式
发明人经过广泛而深入的研究，通过大量的试验、摸索得到了一种乳酸链球菌素 HPLC检测方法。发明人发现了有效分离、检测乳酸链球菌素的乙腈和水的体积比，进一步 地，发明人还发现在一定的时间内使乙腈和水的体积比逐步变化(即采用一定的梯度洗脱 方式)，可以得到更佳的分离、检测效果。 发明人使用反相C4色谱柱，流动相中含有乙腈和水，其中乙腈的起始浓度为 5-25vol. %，其终止浓度为35-lOOvol. %。检测波长为200-220nm。流动相中还可以含有 少量的有机酸，所述的有机酸选自甲酸、乙酸、三氟乙酸、或丁酸；优选三氟乙酸。
在本发明的一个优选实施例中，流动相中含有流动相A和/或流动相B;所述的流 动相A中水和三氟乙酸的体积比为100 : 0. l，所述的流动相B中乙腈和三氟乙酸的体积比 为100 : 0. 1。其中流动相B的起始浓度为5-25vol. %，其终止浓度为35-lOOvol. %。
在另 一 优选例中，所述流动相中的流动相B的体积百分数在15-40分钟从 5-25vol. %递增至35-100vol. %。 在另 一 优选例中，所述流动相中的流动相B的体积百分数在20-35分钟从 10-22vol. %递增至35-80vol. %。 在另 一 优选例中，所述流动相中的流动相B的体积百分数在15-30分钟从 10-22vol. %递增至50-70vol. %，然后在5-10分钟从50_70vol. %递增至90-100vol. %。
在另 一 优选例中，所述流动相中的流动相B的体积百分数在15-30分钟从 10-22vol. %递增至50-70vol. %，然后在1-3分钟保持50_70vol. %，再在5_10分钟从 50-70vol. %递增至90-100vol. %。 在本发明的一个优选例中，所述的方法包括步骤 (a)所述流动相中的流动相B的体积百分数在2-5分钟内保持为5-25vol. % ;
(b)所述流动相中的流动相B的体积百分数在15-40分钟从5-25vol. %递增至 35-100vol. % ;禾口 (c)所述流动相中的流动相B的体积百分数在1-5分钟从35-lOOvol. %递减至 5-25vol. %。 在另一优选例中，步骤(b)中所述流动相中的流动相B的体积百分数在20-35分 钟从10-22vol. %递增至35-80vol. %。 在另一优选例中，步骤(b)中所述流动相中的流动相B的体积百分数在15-30 分钟从10-22vol. %递增至50-70vol. % ，然后在5-10分钟从50_70vol. %递增至 90-100vol. %。 在另一优选例中，步骤(b)中所述流动相中的流动相B的体积百分数在15-30分 钟从10-22vol. %递增至50-70vol. %，然后在1—3分钟保持50_70vol. %，再在5—10分钟从50-70vo1. %递增至90-100vol. %。 在另一优选例中，步骤(a)中所述流动相中的流动相B的体积百分数在2-5分钟 内保持为10-22vol. %。 在另一优选例中，步骤(a)中所述流动相中的流动相B的体积百分数在2-5分钟 内保持为10_22vol. %。 在另一优选例中，在步骤(a)前还包括步骤 将乳酸链球菌发酵液和盐酸混合、离心得到含有乳酸链球菌素的上清液。
在本发明的一个优选实施例中，起始流动相B为5-22vol. %，更佳地为20vol. %， 等度洗脱3分钟；随后流动相B连续性递增到40-70vo1. %，更佳地为40vol. %，洗脱12-30 分钟，更佳地为27分钟；最后2分钟流动相B回到20vol. %，平衡。 本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示
的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、
均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特
征的一般性例子。 本发明的主要优点在于 1、优化检测方法，使产物峰的理论塔板数大大提高，且出峰时间縮短近一倍，试剂 用量和人力得到了大大的节省，与杂质峰达到很好的分离，从而让HPLC检测真正达到快 速、准确的目的； 2、运行时间短，仅为30分钟；出峰早，16分钟便可。 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按
重量计。 本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在 100毫升的溶液中溶质的重量。 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文 中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明实施例中的试验条件如下
仪器和色谱条件 仪器Waters公司高效液相色谱仪(Waters 2996 二极管阵列检测器、Waters1525 二元HPLC泵)色谱柱Waters symmetryC4 (5 ii m， 3. 9 X 250mm)柱编号000286
流动相A :双蒸水溶液加入0. 1 %三氟乙酸
流动相B :乙睛溶液加入0. 1%三氟乙酸
流速lm/min
柱温30。C 检测波长选用215nm作为检测波长。
溶液的制备
6
对照品溶液精密称取Nisin对照品约10mg，置10ml容量瓶中，用0. 02NHC1溶解 并稀释至刻度，作为对照品溶液。 样品溶液斜面上刮取乳酸链球菌(Lactococcus lactis ssp. lactis)，将其接 入种子液(配方为大豆分离蛋白0. 5%，蛋白胨0. 5%，酵母膏0. 25%，牛肉膏0. 5%，葡萄 糖0. 5%，抗坏血酸0. 05%， Na2HP04 12H20 1. 0%， MgS04 7H20 0. 012%， p朋.8)37。C培养 20h。将种子液接入发酵液中(培养基配方为蔗糖2.0%，酵母膏3.0%，蛋白胨2.0%，硫 酸镁O. 02%，磷酸二氢钾1.0%， NaClO. 2%，吐温-800. 5%， p朋.8)30。C发酵12-14小时， 停止发酵，取一定量的Nisin发酵液，用0. 02NHCL调pH为2. 0，高速离心12000-14000rpm， 10分钟，取上清用水膜过滤后，作为样品溶液。
实施例1 起始流动相B :流动相A = 20 : 80等度洗脱3分钟，随后流动相B连续性递增 从20%逐渐升到40%洗脱27分钟，最后2分钟流动相B回到20% ，平衡。此方法下对照品 保留时间为16. 38min，且分离度1. 08，理论塔板数达到16738。见图2和图3。
实施例2 起始流动相B :流动相A = 20 : 80等度洗脱3分钟，随后流动相B连续性递增 从20 %逐渐升到40 %洗脱12分钟，最后2分钟流动相B回到20 % ，平衡。此方法下出峰时 间为10min左右，基线漂移，理论塔板数为12800。
实施例3 起始流动相B :流动相A = 20 : 80等度洗脱3分钟，随后流动相B连续性递增 从20%逐渐升到60%洗脱20分钟，随后流动相B继续递增从60%升至80%洗脱5分钟， 流动相B保持80%洗脱2分钟，最后2分钟流动相B回到20%，平衡。此方法下出峰时间 为17min左右，且分离度较好，理论塔板数为11600。
实施例4 起始流动相B :流动相A = 20 : 80等度洗脱3分钟，随后流动相B连续性递增 从20%逐渐升到60%洗脱12分钟，随后流动相B继续递增从60%升至80%洗脱2分钟， 流动相B保持80%洗脱2分钟，最后2分钟流动相B回到20%，平衡。此方法下出峰时间 为9min左右，基线漂移，理论塔板数为11000。
实施例5 起始流动相B :流动相A = 20 : 80等度洗脱3分钟，随后流动相B连续性递增 从20%逐渐升到60%洗脱23分钟，随后流动相B继续递增从60%升至80%洗脱5分钟， 流动相B保持80%洗脱2分钟，最后2分钟流动相B回到20%，平衡。此方法下出峰时间 为18min左右，理论塔板数为12000。
实施例6 起始流动相B :流动相A = 5 : 95等度洗脱3分钟，随后流动相B连续性递增从 5%逐渐升到60%洗脱27分钟，流动相B :流动相A = 60 : 40等度洗脱5分钟，随后流动 相B继续递增从60%升至100 %洗脱5分钟，流动相B保持100 %洗脱5分钟，最后2分钟 流动相B回到5%，此方法下出峰时间为25min左右，理论塔板数为14100。
实施例7 起始流动相B :流动相A = 10 : 90等度洗脱3分钟，随后流动相B连续性递增从10%逐渐升到60%洗脱27分钟，随后流动相B继续递增从60%升至100 %洗脱5分钟， 流动相B保持100%洗脱2分钟，此时出峰时间为20min左右，且分离度较好，理论塔板数为 14800。 实施例8 起始流动相B :流动相A = 22 : 78等度洗脱3分钟，随后流动相B连续性递增 从22%逐渐升到70%洗脱27分钟，最后2分钟流动相B回到22%，平衡。此方法下出峰时 间为19min左右，基线平稳且分离度较好，理论塔板数为15000。 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范 围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术 实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将 被视为涵盖于该权利要求范围之中。
权利要求
一种乳酸链球菌素的检测方法，其特征在于，高效液相色谱(HighPerformance Liquid Chromatography，HPLC)的流动相中含有乙腈和水，乙腈的起始浓度为5-25vol.％，最终浓度为35-100vol.％。
2. 如权利要求l所述的检测方法，其特征在于，流动相中的乙腈在15-40分钟从 5-25vol. %递增至35-100vol. %。
3. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，流动相中的乙腈在20-35分钟从 10-22vol. %递增至35-80vol. %。
4. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，流动相中的乙腈在15-30分钟从 10-22vol. %递增至50-70vol. %，然后在5-10分钟从50_70vol. %递增至90-100vol. %。
5. 如权利要求l所述的检测方法，其特征在于，流动相中的乙腈在15-30分钟从 10-22vol. %递增至50-70vol. %，然后在1-3分钟保持50_70vol. %，再在5_10分钟从 50-70vol. %递增至90-100vol. %。
6. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的方法包括步骤(1) 所述流动相中的乙腈在2-5分钟内保持为5-25vol. % ;(2) 所述流动相中的乙腈在15-40分钟从5-25vol. %递增至35-lOOvol. % ;禾口(3) 所述流动相中的乙腈在1-5分钟从35-lOOvol. %递减至5-25vol. %。
7. 如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述流动相中的乙腈在 20-35分钟从10-22vol. %递增至35_80vol. %。
8. 如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述流动相中的乙腈在 15-30分钟从10-22vol. %递增至50-70vol. %，然后在5-10分钟从50_70vol. %递增至 90-100vol. %。
9. 如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述流动相中的乙腈在 15-30分钟从10-22vol. %递增至50-70vol. %，然后在1-3分钟保持50_70vol. %，再在 5-10分钟从50-70vol. %递增至90-100vol. %。
10. 如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述流动相中的乙腈在 2-5分钟内保持为5-25vol. %。
11. 如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述流动相中的乙腈在 2-5分钟内保持为10-22vol. %。
12. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，流动相中还含有O. 05-0. 2vol. %的有 机酸；所述的有机酸选自甲酸、乙酸、三氟乙酸、或丁酸。
13. 如权利要求12所述的检测方法，其特征在于，流动相中还含有0.08-0. 12vol. %的有机酸。
14. 如权利要求12所述的检测方法，其特征在于，所述的有机酸为三氟乙酸。
15. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，使用反相C4色谱柱，检测波长为 200-220nm。
16. 如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，在步骤(1)前还包括步骤 将乳酸链球菌发酵液和盐酸混合、离心得到含有乳酸链球菌素的上清液。
全文摘要
本发明公开了一种乳酸链球菌素的高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)检测方法，流动相中含有乙腈和水，乙腈的起始浓度为5-25vol.％，最终浓度为35-100vol.％。
文档编号G01N30/34GK101776665SQ20091004520
公开日2010年7月14日 申请日期2009年1月13日 优先权日2009年1月13日
发明者程晴华, 蒋家琛, 赵文杰, 赵波, 顾敏, 魏晓东 申请人:上海医药工业研究院