专利名称：IgG型类风湿因子酶免疫检测方法
技术领域：
本发明涉及一种类风湿因子分型酶免疫检测方法，主要涉及一种IgG型类风湿因 子酶免疫检测方法。
背景技术：
类风湿因子(rheumatoid factor，简称RF)是一种抗IgG抗体，能与抗原决定簇即 IgG-Fc片段上某些区间起反应，故亦称抗IgG-Fc片段抗体。类风湿因子按Ig 型别共有五种，即 IgM-RF、IgG-RF, IgA-RF, IgD-RF, IgE-RF。作 为自身抗体的类风湿因子，尤其是IgM-RF、IgG-RF可与抗原IgG在体内特异性结合形成抗 原抗体复合物---免疫复合物(简称IC)，如未能被机体及时清除，即在体内血循环中形成 循环免疫复合物(简称CIC)，一定条件下易沉积在关节滑膜、浅表及其它器官组织的血管 壁上，一旦激活补体可引发IC介导的超敏炎症反应，使局部出现充血水肿、坏死和中性粒 细胞浸润为特征的炎症性反应和组织损伤。如发生在关节滑膜处，可造成滑膜炎，如未能控 制会逐渐累及关节囊、软骨直至骨的破坏，使关节损伤，表现为类风湿关节炎。与其它免疫球蛋白Ig类别的RF不同，IgG-RF因具有自身聚合形成免疫复合物的 特点而在类风关的发病机理中起重要作用，50%以上的类风关患者可检出IgG-RF，类风关 患者并发血管炎、肺纤维样病变及类风湿结节与IgG-RF有明显相关性，高水平的IgG-RF可 能表明予后不良。现国内绝大多数采用的类风湿因子凝集试验，其测得的主要是IgM-RF，因IgM是 五聚体，可与抗原载体胶元形成凝集颗粒而能够判定结果。但IgG-RF因IgG是单体分子， 无法采用凝集试验检测，同时也因抗原和被测IgG-RF均为IgG而使一般检测技术无法区别 抗原和IgG-RF，故IgG-RF通常采用酶免疫技术(简称ELISA)，以与正常人IgG有种系差异 的兔IgG或将人IgG加热使其变性导致异质性的人变性IgG作为包被抗原，再以酶标记的 抗人IgG作为第二抗体来检测IgG-RF。此法旨在将作为抗原的IgG对需检测的IgG-RF干 扰排除，但实际依然存在交叉反应影响而结果准确性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一是提供一种IgG型类风湿因子酶免疫检测方法。为解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案来实现(1)试剂及标本准备(2)在包被板微孔中分别加入八点IgG-RF标准品(0、40、80、160、320、640、1280、 2560IU/ml)、稀释好的标本和质控品各50 150 μ 1，放置35 39°C水浴箱中孵育1 3 小时；(3)将各孔液体弃净，用洗涤液洗涤，拍干；(4)各孔加入50 150 μ 1酶标记物。放置35 39°C水浴箱中，孵育0. 5 2小 时；
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(5)重复步骤(3)；(6)各孔加入50 150 μ 1预先稀释好的底物，放置35 39°C水浴箱中孵育10 30分钟；(7)各孔加入25 100 μ 1终止液，震荡混勻；(8)用酶标仪在490nm波长用0标准管校零读取吸光值A ； (9)计算以IgG-RF浓度为横坐标，相对应的吸光值A为纵坐标，在半对数纸上画 出标准曲线，然后根据标本的吸光值A在标准曲线上求IgG-RF含量；其中，步骤(2)中的包被板微孔为IgG-Fc片段包板。在所述步骤(1)中的试剂及标本具体为①稀释液0. 01M, PH7. 2磷酸盐缓冲液。由0. OlM磷酸氢二钠溶液与0. OlM磷酸二氢钠溶液按1 4比例混合，并每100 毫升混合溶液加入牛血清白蛋白0. 3克即成。②洗涤液0. 01M, PH7. 2磷酸盐氯化钠缓冲液由0. OlM磷酸氢二钠溶液与0. OlM磷酸二氢钠溶液按1 4比例混合，并每100 毫升混合溶液加入氯化钠0. 85克即成。③显色剂临用前按以下比例配置底物邻苯二胺(简称0PD)原液5毫升；PH5. 0底物缓冲液10毫升0. 066M磷酸氢二钠溶液等量加入0. 033M柠檬酸溶液；3 ^H2O2 70 毫升。④终止液2M H2SO4溶液。⑤血清标本用稀释液作1 100稀释。IgG-Fc片段由上海德波生物技术有限公司提供，即由人IgG用胃蛋白酶水解，再 以DEAE纤维素层析柱和S印hadeXG200柱层析提取并纯化而成，以1 500稀释的IgG-Fc 片段包板，用牛血清白蛋白(简称BSA)封闭。步骤⑷中的酶标记物为抗IgG-F(^ib1)2片段抗体。酶标记物，即酶标抗体(即二抗)，选用抗IgG-F(^1)2片段抗体，可以按Nakene 法，采用Sigma公司产HRP (PZ3. 0)标记同样由Sigma公司提供的抗人IgG Fab片段抗体而 成，使用效价为1 3800。按Nakane法。步骤(2)中的IgG-RF标准品采用丹麦哥本哈根生物学标准实验室产品，IgG-RF含 量为 1. 54X 106IU/ml。本发明与现有技术的主要区别在于1、采用人IgG经胃蛋白酶切断后得到的Fc片段作为包被抗原。人体发现的抗IgG抗体实际有很多种，这些抗体因针对IgG分子的不同区域(抗 原决定簇)而不同，只有作用于IgG-Fc片段(CH2、CH3)上的抗体是类风湿因子。2、选用抗IgG-F(^ib1)2片段抗体作为酶标抗体。为了避免酶标抗体(二抗)在与IgG_RF(结合在包被抗原Fc片段上)结合的同 时又与包被抗原IgG-Fc片段发生作用，发明人将酶标抗体(二抗)由抗IgG抗体改为抗 IgG-F(Bb1)2片段抗体，这样酶标抗体(二抗)只与结合在包被抗原上IgG-RF的F(ab%片 段作用，不与包被抗原Fc片段结合，形成IgG-Fc片段-IgG-RF-抗IgG-F (ab1) 2抗体的免疫复合物，完全避免了由交叉反应导致的结果不准确。综上所述，发明人通过利用IgG分子结构、抗原抗体反应特异性的特点，即以 IgG-Fc片段作为IgG-RF的靶抗原，再以抗化6呼妯1)2片段抗体作为第二抗体，以此建立的 IgG-RF酶免疫检测方法，消除了交叉反应的影响，结果的准确性大大提高，经临床应用和验 证获得了良好的结果。
图1为本发明的标准曲线图
具体实施例方式下面结合具体实施方式
来进一步说明本发明。1材料和方法1. 1主要试剂包板IgG-Fc片段作为包被抗原即包被板微孔，IgG-Fc片段由上海德波生物技术 有限公司提供，即由人IgG用胃蛋白酶水解，再以DEAE纤维柱和S印hadeXG200提取并纯化 而成。以1 500稀释的IgG-Fc片段包板，牛血清白蛋白封闭。酶标抗体用抗IgG-F (ab1) 2片段抗体，按Nakene法，采用Sigma公司产HRP (PZ3. 0) 标记同样由Sigma公司提供的抗IgG-F(abl)2片段抗体而成。使用效价为1 3800。IgG-RF标准品采用丹麦哥本哈根生物学标准实验室产品，IgG-RF含量为 1. 54X 106IU/ml。磷酸盐缓冲液(PBS)、标本稀释液。OPD (酶促反应底物)、OPD缓冲液、终止液。2操作步骤(1)试剂及标本准备①稀释液0. 01M、PH7. 2磷酸盐缓冲液。由0. OlM磷酸氢二钠溶液与0. OlM磷酸二氢钠溶液按1 4比例混合，并每100 毫升混合溶液加入牛血清白蛋白0. 3克即成。②洗涤液0. 01M, PH7. 2磷酸盐氯化钠缓冲液由0. OlM磷酸氢二钠溶液与0. OlM磷酸二氢钠溶液按1 4比例混合，并每100 毫升混合溶液加入氯化钠0. 85克即成。③显色剂临用前按以下比例配置底物邻苯二胺(简称0PD)原液5毫升；PH5. 0底物缓冲液10毫升0. 066M磷酸氢二钠溶液等量加入0. 033M柠檬酸溶液；3%H20270 毫升。④终止液2M H2SO4溶液。⑤血清标本用稀释液作1 100稀释。(2)在包被板微孔中分别加入八点IgG-RF标准品(0、40、80、160、320、640、1280、 2560IU/ml)、稀释好的标本和质控品各100 μ 1，放置37°C水浴箱中孵育1. 5小时；(3)将各孔液体弃净，用洗涤液洗涤4次，拍干；
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(4)各孔加入100 μ 1酶标记物。放置37°C水浴箱中，孵育1小时；(5)重复步骤(3)；(6)各孔加入100 μ 1预先稀释好的底物，放置37°C水浴箱中孵育20分钟；(7)各孔加入50 μ 1终止液，震荡混勻；(8)用酶标仪在490nm波长用0标准管校零读取吸光值A ；(9)计算以IgG-RF浓度为横坐标，相对应的吸光值A为纵坐标，在半对数纸上画 出标准曲线，然后根据标本的吸光值A在标准曲线上求IgG-RF含量，以IU/ml计。正常参考值范围< 110IU/ml。3 结果3.1标准曲线取上述丹麦IgG-RF标准品，递倍稀释成O 2560IU/ml八点标准，外加单纯稀释 液一共九点标准，先后测定50余次，曲线形态基本一致参见图1，可测范围为0 2560IU/ ml ο3. 2灵敏度和精确度用8个复管测定，最低检测下限为9IU/ml，标准品经倍比稀释后的8次复测，批内 CV为2. 5% 6. 4%，平均4. 1%0取含量分别为197. 2IU/ml和608. 4IU/ml两份血清，二 周内共测8次，批间CV为10. 8% 12. 6%，平均11.7%。3. 3结果应用正常值测定，100例正常健康人(男56，女44，20 50岁)血清IgG-RF含量的均 值为(41.0士34. 3)IU/ml，其正常上限(x+2s)为110IU/ml，高于此值者判为阳性。99例RA 患者阳性检出率为61. 5%，其血清IgG-RF值范围为21 3480IU/ml (超过1280IU/ml样品 作进一步稀释测定)，平均为430IU/ml，明显高于正常对照组。此外采用浊度法(Beckman 公司)对比检测IgM-RF, ELISA法(上海德波公司产品)检测IgM-RF和IgA-RF。阳性检 出率分别为56. 4%,66. 7%,51. 3%。进而按肿痛关节数将RA患者分成20个以上(11例) 和19个以下(10例)两组，前组IgA-RF水平为(651. 2士590. 9) IU/ml，明显高于后组的 (230. 6 士 178. 1) IU/ml (ρ < 0. 01)。可见，发明人通过利用IgG分子结构、抗原抗体反应特异性的特点，即以IgG-Fc片 段作为IgG-RF的靶抗原，再以抗IgG-F(^ib1)2片段抗体作为第二抗体，以此建立的IgG-RF 酶免疫检测方法，经临床应用和验证获得了良好的结果。毫无疑问，本发明，还可以具有多种变换及改型，并不限于上述实施方式。总之，本 发明的保护范围应包括那些对于本领域普通技术人员来说显而易见的变换或替代以及改 形。
权利要求
一种IgG型类风湿因子酶免疫检测方法，包括如下步骤(1)试剂及标本准备；(2)在包被板微孔中分别加入八点IgG-RF标准品(0、40、80、160、320、640、1280、2560IU/ml)、稀释好的标本和质控品各50～150μl，放置35～39℃水浴箱中孵育1～3小时；(3)将各孔液体弃净，用洗涤液洗涤，拍干；(4)各孔加入50～150μl酶标记物，放置35～39℃水浴箱中，孵育0.5～2小时；(5)重复步骤(3)；(6)各孔加入50～150μl预先稀释好的底物，放置35～39℃水浴箱中孵育10～30分钟；(7)各孔加入25～100μl终止液，震荡混匀；(8)用酶标仪在490nm波长用0标准管校零读取吸光值A；(9)计算以IgG-RF浓度为横坐标，相对应的吸光值A为纵坐标，在半对数纸上画出标准曲线，然后根据标本的吸光值A在标准曲线上求IgG-RF含量，其特征在于步骤(2)中的包被板微孔为IgG-Fc片段包板；步骤(4)中的酶标记物为抗IgG-F(ab1)2片段抗体。
2.如权利要求1所述的IgG型类风湿因子酶免疫检测方法，其特征在于步骤⑵中所 述的IgG-Fc片段包板由人IgG用胃蛋白酶水解，再以DEAE纤维素层析柱和S印hadeXG200 柱层析提取并纯化而成，以1 500稀释的IgG-Fc片段包板，用牛血清白蛋白封闭而成。
3.如权利要求1所述的IgG型类风湿因子酶免疫检测方法，其特征在于步骤(4)中 所述的抗IgG-F(Eib1)2片段抗体，按Nakene法，采用Sigma公司产HRP (PZ3. 0)标记同样由 Sigma公司提供的抗人IgGFab片段抗体而成，使用效价为1 3800。
全文摘要
本发明公开了一种IgG型类风湿因子酶免疫检测方法，包括如下步骤(1)试剂及标本准备；(2)在包被板微孔中加入IgG-RF标准品、标本和质控品；(3)在一定温度下作用，然后将各孔液体弃净，洗涤，拍干；(4)各孔加入酶标记物；(5)重复步骤(3)；(6)各孔加入底物；(7)各孔加入终止液，震荡混匀；(8)用酶标仪读取吸光值A；(9)计算；其中，步骤(2)中的包被板微孔为IgG-Fc片段包板；步骤(4)中的酶标记物为抗IgG-F(ab1)2片段抗体。本发明的IgG型类风湿因子酶免疫检测方法，消除了交叉反应的影响，结果的准确性大大提高，经临床应用和验证获得了良好的结果。
文档编号G01N33/564GK101871940SQ20091004992
公开日2010年10月27日 申请日期2009年4月24日 优先权日2009年4月24日
发明者周丽萍, 许荣, 钟丽民 申请人:上海市长宁区光华中西医结合医院