专利名称：：适用于快速检测食品中微生物总数状况的微量热法的制作方法
技术领域：
：本发明属于食品安全微生物快速检测
技术领域：
，特别涉及一种适用于检测食品中的微生物总数状况的微量法。
背景技术：
：目前，国内外研究的基于代谢学的快速检测技术快速检测食品中微生物总数的方法主要有ATP生物发光技术、酶底物法、电化学技术、噬菌体技术等。这些方法大多存在操作繁琐、检测时间太长的缺点且受样品复杂性的影响，造成结果的不准确性。微量热技术是一种通过测定细菌生长时热量的变化对细菌进行鉴别和检测的方法。通过敏感的微量热计对微生物在生长过程中产生的热量进行测量，由于不同细菌新陈代谢各异，因而经测量得到的热图谱也各不相同。但是由于放热量与微生物数量呈相关性，一旦建立了参考热谱图，就可以对细菌进行鉴定和检测，使鉴定检测步骤大为简化，一般只需数小时，因此微量热技术具有广泛的应用前景。实验证实微量热法可用于检测食品中的微生物总数的状况，采用量热的方式来进行分析，具有通用性强、适用于大多数生化样品、在测量时不受其他电化学活性物质或光学物质的干扰等优点。但是由于微生物生长放热量过于微小，利用高精度的MicroDSCIII微量热仪才能够检测出，但由于测量结果平行性较差，降低了这种方法的实用性。
发明内容为克服微量热法检测食品中微生物总数状况中微生物生长放热量过于微小的缺点，本发明提出一种适用于快速检测食品中微生物总数状况的微量热法。本发明采用如下技术方案一种适用于快速检测食品中微生物总数状况的微量热法，通过检测微生物生长过程中产生的C02的量检测食品中微生物总数状况。进一步地，所述产生的C02的量的计算方法为将产生C02与碱液发生酸碱化学反应，通过计算被消耗掉的碱液的量，推算出C02的量。进一步地，所述被消耗掉的碱液的量的计算方法为计算未与C02发生化学反应的相同的碱液与酸中和产生的热量值，计算与C02发生化学反应的剩余碱液与酸中和产生的热量值，计算两者之间的热量差值，算出被消耗的碱的量。本发明将热与微生物生长过程紧密结合在一起，利用微生物生长呼吸产生的C02与碱液反应所产生的热量实现对样品的检测。针对热量过小的问题，改进微量热法的检测方式，利用酸液再次中和与C02反应后剩余的碱液的方式，将待测热量值放大，在保持结果准确的同吋提高了试验结果的平行性，使微量热法真正成为简易、方便、实用的快速检测微生物方法。图1为本发明检测C02溶于碱液的实验装置；图2为本发明验证检测C02与碱液反应热量被检测的可行性的实验装置；图3为本发明微量热仪枪测得到的C02与碱液反应曲线；图4为本发明含菌的标准菌液释放的C02与碱液反应的热图谱；图5为本发明不含菌的标准菌液释放的C02与碱液反应的热图谱；图6为本发明测定细菌总数的标准曲线；图7为本发明测定另一种细菌总数的标准曲线。具体实施例方式一种适用于快速检测食品中微生物总数状况的微量热法，通过检测微生物生L仑过程中产生的C02的量检测食品中微生物总数状况。由于菌体生长放热是每一种菌体都会产生的，而替代物也需要具有同样的普遍性。微生物的基本生长过程是C源+0一N源一细胞量+H"+C02+产物+热量从上面方程式看出，微生物将各种能源物质分解利用，除了生长用之外，还会产生水、C02、各种产物以及热量。由于微生物是培养在水环境中，因此无法对产生的水进行检测，而热量已经被否定了，同时不同的微生物所产生的产物是不同的，无法从中找到共同性，因此C02将是最好的选择。由于食品中易污染的菌体通常都是好氧菌，菌体在呼吸过程中均会产生C02，C02能溶于水(体积比l:l)生成碳酸，即可与碱反应。利用二氧化碳与碱液发生酸碱化学反应放热，与微生物生长热相比，热值有了较大的提升。进一步地，本发明将微生物生长直接放的微小热量检测转化为酸碱反应放热检测，具体检测方法为用酸去同时中和微量热仪(MicroDSCIII)样品池和参比池中的剩余碱液，通过热量差值推算样品中微生物总数。由于整个实验的检测时间约8个小时，这些热量平均在8个小时内，所需检测的热值仍然是很小的，通过量热仪器检测是很难实现的。因此有必要将待测热量放大，最好能在短时间内释放大量的热。由于C02在与碱液反应时会消耗掉部分碱，反应结束时，样品池内的碱液与参比池内的碱液浓度必然会有差别，酸液过量情况下用酸去同时中和样品池和参比池中的剩余碱液，参比池释放的热量必然会大于样品池的热量，这两个热值的差即为被消耗的碱的量，从而可以推算出这部分碱消耗掉的C02的量，继而推算出样品中含有的微生物的量。而且，由于酸碱反应属于无机化学反应，短时间内放出的热量很大，因此，在利用C02与碱反应的基础上，再添加一步用酸去中和剩余的碱，就达到了放大热量的目的。为验证本发明方法的可行性，本发明采用图1所示的实验装置检测C02溶于碱液的可行性，图l中各部分功能如下蠕动泵l，用于向微生物培养瓶中不断吹入含氧的空气；空气洗脱瓶2，用于处理蠕动泵1吹入含氧的空气中的C02,如果空气不经处理就直接吹入碱瓶中将会引起碱液的消耗而得出错误的结论；微生物的培养装置3，包括培养瓶和在培养瓶周围设置的温度环境，此处的温度环境为恒温(37°C)水浴，因为微生物的生长是有最适合生长的温度，选择合适生长的温度培养能够加快检测速度；碱瓶，包括样品瓶41和参比瓶42，碱瓶中的碱液中含有酸碱指示剂(蓝色)，以方便观察颜色的变化。培养12小时(h)后，碱瓶中原本蓝色的碱液，参比瓶42中颜色基本没有变化；而样品瓶41中由于吸收了细菌呼吸产生的C02而成为黄色，效果十分明显。可见菌体呼吸产生的C02是能够溶于碱液并与碱液反应的。碳酸与碱液反应消耗碱，碱液的pH会发生变化。利用酸碱指示剂会对不同pH的液体产生不同颜色变化的特性，实现对碱液的pH的简单测定。如果菌体产生的C02消耗了碱，就会引起碱液的颜色发生变化，可以直观的观测到检测C02溶于碱液是可行的。进一步地，通过图2中的装置验证检测C02与碱液反应热量被检测的B/行性。如图2所示，将图1中的碱瓶换成微量热仪(本实施例中采用的型号为MicroDSCIII),由于微量热仪有一种循环池非常适合气液混合放热的检测，本试验选择微量热仪作微量热仪器，其余各部分与图丄相同。图3为微量热仪检测得到的C02与碱液反应曲线，图中横坐标为时间单位(秒)，纵坐标为热量单位(毫瓦mW)。从图3看出，热值曲线在后期有一个明显的上升峰，与菌体的生长过程状态十分吻合，由此可知C02与碱液反应产生的热量也是可以被检测得的。在细菌培养的优化条件下，利用已知浓度的B3菌液作为待测菌液，可得到一条与菌体生长状态相关的热图谱，如图4、图5所示，图4为标准菌液释放的C02与碱液反应的热图谱(含菌)，图中横坐标为时间单位(小时)，纵坐标为热量单位(毫瓦mW)，图5为标准菌液释放的C02与碱液反应的热图谱(不含菌)，图中横坐标为时间单位(小时)，纵坐标为热量单位(毫瓦mW)。通过对热图谱中4h到8h的累积放热值进行面积积分，就得到了8h内菌体生长释放出的C02与碱液反应产生的热量值。在相同条件下，用已知的不同细菌总数的B3菌悬液重复试验，将热量值与初始细菌总数一一对应，即得到此种细菌的标准曲线，如图6所示。经过对所得试验数据进行线性拟合，得到曲线方程为y=0.0007x+l.5375，R2=0.9738。线性关系非常好。下表1为标准曲线验证实验结果-<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表1从表1中看出，利用最佳培养条件，对未知浓度的B3菌液检测，同时利用标准曲线及平板计数法进行对比，所得的结果偏差不大，误差值为8.86%和0.7%，基本符合要求，证明了这条标准曲线的准确性。同时，标准曲线提供了500cfu/ml左右菌量的热量值，可以满足大多数食品安全标准对细菌总数的要求，也表明这种方法得出的标准曲线有着实际应用价值。为了验证这种方法有普遍的应用性，选择另一种菌再次验证。测定细菌总数的标准曲线如图7所示，从实验结果看，对于不同的菌体，利用C02作为测量对象检测样品初始细菌总数的方法仍然可行，因此这种方法在检测食品中微生物含量时是完全可行的，并可以普遍应用于不同的微生物检测中。权利要求1、一种适用于快速检测食品中微生物总数状况的微量热法，其特征在于通过检测微生物生长过程中产生的CO2的量检测食品中微生物总数状况。2、根据权利要求l所述的适用于快速检测食品中微生物总数状况的微量热法，其特征在于所述产生的C02的量的计算方法为将产生C02与碱液发生酸碱化学反应，通过计算被消耗掉的碱液的量，推算出C02的量。3、根据权利要求1或2所述的适用于快速检测食品中微生物总数状况的微量热法，其特征在于所述被消耗掉的碱液的量的计算方法为计算未与C02发生化学反应的相同的碱液与酸中和产生的热量值，计算与C02发生化学反应的剩余碱液与酸中和产生的热量值，计算两者之间的热量差值，算出被消耗的碱的量。全文摘要适用于快速检测食品中微生物总数状况的微量热法，将微生物生长放热转化为酸碱反应放热，其方法步骤为1)用检测菌体生长放出的CO<sub>2</sub>替代直接检测菌体生长热，利用CO<sub>2</sub>与碱液发生酸碱化学反应放热；2)用酸去同时中和MicroDSCIII样品池和参比池中的剩余碱液，参比池内的碱液由于未被CO<sub>2</sub>中和，释放的热量必然会大于样品池的热量，这两个热值的差即为被消耗的碱的量，从而可以推算出这部分碱消耗掉的CO<sub>2</sub>的量，据测定细菌总数的标准曲线推算出样品中含有的微生物的量。由本检测方法进行微生物总数检测大大提高了检测灵敏度、缩短了检测时间，适用于量热法检测微生物总数。文档编号G01N25/20GK101592624SQ200910053379公开日2009年12月2日申请日期2009年6月19日优先权日2009年6月19日发明者斐徐,李学辉,李思超,章海鹏申请人:上海理工大学