专利名称：结合结核杆菌噬菌体尾部蛋白的抗体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗体，尤其涉及一种结合结核杆菌噬菌体尾部蛋白的抗体；此外， 本发明还涉及该结合结核杆菌噬菌体尾部蛋白的抗体的制备方法和应用。
背景技术：
肺结核病是由结核杆菌引起的一种人畜共患的慢性传染病，是目前单一传染性细 菌致人死亡的主要因素。近年来，随着艾滋病的流行、多种恶性肿瘤患者的增多以及多重抗 药性菌株的出现，更是增加了结核菌感染症防治上的困难。统计数据显示，全世界有结核病 菌感染者20亿(占总人口 1/3)，每秒钟感染一人，全球结核病菌每年新感染800万人，如 果不立即采取防扩散措施，结核病将在今后10年内夺去3000多万人的生命。我国全国结 核病感染者3. 3亿，结核病人600万，每年因结核病死亡的病人高达25万，为各类传染病死 亡总和的两倍，因此我国已将结核病由丙类传染病升为乙类传染病，列入严格管理范畴。据 WHO统计，全世界每年有5千万至一亿人感染结核，约三百万人死于结核病，其中80%以上 在发展中国家。因此，如何快速尽早地诊断并治疗成为控制结核病扩散和传播的关键环节。目前，肺结核的诊断除了一般胸部X光检查外，主要是靠取痰液检查，包括抗酸杆 菌痰涂片染色镜检与结核杆菌培养，结核杆菌的细菌学检查是确诊肺结核的重要依据。抗 酸杆菌涂片检查敏感性低，特异性差，并且无法确定细菌死活。结核杆菌培养通常是将待检 标本接种至改良的罗氏培养基，37°C培养20 60天，待细菌生长后再依据生物学特征及生 化反应多项指标综合判断。由于结核菌的菌体结构复杂，富脂质，疏水性，使得肺结核杆菌 生长速度缓慢，每隔十二 二十四小时才分裂一次。所以，利用培养方法来侦测结核菌的存 在，往往需要三 八周的时间才可以得到结果，耗费时间长，而且操作繁琐，无法满足快速 确诊肺结核的需要，经常延误治疗的时机且敏感性不高(阳性率不过40%左右)。最近几年，噬菌体快速扩增法利用耻垢分枝杆菌的快速生长特性以及D29噬菌体 的相对专一性，进行结核杆菌的快速检测。该方法的核心内容是a.用样品处理液室温处理待检样品30分钟，离心去上清；b.用增菌液37°C增菌24小时；c.加入D29分枝杆菌噬菌体37°C温育1小时，感染结核杆菌菌体；d.用中止液灭活未侵入结核杆菌的噬菌体，室温作用10分钟以中止感染；e.取步骤d所得的待测液，滴于耻垢分枝杆菌预包被的琼脂菌落培养皿上，37°C 温育15-20小时；f.根据菌落培养皿上噬菌斑的形成情况判定结果。该方法的试剂盒特异性强、结果明晰，无需特殊仪器，可用于各种待检样品中活的 结核杆菌菌体快速鉴定；但是整个测试至少需要48小时才能完成，而且操作较复杂，灵敏 度也不够高。近年来，随着分子生物学技术、抗原纯化技术及单克隆抗体技术的日益成熟，一些 快速的检验方法相继问世，如聚合酶链反应法(polymerase chain reaction，PCR)、酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、斑点免疫金渗滤法(dot immuno-gold filtration assay, DIGFA)及免疫层析法(immunochromatographic test, ICT)。多聚酶链反应是由一对特定的寡核苷酸引物介导待检标本中结核杆菌DNA特定 序列片段的体外酶促扩增技术，通过三个不同温度、数十个变性、复性、延伸的循环，特定靶 序列可被扩增数百万倍，而显示其快速、高灵敏度、可定量分析以及理论上的高特异性等特 点。不过该方法操作比较复杂，对操作设备和人员的技术要求较高，实验室易产生污染。酶联免疫吸附法、斑点免疫金渗滤法和免疫层析法均是基于血清免疫学发展起来 的检测方法。这些方法均是以结核杆菌的特征性抗原为捕获物，以标记的抗人免疫球蛋白 或葡萄球菌蛋白A (Staphylococci Protein A，SPA)等为指示系统，检测患者体内存在的抗 结核分枝杆菌的循环抗体，间接地对病人的患病情况进行诊断。酶标法需要专业的仪器及 高操作技能的专业人员。免疫渗滤法及免疫层析法均不需要任何仪器，检测所需时间也大 为缩短，操作简便，结果直观。但上述方法共同的问题是灵敏度以及特异性很难达到要求， 并且不能区分曾经感染已经治愈的病例；有的产品甚至不能区分注射过卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)的病例。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种结合结核杆菌噬菌体尾部蛋白的抗体。本发明要解决的技术问题之二是提供该结合结核杆菌噬菌体尾部蛋白的抗体的 制备方法。本发明要解决的技术问题之三是提供该结合结核杆菌噬菌体尾部蛋白的抗体在 检测结核杆菌中的应用。在本发明的一方面，提供一种结合结核杆菌噬菌体尾部蛋白的抗体，该抗体能识 别结核杆菌噬菌体。优选的，该抗体是单克隆抗体。优选的，该抗体是抗体片段。优选的，该抗体是Fab。优选的，该抗体是标记的抗体。优选的，该抗体是胶体金标记的抗体。该抗体用含结核杆菌噬菌体尾部蛋白第20到80位氨基酸的多肽做抗原免疫小鼠 获得；该结核杆菌噬菌体尾部蛋白片段具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列和SEQ ID N0 2所示的氨基酸序列。在本发明的另一方面，提供一种结合结核杆菌噬菌体尾部蛋白的抗体的制备方 法，包括如下步骤(1)合成结核杆菌噬菌体尾部蛋白片段通过分子克隆的方法将含SEQ ID NO=I 序列的核酸插入到PCDNA3载体(Irwitrogen)，测序鉴定后选正确克隆扩增，提取DNA后转 化大肠杆菌，表达并纯化结核杆菌噬菌体尾部蛋白的片段；(2)将步骤(1)纯化的结核杆菌噬菌体尾部蛋白片段免疫小鼠，取脾细胞与骨髓 瘤细胞融合，挑选产生抗体好的细胞株，注射小鼠腹腔；注射后10天左右抽取腹水并纯化抗体。在本发明的另一方面，提供一种结合结核杆菌噬菌体尾部蛋白的抗体在检测结核 杆菌中的应用，采用胶体金法免疫层析测试笔检测结核杆菌噬菌体的方法，测试笔中胶体 金标记的抗体为该结合结核杆菌噬菌体尾部蛋白的抗体，测试线上固定的抗体为结合结核 杆菌噬菌体尾部蛋白的抗体。本文所采用的术语“单克隆抗体(单抗)”指从一纯系细胞得到的免疫球蛋白，具 有相同的结构和化学特性，对单一抗原决定簇有特异性。单克隆抗体与常规多克隆抗体制 剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决 定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤或重组工程细胞 培养获得，不会混杂有其它免疫球蛋白。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从均一的 抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。本发明具有以下有益效果该抗体能识别结核杆菌噬菌体D29的尾部蛋白，从而 识别结核杆菌噬菌体D29，进一步通过建立的方法反映检测样品中是否有活的结核杆菌。该 抗体用含尾部蛋白第20到80位氨基酸的多肽做抗原免疫小鼠获得。本发明的抗体可以快 速识别噬菌体，进一步缩短噬菌体扩增法检测结核杆菌的时间，同时提高检测的灵敏度。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述实施例1，识别结核杆菌噬菌体D29尾部蛋白的抗体的制备1，结核杆菌噬菌体D29尾部蛋白片段的合成结核杆菌噬菌体D29尾部蛋白片段的核苷酸序列如SEQ ID NO=I所示，结核杆菌 噬菌体D29尾部蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。通过分子克隆的方法将含SEQ ID NO 1序列的核酸插入到pcDNA3载体(购自 Invitrogen公司)，测序鉴定后选正确克隆扩增，提取DNA后转化大肠杆菌，表达并纯化D29 尾部蛋白片段。2，识别D29尾部蛋白片段的抗体的制备a)动物免疫将前面纯化的D29尾部蛋白片段与等体积的福氏佐剂混合制成油包水乳剂，每只 小鼠腹腔注射0. 5ml上述混合液(含尾部蛋白片段100 μ g)，共注射6只BALB/c小鼠。两 周后同剂量抗原加福氏不完全佐剂加强免疫，7天后以间接ELISA检测小鼠血清尾部蛋白 多抗的效价，效价高者尾静脉再冲击免疫1次，每只20 μ g，3天后进行细胞融合。b)杂交瘤细胞株的建立将免疫小鼠的脾细胞悬液和SP2/0骨髓瘤细胞以5 1的比例在聚乙二醇作用下 按常规法融合，用HAT完全1640培养基筛选培养。以D29尾部蛋白(1 μ g/ml)作为抗原包 被酶标96孔板，间接ELISA法检测杂交瘤细胞培养上清，所测的0D490 (490nm处的吸收) 比阴性对照高10倍的克隆，进行亚克隆化，并进行扩增冻存。经过3次有限稀释克隆化，将 分泌特异性抗体的杂交瘤细胞系大量扩增并冻存，长期传代培养后，以相同的方法再次克 隆化鉴定。c)单克隆抗体腹水的制备
BALB/c小鼠腹腔内分别注射0. 5ml不完全福氏佐剂，5 7天后每只小鼠腹腔内 注射0. 5ml含2X IO6个杂交瘤细胞的溶液，7 10天后视小鼠腹部膨胀程度收集腹水。d)单克隆抗体的纯化将识别D29尾部蛋白的单克隆抗体腹水先后用50% (质量体积比)饱和硫酸铵盐 析和Protein G亲和层析的方法进行纯化，得到的单克隆抗体用蛋白电泳法鉴定纯度。实施例2，D29噬菌体在结核杆菌和耻垢杆菌中的扩增及检测1.用4%的NaOH溶液(样品液NaOH液=1 4)室温处理待检样品20分钟， 离心去上清；2.加入增菌液(将米氏7H9培养基7g、CaCl22g、氨苄青霉素50g、两性霉素B 50g、 BSA 200g、葡萄糖15g、油酸2g和过氧化氢酶0. 2g溶于IL水中制备)2ml，37°C培养18 24小时；3.取上述培养后的菌液0. 9ml，加入浓度为IO9个/ml的D29噬菌体溶液0. Iml, 37°C温育2小时，让噬菌体感染结核杆菌；4.向上述溶液中加入杀灭剂(8%的硫酸亚铁铵)0. 1ml，室温作用10分钟以灭活 所有未侵入结核杆菌的噬菌体；5.往上述含灭活剂的菌液中加入5ml增菌液，再加入Iml的耻垢杆菌(4X IO6个 /ml，在 600nm 时 OD 为 1. 0)，37°C温育 4 小时；6.噬菌体溶液可采用申请号为200810043709.4，申请日为2008年8月14日，发 明名称为“一种快速检测结核杆菌的方法和试剂盒”的中国发明专利申请说明书中所记载 的方法制得的胶体金法免疫层析测试笔(金探针用胶体金标记实施例1制得的抗D29尾部 蛋白的抗体获得，测试线抗体也用该抗体)检测噬菌体浓度，从而间接检测结核杆菌。用此 法检测的结核杆菌最少到100个。序列表<110>上海英伯肯医学生物技术有限公司<120>结合结核杆菌噬菌体尾部蛋白的抗体及其制备方法和应用<130>NP-09-13393<160>2<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>183<212>DNA<213>人工序列<400>1gaagcaggca ccgctgcaca tacgccggcc gaactgaaga ccatcgacct gtccgacccg 60tcgacctgga ctggagccac cggctggtcg agcgtcggcc acaccagccg aggcacgctc 120cccgagttcg gcttcgaggg cggcgattcc ctc
<210>2 <211>61
<212>PRT<213>人工序列<400>2EAGTAAHTPA ELKTIDLSDP STffTGATGffS SVGHTSRGTL PEFGFEGGDS EVKGSffQKKK 60L6权利要求
一种结合结核杆菌噬菌体尾部蛋白的抗体，该抗体能识别结核杆菌噬菌体。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，该抗体是单克隆抗体。
3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，该抗体是抗体片段。
4.如权利要求3所述的抗体，其特征在于，该抗体是Fab。
5.如权利要求1至4任一项所述的抗体，其特征在于，该抗体是标记的抗体。
6.如权利要求5所述的抗体，其特征在于，该抗体是胶体金标记的抗体。
7.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，该抗体用含结核杆菌噬菌体尾部蛋白第20 到80位氨基酸的多肽做抗原免疫小鼠获得；该结核杆菌噬菌体尾部蛋白片段具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
8.一种包含权利要求1-7任一项所述的抗体的溶液和装置。
9.一种产生权利要求1，2，3，4和7中任一项所述的抗体的细胞。
10.一种如权利要求1-7任一项所述的抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤(1)合成结核杆菌噬菌体尾部蛋白片段通过分子克隆的方法将含SEQID N0:1序列 的核酸插入到PCDNA3载体，测序鉴定后选正确克隆扩增，提取DNA后转化大肠杆菌，表达并 纯化结核杆菌噬菌体尾部蛋白的片段；(2)将步骤(1)纯化的结核杆菌噬菌体尾部蛋白片段免疫小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细 胞融合，挑选产生抗体好的细胞株，注射小鼠腹腔；注射后10天左右抽取腹水并纯化抗体。
11.一种结合结核杆菌噬菌体尾部蛋白的抗体在检测结核杆菌中的应用，其特征在于， 采用胶体金法免疫层析测试笔检测结核杆菌噬菌体的方法，测试笔中胶体金标记的抗体为 权利要求6所述的抗体，测试线上固定的抗体为权利要求1-4任一项所述的抗体。
全文摘要
本发明公开了一种结合结核杆菌噬菌体尾部蛋白的抗体，该抗体能识别结核杆菌噬菌体。此外，本发明还公开了该抗体的制备方法，包括步骤合成结核杆菌噬菌体尾部蛋白片段，将纯化的结核杆菌噬菌体尾部蛋白片段免疫小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，挑选产生抗体好的细胞株，注射小鼠腹腔，注射后10天左右抽取腹水并纯化抗体。此外，本发明还公开了该抗体在检测结核杆菌中的应用。本发明的抗体可以快速识别噬菌体，进一步缩短噬菌体扩增法检测结核杆菌的时间，同时提高检测的灵敏度。
文档编号G01N33/569GK101993490SQ20091005777
公开日2011年3月30日 申请日期2009年8月20日 优先权日2009年8月20日
发明者杨挥, 胡志能 申请人:上海英伯肯医学生物技术有限公司