专利名称：：聚乙烯醇涂层毛细管的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及聚乙烯醇涂层毛细管制备方法及其应用，属于蛋白质分离分析
技术领域：
。
背景技术：
：随着人类基因组计划的完成，生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。其中，蛋白质组学是对细胞内的所有蛋白质进行研究，因此需要高容量、高效率的蛋白质分离分析方法。毛细管电泳因其具有高分离柱效、高分辨率、低样品及缓冲液消耗量以及分离速度快等优点，已广泛的用于生物物质如蛋白质、氨基酸、核酸等的分离分析。毛细管电泳往往发生在内径为20-100微米的石英毛细管柱内，石英毛细管内壁含有大量的硅羟基，其具有一定的疏水性并且在较宽的pH范围内带有负电荷。因此，蛋白质尤其是碱性蛋白质在进行毛细管电泳时易与管壁发生非特异性吸附，这往往导致柱效降低、峰拖尾、峰缺失、结果重现性差甚至会影响管柱的寿命。毛细管涂层技术是解决这一问题的一个有效方法。迄今已报道多种高分子化合物可作为毛细管内壁涂层实现蛋白质的高效分离，包括聚丙烯酰胺、聚乙二醇、葡聚糖、聚乙烯醇等。其中，聚乙烯醇涂层被认为是亲水性最强、最适用于蛋白质分离分析的涂层化合物。1994年Gilges等在《Analyticalchemistry》上首次报道了聚乙烯醇涂层的毛细管柱白勺制备方、法(Capillaryzoneelectrophoresisseparationsofbasicandacidicproteinsusingpoly(vinylalcohol)coatingsinfusedsilicacapillaries,Anal.Chem.1994，66，2038-2046)。在该方法中，通过向管内通入聚乙烯醇溶液将聚乙烯醇分子物理吸附到毛细管内壁，随后通过向管内通入高温氮气将涂层固定。因为这种方法是将聚乙烯醇分子通过物理吸附的方法固定在毛细管内壁上，故制得的管柱稳定性较差。2001年，Belder等在Gilges等的研究基础上制备了交联聚乙烯醇涂层的管柱，该方法虽可有效的改善涂层的稳定性，但是该法制备的涂层也是物理吸附于毛细管内壁，故其稳定性较化学键合的涂层差(Cross-linkedpoly(vinylalcohol)aspermanenthydrophiliccolumncoatingforcapillaryelectrophoresis,Electrophoresis,2001，22，3813-3818)。Beckman公司用乙酸乙烯酯为单体，在乙烯基化的毛细管内，采用原位聚合的方法制备了聚乙酸乙烯酯涂层的毛细管柱。随后用甲醇钠将聚乙酸乙烯酯水解，这样便制得聚乙烯醇涂层的毛细管柱(Polyvinylalcohol(PVA)basedcovalentlybondedstablehydrophiliccoatingforcapillaryelectrophoresis,USpatent,US5840388，1998)。这种方法制得的聚乙烯醇涂层是化学键和于毛细管内壁，制得的管柱具有较好的化学稳定性，然而这种方法制备过程繁琐、且聚合反应在高温下完成易导致涂层不均匀。
发明内容本发明在前人的研究基础上提出了一种新型的化学键合聚乙烯醇涂层管柱的制备方法，所有操作均可在室温下完成，且制备周期较短，方法具有较好的重现性。本发明的目的在于制备适用于高效蛋白质毛细管电泳的聚乙烯醇涂层毛细管柱。本方法将聚乙烯醇大分子化学键合到毛细管内壁上。聚乙烯醇分子具有较强的亲水性，且不带电荷，所以制得的管柱电渗流较小，可用于蛋白质的高效分离。本发明是通过下述技术方案加以实现的本发明的聚乙烯醇涂层毛细管的制备方法，具体步骤如下(参见图1):1)毛细管预处理；2)毛细管内壁硅垸化反应；3)管壁醛基修饰反应；4)聚乙烯醇键合反应。所述的毛细管内壁硅垸化反应是采用氨丙基三乙氧基硅烷为硅垸化试剂冲洗预处理后的毛细管柱1-3h。氨丙基三乙氧基硅垸为含有20—50%氨丙基三乙氧基硅垸的丙酮溶液。所述的管壁酸基修饰反应是选用戊二醛溶液为醛基修饰试剂，冲洗硅垸化后的毛细管柱1-2h。戊二醛溶液为含5-30%戊二醛的pH9.0的50mM磷酸缓冲液。所述的聚乙烯醇键合反应是先将5-10%PVA的水溶液同5MHC1水溶液按9:I混合。用混合液冲洗醛基修饰后的毛细管柱l-5h;随后，管柱分别用水、甲醇冲洗，最后氮气吹干。本发明的方法制备的聚乙烯醇涂层毛细管应用于蛋白质细管电泳分析中。蛋白质样品使用本发明的方法制备的聚乙烯醇涂层毛细管柱进行分离可以保证较高的分离效率(理论塔板数)及分离度。碱性蛋白质混合物可在较低的pH环境下(pH3.0)使用本专利制备的管柱进行分离分析，酸性蛋白质可在较高的pH环境下(pH10.0)使用本专利制备的管柱进行分离分析。其中毛细管管壁预处理是分别用碱溶液与酸溶液冲洗毛细管，以便去除管内杂质同时使管内壁硅羟基充分的暴露出来。在随后的毛细管内壁硅垸化反应中，硅垸化试剂为氨丙基三乙氧基硅烷，通过,步硅垸化反应可将氨基修饰到毛细管内壁上。管壁的醛基修饰反应的反应物为戊二醛，通过戊二醛上的一个醛基与管壁上的氨基反应将醛基修饰到毛细管内壁上。因为醛基与聚乙烯醇上的羟基在室温下便可反应，将聚乙烯醇溶液通入管壁修饰有醛基的毛细管柱内后便可将聚乙烯醇分子固定到毛细管内壁上，制得聚乙烯醇涂层的管柱。详细内容介绍如下化学键合聚乙烯醇涂层毛细管柱制备步骤如下，如图1所示第一歩毛细管预处理。未经任何修饰的毛细管首先用1MNaOH溶液冲洗(为通用处理方法)，除去管内碱溶性杂质以及将管壁硅氧键打开形成硅羟基，随后用1MHC1溶液冲洗管柱除去管内酸溶性杂质。处理后的毛细管柱内壁无酸溶性与碱溶性杂质，且具有较高的硅羟基密度。第二歩毛细管内壁硅烷化反应。参见图1，将预处理后的毛细管柱用20—50%的氨丙基三乙氧基硅烷(如图1中(a))的丙酮溶液冲洗管柱。在冲洗过程中，氨丙基二乙氧基硅烷会与毛细管内壁的硅羟基发生硅烷化反应，进而将氨基固定到毛细管内壁上。冲洗1-3h后，毛细管柱再用丙酮溶液冲洗，随后用氮气吹干。第三歩管壁醛基修饰反应。参见图l，用5-30%的戊二醛(图1中(b))的pH9.0，50mM硼酸缓冲液冲洗上歩反应完成后制得的管柱l-2h，这过程中，戊二醛上的一个醛基会与毛细管内壁的氨基反应，进而将醛基固定到毛细管内壁，制得醛基修饰的毛细管柱。第四歩聚乙烯醇键合反应。参见图l，先将5-10%PVA的水溶液同5MHC1水溶液按9:l混合。用混合液冲洗醛基修饰后的毛细管柱1-5h;在这一过程中，管内壁的醛基会与聚乙烯醇上的羟基反应，进而将聚乙烯醇化学键合毛细管内壁上。本发明所介绍的聚乙烯醇涂层管柱的制备方法与其它的聚乙烯醇涂层管柱的制备方法相比有如下优点第一，制备过程中所有反应均在室温下进行，操作方便，易于大规模制备；第二，聚乙烯醇是化学键合到毛细管内壁上，而非物理吸附，故具有较高的化学稳定性；第三，本发明介绍的聚乙烯醇涂层管柱涂层均匀，制得的管柱电渗流较小，用于蛋白质毛细管电泳分离分析可实现较高的蛋白质分离效率及分离度。图l:聚乙烯醇涂层管柱的制备反应方程式；图2:碱性蛋白质混合物聚乙烯醇涂层管柱毛细管电泳分离谱图3:酸性蛋白质混合物聚乙烯醇涂层管柱毛细管电泳分离谱图。.具体实施例方式—下面的实例将对本发明提供的方法予以进一歩的说明。实施例l:1)聚乙烯醇涂层毛细管柱的制备用lMNa0H溶液冲洗未经任何处理的毛细管30min，随后水洗至管内流出液中性。然后用1MHC1溶液冲洗毛细管2h。随后分别用水洗30min，甲醇洗30min，然后用氮气吹毛细管5h。2)接下来，用含20%v/v的氨丙基三乙氧基硅烷的丙酮溶液冲洗上歩预处理后的毛细管柱lh。随后，分别用水、甲醇冲洗管柱。然后室温下用将制得的管柱氮气吹干。3)接下来，用含5%戊二醛的pH9.0的50mM磷酸缓冲液冲洗管柱lh。随后，管柱用水冲洗至中性，制得醛基修饰的毛细管柱。4)接下来，用5%PVA的水溶液同5MHC1水溶液按9:1混合液冲洗醛基修饰后的毛细管柱5h。随后，管柱分别用水、甲醇冲洗，最后氮气吹干，制得聚乙烯醇涂层的毛细管柱。该管柱的制备的反应方程式如图1所示。实施例2:聚乙烯醇涂层毛细管柱的制备将预处理毛细管柱(处理方法如实施例1)用含用含20%v/v的氨丙基三乙氧基硅烷的丙酮溶液冲洗lh，随后，分别用水、甲醇冲洗管柱。然后室温下用将制得的管柱氮气吹干。接下來，用含10%戊二醛的pH9.0的50mM磷酸缓冲液冲洗管柱lh。随后，管柱用水冲洗至中性，制得醛基修饰的毛细管柱。接下來，用5%PVA的水溶液同5MHC1水溶液按9:1混合液冲洗醛基修饰后的毛细管柱5h。随后，管柱分别用水、甲醇冲洗，最后氮气吹干备用。实施例3:聚乙烯醇涂层毛细管柱的制备将预处理毛细管柱(处理方法如实施例l)用含用含30%v/v的氨丙基三乙氧基硅烷的丙酮溶液冲洗2h，随后，分别用水、甲醇冲洗管柱。然后室温下用将制得的管柱氮气吹干。接下來，用含30%戊二醛的pH9.0的50mM磷酸缓冲液冲洗管柱2h。随后，管柱用水冲洗至中性，制得酸基修饰的毛细管柱。接下来，用7.5MPVA的水溶液同5MHC1水溶液按9:1混合液冲洗醛基修饰后的毛细管柱3h。随后，管柱分别用水、甲醇冲洗，最后氮气吹干备用。实施例4:6聚乙烯醇涂层毛细管柱的制备将预处理毛细管柱(处理方法如实施例1)用含用含50呢v/v的氨丙基三乙氧基硅烷的丙酮溶液冲洗管柱3h，随后，分别用水、甲醇冲洗管柱。然后室温下用将制得的管柱氮气吹干。接下来，用含30%戊二醛的pH9.0的50mM磷酸缓冲液冲洗管柱2h。随后，管柱用水冲洗至中性，制得醛基修饰的毛细管柱。接下来，用10%PVA的水溶液同5MHC1水溶液按9:1混合液冲洗醛基修饰后的毛细管柱lh。随后，管柱分别用水、甲醇冲洗，最后氮气吹干备用。实施例5:蛋白质样品聚乙烯醇涂层毛细管电泳分离分析毛细管柱为内径50lim，总长30.2cm，有效长度20cra的聚乙烯醇涂层毛细管柱。蛋白质样品含溶菌酶、细胞色素C、a胰凝乳酶原A各50yg/ml的pH3.0的磷酸缓冲液。运行缓冲液为40函pH3.0的磷酸缓冲液。实验过程中毛细管电泳仪循环冷却液的温度为25T。紫外检测器的检测波长为200nm。样品进样条件为5kV，4s。分离电压15kV。分离用毛细管柱为实施例1中制得的管柱。分离结果如图2所示。由图可知，蛋白质样品在上述实验条件下可实现基线分离，细胞色素c的出峰时间为2.61min;溶菌酶的出峰时间为2.88min;a胰凝乳酶原A的出峰时间为3.66min。实施例6:蛋白质样品聚乙烯醇涂层毛细管电泳分离分析毛细管柱为内径50ym，总长50.2cm，有效长度40cm的聚乙烯醇涂层毛细管柱。蛋白质样品含0.5mg/ml胰蛋白酶抑制剂、0.25mg/ml肌红蛋白的pH10.0的50mMCAPS-NaOH磷酸缓冲液。运行缓冲液为20mMCAPS-NaOH磷酸缓冲液。实验过程中毛细管电泳仪循环冷却液的温度为25°C。紫外检测器的检测波长为200mn。样品进样条件为0.4psi，4s。分离电压-20kV。分离用毛细管柱为实施例2中制得的管柱。分离结果如图3所示。由图可知，蛋白质样品在上述实验条件下可实现基线分离，洗脱顺序为TI〉MB。如图三所示，胰蛋白酶抑制剂的出峰时间为7.24min;肌红蛋白的出峰时间为15.7min。本发明提出的聚乙烯醇涂层毛细管的制备方法及其应用，已通过现场较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。权利要求1.一种聚乙烯醇涂层毛细管的制备方法，其特征是步骤如下1)毛细管预处理；2)毛细管内壁硅烷化反应；3)管壁醛基修饰反应；4)聚乙烯醇键合反应。2.如权利要求1所述的聚乙烯醇涂层毛细管的制备方法，其特征是所述的毛细管内壁硅烷化反应是采用氨丙基三乙氧基硅烷为硅垸化试剂冲洗预处理后的毛细管柱l-3h。3.如权利要求2所述的聚乙烯醇涂层毛细管的制备方法，其特征是所述的氨丙基三乙氧基硅烷为含有20—50%氨丙基三乙氧基硅垸的丙酮溶液。4.如权利要求1所述的聚乙烯醇涂层毛细管的制备方法，其特征是所述的管壁醛基修饰反应是选用戊二醛溶液为醛基修饰试剂，冲洗硅垸化后的毛细管柱l-2h。5.如权利要求4所述的聚乙烯醇涂层毛细管的制备方法，其特征是所述的戊二醛溶液为含5-30%戊二醛的pH9.0的50mM磷酸缓冲液。6.如权利要求1所述的聚乙烯醇涂层毛细管的制备方法，其特征是所述的聚乙烯醇键合反应是用5-10%PVA的水溶液同5MHC1水溶液按9:1混合液冲洗醛基修饰后的毛细管柱1-5h;随后，管柱分别用水、甲醇冲洗，最后氮气吹干。7.权利要求1的聚乙烯醇涂层毛细管的应用，其特征是应用于蛋白质细管电泳分析中。8.如权利要求7所述的应用，其特征是碱性蛋白质混合物在pH=3.0使用管柱进行分离分析；酸性蛋白质在pH=10.0进行分离分析。全文摘要本发明涉及聚乙烯醇涂层毛细管制备方法及其应用，制备方法是采用氨丙基三乙氧基硅烷为硅烷化试剂冲洗预处理后的毛细管柱1-3h。氨丙基三乙氧基硅烷为含有20-50％氨丙基三乙氧基硅烷的丙酮溶液。选用戊二醛溶液为醛基修饰试剂，冲洗硅烷化后的毛细管柱1-2h。戊二醛溶液为含5-30％戊二醛的pH9.0的60mM磷酸缓冲液。将5-10％PVA的水溶液同5MHCl水溶液按9∶1混合。用混合液冲洗醛基修饰后的毛细管柱1-5h；随后，管柱分别用水、甲醇冲洗，最后氮气吹干。本发明的聚乙烯醇涂层毛细管应用于蛋白质细管电泳分析中。可以保证较高的分离效率及分离度。文档编号G01N30/00GK101498699SQ20091006798公开日2009年8月5日申请日期2009年2月27日优先权日2009年2月27日发明者史清洪,彦孙,亮徐,姝白,董晓燕申请人:天津大学