专利名称：：黄芩花粉离体萌发液体培养基及测定黄芩花粉活力的方法
技术领域：
：本发明属于植物花粉活力测定
技术领域：
，涉及一种培养基，特别涉及一种黄芩花粉离体萌发液体培养基，以及利用该黄芩花粉离体萌发液体培养基测定黄芩花粉活力的方法。
背景技术：
：黄芩(ScutellariaBaicalensis)是唇形科植物，同属植物共有300多种，广布世界各地，我国有101种及29个变种。黄芩味苦性寒，具有清热燥湿泻火解毒、凉血止血、除热安胎的功效，也可用于泡茶，有清凉败火、消炎去暑的功效。近年来随着黄芩降压、抗变态反应和清除超氧阴离子等药理作用相继被发现，使社会对黄芩原材料的需求迅速增加，单靠野生黄芩资源已不能满足需求，目前黄芩已驯化成功并被大面积栽培，以满足社会需求，但各地生产中优良品种较为缺乏，已严重影响了我国黄芩生产的发展，因此，开展优良品种的选育是黄芩研究者的一项重要工作。进行黄芩花粉活力测定的研究，对种质资源保存与创新、优良品种的选育具有理论和实践意义。黄芩为两性花，开花后花粉成熟并自花粉囊中散出，成熟的花粉粒具有一定的活力，在田间条件下其活力能保持一定时间，但随时间的推移其活力会发生一定的变化，了解黄芩开花后花粉活力在田间的变化规律，对黄芩杂交体系的建立以及黄芩传粉类型的花粉都具有十分重要的意义。目前，花粉活力测定的方法主要有显微镜形态观察法、染色法、离体萌发法等。形态观察法是依据不育花粉在生长过程中由于受到某些因素的影响，发育不完全或不良的花粉粒形态常常呈畸形，而正常花粉有规则的外形。黄芩正常花粉粒为椭圆形或近圆形，而不育花粉呈不规则形，根据形态可以鉴别花粉活力。然而，黄芩花粉成熟后常常需要贮藏一段时间，贮藏过程中花粉活力会逐渐下降，由于黄芩正常花粉在贮藏过程中活力可能丧失，但形态并不发生明显变化；从而使得花粉粒形态观察法就不能鉴别贮藏后正常花粉活力变化情况。染色法是通过使用染色试剂对花粉粒进行染色，依据颜色变化判断花粉活力的高低，常用的染色试剂有I2-KI溶液和氯化三苯基四氮唑(TTC)等。用I2-KI溶液对发育良好的黄芩成熟花粉进行染色，花粉粒而没有被染成蓝色，而呈浅黄褐色，表明I2-KI溶液染色法不能测定黄芩花粉活力；而TTC染色法测定花粉活力实验重复性较差，会造成很大的实验误差，也不能准确测定花粉的实际活力高低。花粉离体萌发与花粉管生长测定结果较为稳定，更能反应花粉活力的实际状况。但花粉离体萌发需要适宜的培养基，常用的培养基基本成分是糖和硼酸，蔗糖浓度一般为10%20%，硼酸为0.001%0.005%，pH值为5.56.5。不同植物花粉萌发需要的培养基种类和浓度不同，二核型花粉较易萌发，在一般基本培养基上培养即可，而三核型花粉较难萌发，要在基本培养基的基础上添加其它促进花粉萌发的元素，如C^+，Mg气K^PEG等成分。近年来，人们对药用植物花粉离体萌发和花3粉管生长进行了较多研究，赵宏波等认为PEG对菊花、梅花花粉离体萌发生长具有显著促进作用；牛东玲等报道了肉苁蓉花粉离体萌发的适宜培养基，陈和明等研究了黄藤花粉离体萌发条件及低温贮藏对花粉活力的影响。然而，关于黄芩花粉离体萌发与花粉管生长的研究国内外尚未见报道。
发明内容本发明的目的在于，提供一种黄芩花粉离体萌发液体培养基及其用于测定黄芩花粉活力的方法，在确定黄芩花粉离体萌发培养体系的基础上，对黄芩花粉离体培养，并能够可靠、有效的测定黄芩花粉活力。为了实现上述任务，本发明是通过以下技术方案得以实现—种黄芩花粉离体萌发液体培养基，其特征在于，制得的该黄芩花粉离体萌发液体培养基是以蒸馏水为溶剂，其中含有100g/L的蔗糖、150g/L的PEG、以及BK培养基，pH值为5.8;所述BK培养基由下列原料组成:H萬:100mg/L，Ca(N03)24H20:300mg/L，MgS047H20:200mg/L，KN03:100mg/L。上述黄芩花粉离体萌发液体培养基用于测定黄芩花粉活力的方法，其特征在于，包括以下步骤1)花粉采集选取发育正常、无病虫危害的健壮黄芩植株，盛花期于上午7:008:00选取正开花的花序，摘除已开放的小花后连同一段枝叶一同将花序采下，迅速移入盛有清水的三角瓶中，带回实验室待花蕾自然开放，花粉从花药中散出，将花粉收集起来备用；2)花粉离体萌发及花粉管生长取权利要求1所述的黄芩花粉离体萌发液体培养基，滴入凹形载玻片凹槽中，用毛笔蘸取适量黄芩花粉匀撒在液体培养基上，置于底部垫有双层滤纸的培养皿中，盖紧盖子并放入恒温培养箱内3(TC离体光照萌发培养，花粉离体萌发培养20min后，部分花粉开始萌发，花粉萌发后的花粉管长度超过花粉粒直径后，花粉管开始快速生长；3)花粉活力的测定离体光照萌发培养3h后，进行花粉萌发率统计和花粉长度测量；以花粉管长度大于花粉直径为花粉萌发标准，每处理重复3次，每重复随机观察3个视野，每视野观察花粉数不少于50粒，统计花粉萌发率反应有活力的花粉所占比例；同时，用显微测微尺测量花粉管长度，每视野随机测量10个花粉，每处理共测90个花粉管长度，计算其平均值，花粉离体萌发花粉管生长情况即可反应花粉粒生理状况的优劣。本发明与现有技术相比，具有以下有益的技术效果1、黄芩花粉在本发明提供的黄芩花粉离体萌发液体培养基上，3(TC光照条件下培养，黄芩花粉萌发率可达到89.3%，花粉管也能得到较好生长；由于添加了PEG，黄芩花粉管生长较直，便于观察测量。2、利用该黄芩花粉离体萌发液体培养基与花粉管生长测定技术测定花粉活力测定结果稳定可靠，花粉萌发率反应有活力花粉所占比例，花粉管生长的观察与测量反应花粉粒生理状况的优劣，为黄芩花粉活力的测定提供了一种可靠、有效的方法。图1为黄芩花粉离体培养不同时间的花粉萌发率和花粉管的统计图；其中，A:萌发的花粉；B:生长2h的花粉管；C:生长4h的花粉管；图2为培养时间对花粉萌发生长的影响曲线。以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。具体实施例方式按照本发明的技术方案，首先制备黄芩花粉离体萌发液体培养基，该黄芩花粉离体萌发液体培养基是以蒸馏水为溶剂，其中含有100g/L的蔗糖、150g/L的PEG、以及BK，pH值为5.8;所述BK由下列原料组成:H萬:100mg/L，Ca(N03)24H20:300mg/L，MgS047H20:200mg/L，KN03:100mg/L。在确定黄芩花粉离体萌发液体培养基的基础上，利用该黄芩花粉离体萌发液体培养基对黄芩花粉离体培养，测定花粉的萌发率和花粉管的生长情况，能够可靠、有效的测定黄芩花粉活力。以下是发明人给出的实施例，该实施例是本发明较优的例子，主要用于进一步解释和理解本发明，本发明不限于该实施例。1、黄芩花粉的采集黄吝花粉为2008年7月中旬采自陕西商洛香菊制药公司药用植物园2年生黄吝群体。采集方法为选取发育正常、无病虫危害的健壮植株，于盛花期上午7:008:00选取正开花的花序，连同一段枝叶一同将花序采下，迅速移入盛有清水的三角瓶中，放置室内待花蕾自然开放，花粉从花药中散出，收集花粉备用。2、花粉离体萌发培养条件的筛选2.1花粉离体萌发培养基的筛选培养基种类对植物花粉离体萌发有较大影B向，不同植物花粉萌发的适宜培养基不同。设置5种不同的培养基分别为(1)ME3培养基;(2)BK培养基;(3)100gL-1葡萄糖;(4)100gL-1蔗糖;(5)150g/L的PEG4000溶液，蒸馏水培养作为对照。其中，ME3培养基组成为(mgL—0:MgS047H20370mgL-\KN03950mgL-\KH2P0485mg*L—\CaCl*2H20880mgL—^M^NO^IZ.5mg*L—"、KC1175mg*L—^H^O^Omg*L—工、Na2EDTA7.45mg*L—\FeS04*7H200.025mg*L—"、KI0.83mg*L—^Na^oC^*2H200.25mg*L—\CuS045H200.025mgL—\CoCl26H200.025mgL—\VB11.OmgL—1禾卩V朋l.OmgL—1;BK培养基组成为:H萬:lOOmgL-\Ca(N03)24H20:300mgL-\MgS047H20:200mg171禾口KN03:100mg17、将花粉分别以相同的光照、温度条件下在上述5种培养基上培养，分析基本培养基对花粉离体萌发和花粉管生长的影响；花粉的萌发率和花粉管的长度的测量方法为以花粉管长度大于花粉离直径为花粉萌发标准，每处理重复3次，每重复随机观察3个视野，每视野观察花粉数不少于50粒，统计花粉萌发率；用显微测微尺测量花粉管长度，每视野随机测量10个花粉，每处理共测90个花粉管长度，计算其平均值。结果如表1所示，由表1可以看出黄吝花粉在100g*L—1葡萄糖(3)或100g*L—1蔗糖(4)、150g/L的PEG4000溶液(5)和蒸馏水(对照)中均不能萌发；而在ME3培养基(1)和BK培养基(2)上均可萌发，且两者间存在显著差异，在BK培养基上黄芩花粉能够较好萌发，其萌发率可达到81.8%，花粉管也能得到较好生长。表1:培养基对黄芩花粉萌发率的影响培养基萌发率(％)花粉管长度(nm)13平均13平均ME312.310.511.711.5b42.421.712.925.3bBK79.682.383.581,8a196.5126.4137.6153.4a100g七"葡萄糖--------100g丄"蔗糖--------150g'L"PEG4000--------蒸馏水--------2.2PEG浓度筛选PEG4000是一种高分子量化合物，主要起到渗透调节作用。把新鲜花粉分别均匀散布在添加了lOOgL—\l50gL—\200gL—\250gL-1的PEG4000的3种培养基，即BK培养基、MEs培养基和ME3培养基+BK培养基中，于光照培养箱培养3h后测定萌发率和花粉管长度。结果如表2所示，从表2种可以看出，不同培养基中加入不同浓度的PEG4000，均可明显提高黄芩花粉萌发率和促进花粉管生长；同一培养基中随PEG4000加入浓度的增加，花粉萌发率和花粉管长度变化趋势相同，均呈"单峰"曲线变化，即在lOOg*L—1250g*L—1范围随PEG4000浓度的增加，花粉萌发率和花粉管长度先逐渐上升，达到最大之后又开始下降；其中150gL—屮EG4000处理效果最为显著，可明显提高花粉萌发率和促进花粉管生长。在显微观察时还发现，在添加了PEG4000的培养基中，黄芩花粉管生长较直，而未加PEG4000的培养基，其花粉管生长弯曲，常交织在一起，不便观察测量。表2:3种培养基与PEG4000互作对花粉萌发生长的影响6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.3蔗糖浓度试验蔗糖是一种渗透调节物质，同时也是花粉管生长的能源物质。在BK培养基+150gL—^EG4000的培养基中分别增加OgL—丄、50gL—丄、100gL—\l50gL—丄、200gL—1的蔗糖(所述OgL—1为不添加蔗糖)，比较不同浓度的蔗糖对花粉萌发和花粉管生长的影响。结果如表3所示，BK培养基+150g/LPEG中添加低浓度蔗糖(《50gL-0对黄芩花粉萌发率影响较小，添加中等浓度蔗糖(50gL—1100gL—0对花粉萌发具有明显促进作用，而添加高浓度的蔗糖(>150g*L—0可明显抑制花粉萌发。因此，低浓度的蔗糖对花粉管生长具有一定促进作用，随着蔗糖浓度的增加，花粉管生长明显受到抑制。在含有100gL—1蔗糖的BK培养基+150gL—屮EG4000培养基上，黄芩花粉生长最好，培养3h后，其花粉萌发率和花粉管长度分别达到89.3%和486.3ym。表3:不同浓度蔗糖互作对花粉萌发生长的影响蔗糖浓度(g.L")<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.4:pH梯度试验以蒸馏水为溶剂，加入BK培养基+100gL—1蔗糖+150gL—屮EG4000为基本花粉萌发液体培养基，增加酸碱将此培养基Kl值分别调为5.0、5.5、5.8、6.0。由表4可见，花粉萌发液体培养基pH值变化对黄芩花粉萌发和花粉管生长均有显著影响，pH值在5.06.0范围内，最终确定PH值为5.8;随pH值的增加，花粉萌发率和花粉管长度均呈"单峰"曲线变化，即在pH值较小时花粉萌发率和花粉管长度随pH的升高而增加，达到最大后开始迅速下降。表明培养基H+浓度过高或过低均显著抑制黄芩花粉萌发生长。表4:不同HI值对花粉萌发生长的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2.5:培养温度的筛选用BK培养基+100gL—1蔗糖+150gL—屮EG4000作为花粉萌发液体培养基，在20°C、25°C、30°C、35°C、40°C，5种不同温度条件下光培养，筛选黄芩花粉萌发和花粉管生长的最佳培养温度。以BK培养基+100gL—1蔗糖+150gL—屮EG4000为花粉萌发液体培养基，在不同温度条件下培养黄芩花粉，其花粉萌发和花粉管生长情况见表4，可以看出温度对黄芩花粉萌发生长具有显著影响，在2(TC3(TC范围，萌发率随温度的升高而增大，3(rC达到最大为88.7^，温度进一步升高，花粉萌发率开始下降，4(TC培养花粉其萌发率下降了25.1%(与3(TC条件下花粉萌发率相比)；在30°C35t:条件下培养黄芩花粉，其花粉管生长明显加快，花粉管长度显著长于其它温度。表明黄芩花粉萌发的适宜温度为25°C35t:，花粉管生长适宜温度为3(TC35t:，培养温度过高花粉萌发生长受到明显抑制。表5温度对花粉萌发生长的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2.5黄吝花粉生长和培养时间筛选将新鲜的黄芩花粉匀撒上在pH为5.8的BK培养基+100gL—1蔗糖+150gL—屮EG4000的花粉萌发液体培养基上，置于底部垫有双层湿滤纸的培养皿中，盖紧盖子并放入恒温培养箱内30。C培养，培养后5min、10min、15min、20min、30min、45min、lh、2h、3h、4h、6h、7.5h定时观测花粉管生长情况。黄芩花粉萌发生长情况如图2所示，其中，横坐标为培养时间，左边纵坐标表示花粉萌发率(％)，右边纵坐标表示花粉管长度(ym);在BK培养基+100g，L—工蔗糖+150g*L—屮EG4000的花粉萌发液体培养基上，3(TC光培养，黄芩花粉20min开始萌动，30min花粉管从花粉孔中突出，45min多数有活力花粉均已萌发，lh花粉管长度已超过花粉粒直径，花粉管开始快速生长，1.5h花粉管长度达到花粉直径56倍以上，2h达到10倍以上，3h达到15倍以上，4h花粉管生长交织在一起，花粉管顶端开始膨大，6h许多花粉管顶端破裂，内容物放出。因此，在黄芩花粉在pH为5.8的BK培养基+150gL—屮EG4000+100gL—1蔗糖的花粉萌发液体培养基上，3(TC恒温光照条件下离体培养3h后，测量花粉的萌发率和花粉管的长度，能够稳定有效的反应黄芩花粉的活力。3.离体萌发培养测定黄芩花粉活力1)待测花粉处理待测材料为陕西香菊制药公司商洛药源基地的两年生黄芩栽培群体，2008年7月黄芩开花的盛花期间，选取发育正常、无病虫危害的健壮黄芩植株，盛花期于上午7:008:00选取正开花的花序，摘除已开放的小花后连同一段枝叶一同将花序采下，迅速移入盛有清水的三角瓶中，带回实验室待花蕾自然开放，摘取花粉刚从花药中散出的小花放入垫有干滤纸灭菌培养皿中，盖上盖子，凡士林封口贮藏，并在当天测定花粉萌发率和花粉管长度；以后每天取贮藏在培养皿中的花粉测定其萌发率和花粉管长度，直至花粉完全失去其活力。2)花粉离体萌发及花粉管生长吸取23滴花粉萌发液体培养基(BK培养基+100gL—1的蔗糖+150gL—1的PEG4000，pH为5.8)滴入凹形载玻片凹槽中，将采集到的黄芩花粉混合均后，用毛笔蘸取适量匀撒上在上述培养基上，用牙签搅匀，将凹形载玻片置于底部垫有双层湿滤纸的培养皿中，盖紧盖子并放入3(TC恒温培养箱内光照培养；3)3(TC恒温光照条件下离体培养1.5h后，测量花粉的萌发率和花粉管的长度。花粉萌发和花粉管长度检测以花粉管长度大于花粉离直径为花粉萌发标准，每处理重复3次，每重复随机观察3个视野，每视野观察花粉数不少于50粒，统计花粉萌发率；同时用显微测微尺测量花粉管长度(Pm)，每视野随机测量10个花粉，每处理共测90个花粉管长度，计算其平均值。黄芩花粉在密闭培养皿保存过程中其萌发率和花粉管长度变化情况见表6，从表6种可以看出，黄芩花粉成熟当日起萌发率和花粉管长度分别达到最大值，之后随着贮藏时间的增加，黄芩花粉萌发率和花粉管长度均呈下降趋势；从表6中还可以看出，黄芩花粉贮藏5d时其萌发率每天平均下降仅为3.5%，而花粉贮藏5d8d其萌发率每天平均下降20.4%，花粉萌发率下降速度明显增加，表明黄芩花粉迅速裂变时期发生在花粉成熟后的5d8d。表6:黄芩花粉的活力在110天的检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>权利要求一种黄芩花粉离体萌发液体培养基，其特征在于，制得的该黄芩花粉离体萌发液体培养基是以蒸馏水为溶剂，其中含有100g/L的蔗糖、150g/L的PEG、以及BK培养基，pH值为5.8；所述BK培养基由下列原料组成H3BO3100mg/L，Ca(NO3)2·4H2O300mg/L，MgSO4·7H2O200mg/L，KNO3100mg/L。2.权利要求1所述的黄芩花粉离体萌发液体培养基用于测定黄芩花粉活力的方法，其特征在于，包括以下步骤1)花粉采集选取发育正常、无病虫危害的健壮黄芩植株，盛花期于上午7:008:00选取正开花的花序，摘除已开放的小花后连同一段枝叶一同将花序采下，迅速移入盛有清水的三角瓶中，带回实验室待花蕾自然开放，花粉从花药中散出，将花粉收集起来备用；2)花粉离体萌发及花粉管生长取权利要求1所述的黄芩花粉离体萌发液体培养基，滴入凹形载玻片凹槽中，用毛笔蘸取适量黄芩花粉匀撒在液体培养基上，置于底部垫有双层滤纸的培养皿中，盖紧盖子并放入恒温培养箱内3(TC离体光照萌发培养，花粉离体萌发培养20min后，部分花粉开始萌发，花粉萌发后的花粉管长度超过花粉粒直径后，花粉管开始快速生长；3)花粉活力的测定离体光照萌发培养3h后，进行花粉萌发率统计和花粉长度测量；以花粉管长度大于花粉直径为花粉萌发标准，每处理重复3次，每重复随机观察3个视野，每视野观察花粉数不少于50粒，统计花粉萌发率反应有活力的花粉所占比例；同时，用显微测微尺测量花粉管长度，每视野随机测量10个花粉，每处理共测90个花粉管长度，计算其平均值，花粉离体萌发花粉管生长情况即可反应花粉粒生理状况的优劣。全文摘要本发明公开了一种黄芩花粉离体萌发液体培养基及其用于测定黄芩花粉活力的方法，黄芩离体萌发液体培养基是以蒸馏水为溶剂，其包含的组分为BK、100g/L的蔗糖和150g/L的PEG4000，pH为5.8；利用该黄芩花粉离体萌发液体培养基与花粉管生长测定技术测定花粉活力测定结果稳定可靠，花粉萌发率反应有生活力花粉所占比例，花粉管生长的观察与测量反应花粉粒生理状况的优劣，黄芩花粉离体萌发与花粉管生长测定技术为黄芩花粉活力的测定提供了一种可靠、有效的方法。文档编号G01B11/02GK101717747SQ20091021935公开日2010年6月2日申请日期2009年12月4日优先权日2009年12月4日发明者刘志刚,呼天明,杨培志申请人:西北农林科技大学