专利名称：一种丙型肝炎病毒及其表面抗原的试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明属于感染性疾病检测技术领域。具体涉及到一种丙型肝炎病毒及其表面包 膜抗原E2的试剂盒，同时还涉及一种丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2试剂盒的检测方 法，它适用于丙型肝炎病毒及其丙型肝炎病毒抗原的检测。
背景技术：
丙型肝炎是一种主要经血液传播的疾病，丙型肝炎病毒Ofepatitis C Virus, HCV)慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌 (HCC)，对患者的健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题。丙型肝炎呈全 球性流行，是欧美及日本等国家终末期肝病的最主要原因。据世界卫生组织统计，全球HCV 的感染率约为3%，估计约1. 7亿人感染了 HCV，每年新发丙型肝炎病例约3. 5万例。丙型 肝炎目前尚无有效疫苗，也没有有效的治愈方法。因此，控制丙型肝炎只能从传染源和传播 途径入手，早期准确诊断和发现HCV感染者就是防控丙型肝炎传染源、阻断传播途径最为 有效的手段。所以，世界各国都不遗余力的研究丙型肝炎的诊断新技术。自从1989年建立了丙肝病毒抗-HCV检测方法以来，丙型肝炎的检测技术就处于 不断发展中。到目前为止，丙型肝炎检测技术主要有抗-HCV检测、HCV-RNA核酸扩增检测、 和HCV核心抗原的检测。目前用于临床HCV感染检测的主要指标仅为抗HCV和HCV-RNA，但 两者在丙肝诊断中均存在一定的局限性，如对于免疫功能不正常、或“窗口期”的HCV感染 者，则不能检出抗-HCV，有一定的漏检率；HCV RNA其操作复杂，而且仪器特殊、检测费用昂 贵，在一般实验室不易开展。作为HCV感染的检测手段，HCV表面抗原检测丙型肝炎病毒的 感染具有十分重要的意义。
发明内容
发明的目的是在于提供了一种丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2的试剂盒，该 试剂可以检测丙型肝炎病毒的感染，检测速度快，操作方便安全，省时效率高，而且价格低 廉，检测灵敏度和精确度都很高，应用前景广阔。发明的另一个目的是在于提供了一种丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2的试剂 盒检测丙型肝炎病毒的方法，该试剂盒优于HCV抗体检测法，本方法可以检测窗口期，即病 毒感染的早期或潜伏期，有利于早期对病人的防治；另外在成本和操作上也优于HCV-RNA 核酸扩增检测法，比HCV-RNA核酸扩增检测法成本低，操作更简便，检测灵敏度和精确度 高。本发明试剂盒对丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2检测的方法是利用一种能特异性 结丙型肝炎病毒表面包膜抗原E2的单链DNA适配子作为探针，采用丙型肝炎病毒及其表面 包膜抗原E2多克隆抗体包被孔板，生物素标记的该DNA适配子作为探针，类似夹心ELISA 法，用于检测血清或体液中丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2。为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施—种丙型肝炎病毒及其丙型肝炎病毒包膜抗原E2的试剂盒，它包括抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗体，酶标板(购自海门市三和新华玻璃实验仪器厂)，生物素 标记核酸适配子ZE18，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(购自北京博奥生物技术有限公 司)及其显色底物3’，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)(购自深圳达科为生物技术有限公 司)。所述的抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗体(或抗血清)的制备将 丙型肝炎病毒包膜抗原E2的真核表达载体pcDNA3. 1A-E2 (来源于Vaccine，2007，25 1544-1551)，肌肉多点注射入家兔，每隔一周后注射一次，每次免疫注射100 200微克质 粒DNA，注射三次，用基因电导入仪(购自宁波新芝生物科技有限公司)在注射部位电极 导入DNA，第三次注射后2周，再用丙型肝炎病毒包膜抗原E2重组蛋自(来源于Vaccine， 2007,25 :1544-1551)加强免疫，免疫注射2次，每次免疫注射100微克蛋白，两周后心脏取 血，IOOOrpm离心分离血清，即为丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗体(或抗血清)。保 存于-80°C。所述的核酸适配子观18为本发明者通过SELEX筛选技术，通过筛选到的能特异性 结合丙型肝炎病毒包膜抗原E2的单链DNA适配子，命名为观18(具体步骤见发明专利申 请号:200810197315. 4，发明人章晓联，陈芳)。所述的生物素标记核酸适配子观18 将观18序列送公司合成，公司合成生物素标 记观18的5，端(命名为bio-ZE18)。并用无菌双蒸水稀释为400nM的浓度，_20°C保存。 新型生物素标记的DNA适配子具有SEQIDN0. 1，所示的核苷酸序列；一种丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2的试剂盒检测丙型肝炎病毒的方法，检测步骤是1、将1 200兔抗丙型肝炎病毒包膜抗原的多克隆抗血清(效价为1 12800， PBS稀释)包被酶标板(如96孔)，4度过夜。2、含有 5/10000 吐温-20 的磷酸盐缓冲液(PBS 溶液=NaCl 8g，KCl 0. 2g，Na2HPO4 1. 44g，KH2PO4 0. 24g,加去离子水溶解，定容至IOOOml，调pH至7. 4，15磅灭菌20min,置4°C 保存)，洗涤六遍。3,1% (g/ml)牛血清白蛋白(BSA) (PBS溶解)封闭96孔板，100 μ 1/孔，37度封 闭1小时。4、加入待检样品、包括HCV病毒(来源于Cell Mol Immunol. 2009,6(4) :235-44)、 HCV病毒阳性血清、或对照样品，100 μ 1/孔，37度孵育1小时。5、含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍。6、加入 bio4E18G00nM/孔，PBS 稀释)，37 度孵育 1 小时。7、含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍。8、加入加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP-sti^ptoavidin) (1 1000， PBS稀释)，100 μ 1/孔，37度孵育1小时。9、含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍。10、加入底物显色剂(TMB) (TMB干粉10mg，溶于5ml无水乙醇中Qmg/ml)。pH5. 0 显色液IOml中，加入ang/ml TMB 0.5ml，再加入2μ1 30% H2O2，临用前配制)显色2min， 用2M浓硫酸中止显色。本发明中所用的底物显色剂配方包括A底物是TMB 20mg(固体)， 先用无水乙醇IOml溶解，充分振荡(试剂瓶要干净，干燥)，加双蒸水定容到100ml，此即是A底物；B底物是取1水柠檬酸2. lg，无水Na2HP04 2. 82g，0. 75%的过氧化氢0. 6細1，双 蒸水定容至100ml (无须调pH值，应在4. 5-5. 0范围)，此即是B底物。使用时，A底物与B 底物各取5ml混勻。11、1小时内在Themo scientific Multskan mk3多功能酶标仪450nM下检测吸 光度。检测结果是丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒E2抗原或HCV感染阳性病人及其丙型肝炎 病毒E2抗原阳性病人的0D450值均大于设定的临界值(cutoff值)，而阴性样品或正常健 康人的0D450值均小于临界值(cutoff值)，cutoff值=0. 1 X阳性对照的平均0D450值 +阴性对照的平均0D450值。说明本试剂盒的检测结果能有效的鉴别出丙型肝炎病毒、或 HCV感染感染患者与正常健康人或非丙型肝炎病毒感染感染患者的不同。本发明的优点是核酸适配子体外容易合成，且能特异性与丙型肝炎病毒包膜抗 原结合，而不与其他病毒等病原体结合，同时对于丙型肝炎病人阳性的血清，都能表现出高 于临界值(cutoff值)的OD值，而对于阴性的，OD值都在临界值(cutoff值)以下，说明 核酸适配子检测有较高的灵敏性。因此，对于核酸适配子在丙型肝炎病人的早期诊断方面， 在临床上有很大的应用前景。
图1本试剂盒检测HCV、HCVE2抗原特异性的鉴定丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原E2、以及与HCV阳性病人血清的结合OD值 明显高于对健康正常人血清的OD值，有显著差别，*p < 0. 05，有很高的特异性。图2本发明试剂盒检测HCV、以及不同病人特异性的鉴定本发明试剂盒分别检测丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原E2、以及乙或丙肝 阳性病人血清、结核(TB)阳性病人血清等，检测结果是丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜 抗原E2、以及与丙肝(HCV)阳性病人血清的结合OD值明显高于对其他病人血清的OD值， 有显著差别，*P < 0.05。说明本法能有效的鉴别出丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原 E2、以及丙肝(HCV)阳性病人与其他病人间的不同。图中HBV patients 代表HBV阳性病 人血清；TB patients 代表结核TB阳性病人血清；HCV patients 代表HCV阳性病人血清； Healthy donors 代表健康正常人血清。
具体实施例方式实施例1 本试剂盒检测HCV病人特异性的鉴定本试剂盒检测丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原E2、以及IM份HCV阳性病人 血清和135份健康正常人血清。对象丙型肝炎病毒来源于Cell Mol Immunol. 2009,6 ) :235-44 ；丙型肝炎 病毒包膜抗原 E2 来源于 Vaccine，2007，25 :1544-1551 ；HCV 感染者:2007-03/2008-08 在 武汉大学中南医院、武汉市传染病医院等临床诊断明确为丙型肝炎病毒(HCV)感染的患 者，并排除其他肝炎病毒和HIV病毒感染，平均年龄44 (8 80)岁。部分患者使用干扰素 进行抗病毒治疗；非HCV感染者同期在武汉大学中南医院就医、临床已排除HCV感染的患 者，平均年龄35 (8 79)岁。一种丙型肝炎病毒及其丙型肝炎病毒包膜抗原E2的试剂盒，它包括抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗体，酶标板(购自海门市三和新华玻璃实验仪器厂)，生物素 标记核酸适配子ZE18，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(购自北京博奥生物技术有限公 司)及其显色底物TMB(购自深圳达科为生物技术有限公司)。生物素标记核酸适配子观18 将观18序列送公司合成，合成生物素标记观18的 5，端(命名为bio-ZE18)。并用无菌双蒸水稀释为400nM的浓度，_20°C保存。一种丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2的试剂盒检测丙型肝炎病毒的方法，其检测步骤如下1、将1 200兔抗丙型肝炎病毒包膜抗原的多克隆抗血清(效价为1 12800， PBS稀释)包被96孔ELISA板，4度过夜。2、含有 5/10000 吐温-20 的磷酸盐缓冲液(PBS 溶液=NaCl 8g，KCl 0. 2g，Na2HPO4 1. 44g，KH2PO4 0. 24g,加去离子水溶解，定容至IOOOml，调pH至7. 4，15磅灭菌20min,置4°C 保存)，洗涤六遍。3,1% (g/ml)牛血清白蛋白(BSA) (lmg/mLPBS 溶解)封闭 96 孔板，100 μ 1/孔，37 度封闭1小时。4、加入待检样品，100 μ 1/孔，37度孵育1小时。2. 5.含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍。6、加入 bio4E18G00nM/孔，PBS 稀释)，37 度孵育 1 小时。7、含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍.8、加入加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP-sti^ptoavidin) (1 1000， PBS稀释)，100 μ 1/孔，37度孵育1小时。9、含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍.10、加入底物显色剂(TMB) (TMB干粉10mg，溶于5ml无水乙醇中Qmg/ml)。pH5. O 显色液IOml中，加入ang/ml TMB 0.5ml，再加入2μ1 30% H2O2，临用前配制)显色2min，
用2M浓硫酸中止显色。11、1小时内在Themo scientific Multskan mk3多功能酶标仪450nM下检测吸光 度。检测结果是丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原E2以及HCV感染阳性病人及其丙型 肝炎病毒E2抗原阳性病人的0D450值均大于设定的临界值(cutoff值)，而正常健康人及 阴性样品的0D450值均小于临界值(cutoff值)，cutoff值=0. IX阳性对照的平均0D450 值+阴性对照的平均0D450值。说明本试剂盒的检测结果能有效的鉴别出丙型肝炎病毒、 丙型肝炎病毒包膜抗原、以及丙型肝炎病毒感染感染患者与正常健康人或非丙型肝炎病毒 感染感染患者的不同。结果见图1。实施例2 本发明试剂盒检测丙型肝炎病毒、以及不同病人特异性的鉴定分别检 测丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原E2、以及乙肝或丙肝阳性病人血清、结核阳性病人血清。对象丙型肝炎病毒来源于Cell Mol Immunol. 2009，6 G) :235-44 ；丙型肝炎病 毒包膜抗原 E2 来源于 Vaccine，2007，25 :1544-1551 ；HCV 感染者:2007-03/2008-08 在武 汉大学中南医院、武汉市传染病医院等临床诊断明确为丙型肝炎病毒(HCV)感染的患者， 并排除其他肝炎病毒和HIV病毒感染，平均年龄44 (8 80)岁。部分患者使用干扰素进 行抗病毒治疗；结核病人样本来源于武汉市医疗救治中心住院病人确诊为仅结核阳性病人；乙肝病人来源于武汉大学中南医院，明确为乙型肝炎病毒(HBV)感染的患者，并排除 其他肝炎病毒和HIV病毒感染，平均年龄44 (8 80)岁；非HCV感染者同期在武汉大学中 南医院就医、临床已排除HCV，HBV, HIV感染的患者，平均年龄35(8 79)岁。一种丙型肝炎病毒包膜抗原E2的试剂盒，它包括抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2 的多克隆抗体，酶标板(购自海门市三和新华玻璃实验仪器厂)，生物素标记核酸适配子 观18，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(购自北京博奥生物技术有限公司)及其显色底 物TMB(购自深圳达科为生物技术有限公司)。生物素标记核酸适配子观18的制备将观18序列送公司合成，合成生物素标记 ZE18的5，端(命名为bio-ZE18)。并用无菌双蒸水稀释为400nM的浓度，_20°C保存。一种丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2的试剂盒检测丙型肝炎病毒的方法，其检测步骤如下1.将1 200兔抗丙型肝炎病毒包膜抗原的多克隆抗血清(效价为1 12800， PBS稀释)包被96孔ELISA板，4度过夜；2.含有5/10000吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBS溶液NaCl 8g，KCl 0. 2g， Na2HPO4L 44g, KH2PO4 0. 24g,加去离子水溶解，定容至1000ml,调pH至3. 4. 15磅灭菌 20min,置4°C保存)，洗涤六遍；3. 1 % (g/mL)牛血清白蛋白(BSA) (PBS溶解)封闭96孔板，100 μ 1/孔，37度封 闭1小时；4.加入待检样品，100 μ 1/孔，37度孵育1小时；5.含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍；6.加入 bio-ZE18 (400nM/ 孔，PBS 稀释)，37 度孵育 1 小时;7.含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍；8.加入加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP-sti^ptoavidin) (1 1000， PBS稀释)，100 μ 1/孔，37度孵育1小时；9. 5/10000 吐温-20 的 PBS，洗涤六遍.10.加入底物显色剂，显色2分钟，用2Μ浓硫酸中止显色。本发明中所用的底物TMB显色剂配方包括Α底物是TMB 20mg (固体)，先用无水 乙醇IOml溶解，充分振荡(试剂瓶要干净，干燥)，加双蒸水定容到IOOml，此即是A底物； B底物是取1水柠檬酸2. lg，无水Na2HP04 2. 82g，0. 75%的过氧化氢0. 6細1，双蒸水定容 至100ml (无须调pH值，应在4. 5-5. 0范围)，此即是B底物。使用时，A底物与B底物各取 5ml混勻。11. 1小时内在Themo scientific Multskan mk3多功能酶标仪450nM下检测吸光 度。检测结果是丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原E2以及丙型肝炎病毒感染阳性病人 及其丙型肝炎病毒E2抗原阳性病人的0D450值均大于设定的临界值(cutoff值)，而正常 健康人及阴性样品、结核阳性病人，乙肝病人的0D450值均小于临界值(cutoff值)，cutoff 值=0.1 X阳性对照的平均0D450值+阴性对照的平均0D450值。说明本试剂盒的检测结 果能有效的鉴别出丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原、以及丙型肝炎病毒感染感染患 者与乙肝病毒感染患者、结核病人等的不同。结果见图2。实施例3
本发明试剂盒与HCV-RNA、HCV-Ab检测相比较对象丙型肝炎病毒；HCV感染者2007-03/2008-08在武汉大学中南医院、武汉市 传染病医院等临床诊断明确为丙型肝炎病毒(HCV)感染的患者，并排除其他肝炎病毒和 HIV病毒感染，平均年龄44 (8 80)岁。部分患者使用干扰素进行抗病毒治疗。②非HCV 感染者同期在武汉大学中南医院就医、临床已排除HCV感染的患者，平均年龄35 (8 79)
岁οHCV-RNA检测FQ2PCR方法，采用Roche公司LightCycler荧光定量PCR扩增仪 及数据处理软件。检测试剂为中山大学达安基因股份有限公司提供的丙型肝炎病毒(HCV) Taqman探针法核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒。抗-HCV检测采用上海科华生物技术工程有限公司提供的酶联免疫法原理 (ELISA)抗-HCV检测试剂盒(主要组分HCV核心抗原和非结构区抗原包被的微孔板和酶 标记特异性抗人IgG)；在意大利SEAC公司生产的Alisei全自动酶免分析系统上检测，相 关参数按试剂说明书设置。本试剂盒检测将抗丙型肝炎病毒包膜抗原的多克隆抗血清包被ELISA板后，洗 后，加入不同病人血清和健康正常人血请对照，经反复洗涤，未结合的病毒被洗去，结合在 板上的HCV再用生物素标记的适配子捕获，再经反复洗涤后，加辣根过氧化物酶标记的链 霉亲和素，最后加入底物显色，显色终止后，在酶标仪450nm的吸收波长上测其OD值。检测 结果本试剂盒检测的OD值高低与病毒含量呈正相关性；本试剂盒与HCV-RNA、HCV-Ab检 测结果相比较呈正相关性。以上检测结果见表一。 麦一本发明试剂盒与HCV-RNA检测方法、HCV-Ab抗体检测相比较
权利要求
1.一种丙型肝炎病毒及其表面抗原的试剂盒，其特征在于试剂盒包括抗丙型肝炎 病毒包膜抗原E2的多克隆抗体；酶标板；生物素标记核酸适配子观18 ；辣根过氧化物酶标 记的链霉亲和素及其显色底物3’，3’，5，5’ -四甲基联苯胺；所述的抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗体的制备将丙型肝炎病毒包膜抗原 E2的真核表达载体pcDNA3. 1A-E2，肌肉多点注射入家兔，每隔一周后注射一次，每次免疫 注射200g质粒DNA，注射三次，用基因电导入仪在注射部位电极导入DNA，第三次注射后2 周，再用丙型肝炎病毒包膜抗原E2重组蛋白加强免疫，免疫注射2次，每次免疫注射100 μ g 蛋白，两周后心脏取血，IOOOrpm离心分离血清，为丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗 体，保存于-80°C ；所述的生物素标记核酸适配子观18 将观18序列合成，合成生物素标记观18的5’端 为bio-ZE18，用无菌双蒸水稀释为400nM的浓度，_20°C保存。
2.权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒及其丙型肝炎病毒包膜抗原E2的试剂盒检测 丙型肝炎病毒的方法，其步骤是A、将1 200兔抗丙型肝炎病毒包膜抗原的多克隆抗血清包被酶标板，4度过夜；B、含有5/10000吐温-20的磷酸盐缓冲液，PBS溶液=NaCl8g，KCl 0. 2g，Na2HPO4 1. 44g，KH2PO4 0. 24g,加去离子水溶解，定容至IOOOml，调pH至7. 4，15磅灭菌20min,置4°C 保存，洗涤六遍；CU% g/ml牛血清白蛋白，PBS溶解，封闭96孔板，100 μ 1/孔，37度封闭1小时；D、加入待检样品包括HCV病毒HCV病毒阳性血清、或对照样品，100μ 1/孔，37度孵育 1小时；Ε、含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍；F、加入bio-ZE18,400nM/孔，PBS稀释，37度孵育1小时;G、含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍；H、加入加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，1 1000，PBS稀释，100μ 1/孔，37度孵 育1小时；J、含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍；K、加入底物显色剂，显色2分钟，用2Μ浓硫酸中止显色；LU小时内在多功能酶标仪450ηΜ下检测吸光度；所述的底物显色剂配方包括Α底物是TMB 20mg，先用无水乙醇IOml溶解，充分振荡， 加双蒸水定容到IOOml ；B底物是取1水柠檬酸2. Ig,无水Na2HP042. 82g，0. 75 %的过氧化 氢0. 6細1，双蒸水定容至100ml，使用时，A底物与B底物各取5ml混勻。
3.权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒及其表面抗原的试剂盒，其特征在于所述的 生物素标记核酸适配子ZE18，其序列为SEQIDN0. 1所示的核苷酸序列。
全文摘要
本发明公开了一种丙型肝炎病毒及其表面抗原的试剂盒及检测方法。包括抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗体，酶标孔板，生物素标记单链DNA适配子ZE18，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素及其显色底物。将抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗体包被酶标孔板，加入丙型肝炎病毒或待检血清或血液样品以及对照样品，经洗涤六次，结合在板上的丙型肝炎病毒或包膜抗原E2再用生物素标记的适配子ZE18捕获，加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，加入底物显色，显色终止后，在酶标仪的吸收波长上测其OD值。本试剂盒检测速度快，操作方便安全，省时效率高，有效地对丙型肝炎病毒进行检测。试剂盒价格低廉，检测灵敏度和精确度很高，应用前景广阔。
文档编号G01N33/543GK102081093SQ20091027304
公开日2011年6月1日 申请日期2009年11月30日 优先权日2009年11月30日
发明者章晓联, 胡艺兰 申请人:武汉大学