专利名称：一种结核分枝杆菌的试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明属于感染性疾病检测技术领域，特别是涉及一种结核分枝杆菌的试剂盒， 同时，本发明还涉及一种结核分枝杆菌的试剂盒检测结核分枝杆菌的方法，主要检测结核 分枝杆菌、以及疑似病人的痰、血液和体液中的结核分枝杆菌或菌体抗原，适用于所有医 院，包括传染病和结核病医院等用于对结核分枝杆菌的检测。
背景技术：
结核病是由结核分枝杆菌引起的、人兽共患的慢性消耗性传染病，给人类健康带 来严重威胁。据世界卫生组织(WHO)统计资料显示，全球目前有近三分之一的人感染结核 杆菌，活动性肺结核病人达2000万，每年有300万人死于结核病，每年新发病人数800 1000万。1993年，世界卫生组织宣布“全球结核病处于紧急状态”，把结核病列为重点控制 的传染病之一。我国是结核病高负担国家，现有活动性肺结核病人500万人，传染性肺结核 病人200万人，每年新增病例约130万人，因结核病死亡15万人之多(《全国结核病防治规 划Q001-2010年)》，国办发[2001]75号文件)。国务院已确定结核病为我国三大重点防 治传染病之一。我国结核病疫情的严重程度仅次于印度，位居世界第二。我国结核病疫情 呈三高一低，即患病率高、死亡率高、耐药率高，年递降率低。近年来由于HIV/AIDS流行、人 口流动、耐药结核菌逐年增加，结核病发病率开始上升，结核病疫情更加严重。运用新型检测方法对结核病进行早期检测与治疗具有十分重要的意义，目前国内 外结核已有的检测技术存在许多缺陷，缺乏特异、有效、快速、方便、廉价的检测技术和产 品，特别是一直缺乏对结核抗原的敏感早期检测手段。如传统的痰涂片法检测患者痰液中 的结核杆菌，痰结核菌培养需耗时6-8周，检测时间过长。过去PPD(结核菌素纯蛋白衍化 物)也常用于结核病的检测和流行病学调查，但是其特异性和敏感性均有一定局限性。又 如传统的血清学抗体检测不能检测早期病菌抗原，不能检测窗口期病人和潜伏感染病人等 缺陷。临床上对疑似感染结核的病人，由于缺乏有效的检测方法，常常采用先抗结核治疗， 再以治疗的效果为依据来进行检测，如此一来浪费了大量的人力物力，也可能造成对其他 疾病的误诊或是延误治疗。所以，探索新型检测方法对结核病进行早期检测研究用于结核 病快速、有效、方便、廉价的特异性检测，对于及时治疗结核病人和控制结核病传染疫情都 具有十分重要的意义
发明内容
发明的目的是在于提供了一种结核分枝杆菌的试剂盒，该试剂盒是对结核分枝杆 菌感染的早期检测，可直接检测结核分枝杆菌、或疑似病人的痰、血液和体液中的结核分枝 杆菌或菌体抗原，比起传统通过痰培养的检测方法，从过去的2-4周缩减为半天左右时间。 对结核分枝杆菌检测的具体过程和步骤是采用一种能特异性结合结核分枝杆菌H37Rv菌 体抗原的单链DNA适配子作为探针，生物素标记该DNA适配子作为探针，类似间接ELISA 法，用于检测结核分枝杆菌、痰液或体液中结核分枝杆菌或结核分枝杆菌抗原。
发明的另一个目的是在于提供了一种结核分枝杆菌的试剂盒检测结核病中结核 分枝杆菌的方法，该方法将此单链适配子与结核病的检测结合起来，并把传统通过痰培养 的检测方法从过去的2-4周缩减为半天左右时间。DNA单链适配子体外合成非常简单，而且 价格低廉，同时本发明的方法操作简单，对于结核病中结核分枝杆菌的检测灵敏度和精确 度均很高。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案—种结核分枝杆菌的试剂盒，它包括酶标板(购自海门市三和新华玻璃实验仪器 厂)，生物素标记核酸适配子NK2，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(购自北京博奥生物 技术有限公司)及其显色底物3’，3’，5，5’ -四甲基联苯胺(TMB)(购自深圳达科为生物技 术有限公司)。所述的的核酸适配子NK2为本发明者通过SELEX筛选技术，通过筛选到的能特 异性结合结核分枝杆菌的DNA单链适配子，命名为NK2(具体步骤见发明专利申请号 200610019671. 8，发明人章晓联、陈凡)。所述的生物素标记核酸适配子NK2的制备将NK2序列送公司合成，公司合成生物 素标记NK2的5，端(命名为bio-NK2)。其序列为SEQIDN0. 1所示的核苷酸序列。并用无 菌双蒸水稀释为400nM的浓度，-20°C保存。一种结核分枝杆菌的试剂盒检测结核分枝杆菌的方法，它包括生物素标记核酸适 配子NK2的制备。利用本发明试剂盒(即间接ELISA试剂盒)对结核分枝杆菌检测的具体 过程和步骤如下1、将待检样品，如痰液或血液或体液，或细菌(1000CFU/mL)/痰液加在96孔酶标 板，100 μ 1/孔，4度孵育过夜。2、含有 5/10000 吐温-20 的 PBS(PBS 溶液=NaCl 8g, KCl 0. 2g, Na2HPO4L 44g, KH2PO4O. 24g,加去离子水溶解，定容至IOOOml，调pH至7. 4，15磅灭菌20min,置4°C保存)， 洗涤六遍。3,1% (g/ml)牛血清白蛋白(BSA) (PBS溶解)封闭96孔板，100 μ 1/孔，37度封 闭1小时。4、用含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍。5、加入 bio-NK2(400nM/孔，PBS 稀释)，37 度孵育 1 小时。6、含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍.7、加入加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP-str印toavidin) (1 1000， PBS稀释)，100 μ 1/孔，37度孵育1小时。8、含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍.9、加入底物显色剂，显色2分钟，用2Μ浓硫酸中止显色；本发明中所用的底物显色剂配方Α底物是TMB 20mg(固体)，先用无水乙醇 IOml溶解，充分振荡(试剂瓶要干净，干燥)，加双蒸水定容到100ml，此即是A底物；B底 物是取1水柠檬酸2. Ig,无水Na2HP042. 82g，0. 75 %的过氧化氢0. 6細1，双蒸水定容至 100ml (无须调pH值，应在4. 5-5. 0范围)，此即是B底物。使用时，A底物与B底物各取5ml 混勻。10、1小时内在Themo scientific Multskan mk3多功能酶标仪450nM下检测吸光度。检测结果是结核分枝杆菌、结核病阳性的0D450值均大于设定的临界值(cutoff值)， 而正常健康人及阴性样品的0D450值均小于cutoff值，cutoff值=0. 1 X阳性对照的平均 0D450值+阴性对照的平均0D450值。说明本试剂盒的检测结果能有效的鉴别出结核病、以 及结核分枝杆菌与其他菌株间的不同。本试剂盒对结核分枝杆菌检测的特异性鉴定用上述间接ELISA方法，加入多种不同细菌结核杆菌标准毒株H37Rv(来源于 ATCC 93009,Biochemical and Biophysical Research Communications 357(2007)743-748)、 卡介苗 BOG (来源于 Biochemical and Biophysical Research Communications 357(2007)743-748)、 鸟分支杆菌 M2(M. avium，来源于 ATCC25^1，Clin Chem Lab Med. 2009. 47(4) :405-11)、耻 垢分支杆菌(Μ. smegmatis，来源于 ATCC19420，Clin Chem Lab Med. 2009. 47(4) :405-11)、 鼠伤寒沙门菌 Salmonella typhimurium C5 (来源于 Eur J Immunol. 2009,39 :1-12 ； Vaccine. 2009,27 :6712-6722)，甲型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi A，来源于ATCC 9150，Br Med J. 1965. 2(5454) :152-3)、乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B，来 源于ATCC 2659，J Ethnopharmaco 1. 1998. 62(3) :251-4)。经洗涤六遍，未结合的细菌被洗 去，结合在板上的结核分枝杆菌再用生物素标记的适配子NK2捕获，再经洗涤六遍后，结合 上的生物素标记的适配子NK2与加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素结合，最后加入底物 显色，显色终止后，在酶标仪450nm的吸收波长上测其OD值。检测结果说明本试剂盒的检 测结果能有效的鉴别出结核分枝杆菌与其他菌株间的不同。实验数据见图1-2。本试剂盒对结核杆菌检测的灵敏度鉴定结核病人样本来源于武汉市医疗救治中心住院病人。年龄25 65岁，系2008年 6月至2009年3月住院病人。临床有低热、盗汗、咳嗽等症状，血像升高，痰涂片抗酸染色 阳性，经TB抗体和胸片确诊为肺结核。健康志愿者(年龄18 52岁)痰涂片抗酸染色阴 性。用上述间接ELISA方法，加入不同结核病人痰液(用生理盐水1 10稀释)和非 结核病人或正常人痰液对照，经反复洗涤，未结合的痰液细菌被洗去，结合在板上的结核分 枝杆菌再用生物素标记的适配子NK2捕获，再经洗涤6次后，加辣根过氧化物酶标记的链霉 亲和素，最后加入底物显色，显色终止后，在酶标仪450nm的吸收波长上测其OD值。同时在 武汉市医疗救治中心检验科将结核病人的痰液和血液，一部分拿去做常规的抗酸染色，PPD 检测和血清学抗体检测。报告的阳性与阴性结果与本试剂盒检测的阳性与阴性结果有很好 的正相关符合率，实验数据见表1-3。本发明的优点是核酸适配子体外容易合成，且能特异性与结核分枝杆菌H37Rv 结合，而不与其他细菌结合，同时对于结核病人痰抗酸染色阳性的痰液，都能表现出很高高 于的OD值，而对于阴性的，OD值都在0.2以下，说明本发明试剂盒核酸适配子检测方法与抗 酸染色等方法有很好的正相关性，有较高的灵敏性和特异性。并把传统通过痰培养的检测 方法从过去的2-4周缩减为半天左右时间。DNA单链适配子体外合成非常简单，而且价格低 廉，同时本发明的方法操作简单，对于结核病人痰培养阳性的检测灵敏度和精确度都很高。
图1本发明试剂盒对不同细菌的检测示意图
本发明试剂盒检测对不同细菌的检测，与结核杆菌标准株H37Rv的检测的结合OD 值最高(0D450 > 0. 4)，显著高于对卡介苗、鼠伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌和乙型副伤 寒沙门菌检测的OD值，说明本发明试剂盒能有效的鉴别出结核与其他细菌菌株间的不同。 有很高的特异性。H37RV 毒性结核分枝杆菌；卡介苗BCG ；鼠伤寒沙门菌C5 =Salmonella typhimurium C5 ；甲型副伤寒沙门菌Salmonella paratyphi A ；乙型副伤寒沙门菌 Salmonella paratyphi B。图2本发明试剂盒对不同分支杆菌的检测示意图本发明试剂盒分别检测H37RV、BCG、鸟分支杆菌(M. avium ATCC25291) (M2)、耻垢 分支杆菌(M. smegmatis ATCC19420)，在1 X 103CFU/mL的菌液浓度下，与结核杆菌标准株 H37Rv的结合OD值最高(0D450 > 0. 5)，说明本发明试剂盒能有效的鉴别出结核与其他分 支菌菌株间的不同，有显著差别，和很高的特异性。
具体实施例方式实施例1 一种结核分枝杆菌的试剂盒，它包括96孔ELISA板，生物素标记核酸适配子NK2， 辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素及其显色底物。制备过程如下1.将NK2序列合成，将NK2序列送公司合成，公司合成生物素标记NK2的5，端为 bio-NK2，所述的生物素标记核酸适配子NK2，其序列为SEQIDN0. 1所示的核苷酸序列。并用 无菌双蒸水稀释为100nM，200nM，400nM的浓度，_20°C冰箱中保存。2.将结核杆菌标准毒株 H37Rv (来源于 ATCC 93009，Biochemical and Biophysical Research Communications 357(2007)743-748),卡介苗 BCG(来源于 Biochemical and Biophysical Research Communications 357 (2007) 743-748)、鸟分支杆 菌 M2(M. avium，来源于 ATCC25^1，Clin Chem Lab Med. 2009. 47(4) :405-11)、耻垢分支杆 菌(Μ. smegmatis，来源于 ATCC19420，Clin Chem Lab Med. 2009. 47(4) :405-11)、鼠伤寒沙 门菌 Salmonella typhimurium C5(来源于 Eur JImmunol. 2009,39 :1-12 ；Vaccine. 2009, 27 :6712-6722)，甲型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi A，来源于 ATCC 9150, Br Med J. 1965. 2(5454) :152-3)、乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B，来源于 ATCC 2659,J Ethnopharmaco 1. 1998.62(3) :251-4)用生理盐水调成不同的浓度。其中结核杆菌 标准毒株H37Rv，卡介苗在罗氏培养基中培养，其他细菌在LB培养基中培养。本发明中所用的LB培养基的制备方法为配制IL的用量蛋白胨IOg酵母抽提物 5g NaCl IOg调pH值至7. 0-7. 2.分装后于121摄氏度灭菌15min。本发明中所用的改良罗氏培养基的制备方法为味精(谷氨酸钠95%以上)7. 2g; 磷酸二氢钾2. 4g ；硫酸镁0. 24g ；柠檬酸镁0. 6g ；甘油12mL ；蒸馏水600mL ；马铃薯淀粉 30g ；全卵液IOOOmL ；2% (g/ml)孔雀绿20mL.制备法各盐类成分溶解后加马铃薯淀粉，混 勻，沸水锅内煮沸30 40min (其间不时摇动，防凝块)，呈糊状，待冷后，加入经消毒纱布 过滤的新鲜全卵液IOOOmL,混勻。加2%孔雀绿20mL，混勻，分装试管(18mmX 180mm)。每 一试管加培养基7mL，培养基斜面高度为培养基占试管底部的三分之二处为宜，置血清凝固 器内凝固。凝固器内温度至90°C时，放入分装试管，以摆放两层为宜。待凝固器内温度达 85 90°C，计时，凝固1 1. 后取出，放冷，无菌试验后放4°C冰箱备用，一个月内使用。
3.每孔加入不同浓度的以上细菌100 μ 1，每种细菌的每个浓度设9个复孔，同 时设一个不加细菌的阴性对照孔，37°C，孵育2个小时。弃掉孔中的液体，每孔加300 μ 1 PBST，洗4次，然后加入不同浓度的核酸适配子(100ηΜ，200ηΜ，400ηΜ)，由于每种细菌的 每个浓度设9个复孔，因此每种细菌的每个浓度的3个复孔加一个浓度的适配子，每孔 10(^1，371，孵育1个小时.弃掉孔中的液体，每孔加300 μ 1 PBST，洗4次，然后加入辣 根过氧化物酶标记的链霉亲和素，37°C，孵育半个小时。弃掉孔中的液体，每孔加300 μ 1 PBST,洗5次，然后加入底物TMB显色10分钟，然后用2M的H2SO4终止反应。在酶标仪上， 用450nm的滤光片读取OD值。实验数据见图1-2。检测结果说明本发明方法中本发明试剂盒检测结核杆菌标准 株H37Rv的结合OD值最高，0D450 > 0. 4，显著高于对其他细菌的结合，说明本发明试剂盒 有很高的特异性。图1说明本法能有效的鉴别出结核分枝杆菌与其他细菌和其他分支菌菌 株间的不同。图2说明本法能有效的鉴别出结核分枝杆菌与其他分支菌菌株间的不同。本发明中所用的底物显色剂配方A底物是TMB 20mg(固体)，先用无水乙醇 IOml溶解，充分振荡(试剂瓶要干净，干燥)，加双蒸水定容到IOOml，此即是A底物；B底 物是取1水柠檬酸2. lg，无水Na2HP042. 82g，0. 75%的过氧化氢0. 6細1，双蒸水定容至 100ml (无须调pH值，应在4. 5-5. 0范围)，此即是B底物。使用时，A底物与B底物各取5ml 混勻。实施例2:一种结核分枝杆菌的试剂盒检测结核分枝杆菌的方法，试剂盒检测的具体过程1.分别取不同结核病人的痰液，非结核病人和正常人的的痰液，用本试剂盒对结 核病人等样品进行检测，过程如下在96孔ELISA板中，每孔加入100 μ 1稀释的痰液(用生理盐水1 10稀释) 样品，同时设一个不加痰液的阴性对照孔，37°C，孵育2个小时。弃掉孔中的液体，每孔加 300 μ 1 PBST，洗4次，然后加入400ηΜ浓度的生物素标记的适配子，每孔ΙΟΟμ 1，37°C，孵育 1个小时.弃掉孔中的液体，每孔加300 μ 1 PBST，洗4次，然后加入辣根过氧化物酶标记的 链霉亲和素，370C，孵育半个小时。弃掉孔中的液体，每孔加300 μ 1 PBST,洗5次，然后加入 底物TMB显色10分钟，然后用2M的H2SO4终止反应。在酶标仪上，用450nm的滤光片读取 OD值。同时所有样品在武汉市医疗救治中心检验科分别进行抗酸染色、PPD和血清学抗体 的常规检测。比较本发明试剂盒检测与PPD(结果见表一)、血清学抗体(结果见表二)、抗 酸染色(结果见表三)的常规检测方法的相关性、敏感性和符合率。本发明中所用的底物TMB显色剂配方包括A底物是TMB 20mg (固体)，先用无水 乙醇IOml溶解，充分振荡(试剂瓶要干净，干燥)，加双蒸水定容到IOOml，此即是A底物； B底物是取1水柠檬酸2. lg，无水Na2HP042. 82g，0. 75%的过氧化氢0. 6細1，双蒸水定容 至100ml (无须调pH值，应在4. 5-5. 0范围)，此即是B底物。使用时，A底物与B底物各取 5ml混勻。表一本发明试剂盒与常规PPD检测间的比较血液样本由武汉市医疗救助中心提供，58份血液样本均为结核病人血清样本。在 适配子间接ELISA法中设定的临界值(cutoff值)为0.5。cutoff值=0.1 X阳性对照的 平均0D450值+阴性对照的平均0D450值。0D450 > 0. 5为阳性(+) ；0D450 < 0. 5为阴性㈠。
间接法(Cut off :0. 5)
PPD --total
+ - + 47 249
- 9 09
total 56 258敏感性:47/56= 83. 93% ；总符合率:47/58 = 81. 03%表二、本发明适配子与常规血清抗体(TBAb)检测间的比较，血液样本由武汉市医 疗救助中心提供，58份血液样本均为结核病人血清样本。在适配子间接ELISA法中设定的 临界值(cutoff值)为0. 5。cutoff值=0. 1 X阳性对照的平均0D450值+阴性对照的平 均 0D450 值。0D450 > 0. 5 为阳性(+) ；0D450 < 0. 5 为阴性(-)。
间接法(Cut off :0.5)
TBAb --total
+ - + 53 154
- 3 14
total 56 258敏感性53/56= 94. 64% ；特异性:1/2 = 50% ；总符合率:54/58 = 93. 10%表三、本发明试剂盒与抗酸染色检测方法间的比较本发明试剂盒即适配子间接ELISA试剂盒与抗酸染色检测间的比较，痰液样本由 武汉市医疗救助中心提供，84份痰液样本均为结核病人痰液样本。在适配子间接ELISA法 中设定的临界值(cutoff值)为0. 5。cutoff值=0. 1 X阳性对照的平均0D450值+阴性 对照的平均0D450值。0D450 > 0. 5为阳性(+) ；0D450 < 0. 5为阴性(-)。
间接法(Cut off :0. 5) 抗酸- total+12214
-521870
total642084敏感度:18. 75% ；特异性90% ；总符合率35. 71%SEQUENCE LISTING<110>武汉大学<120> 一种结核分枝杆菌的试剂盒及其检测方法
<130> 一种结核分枝杆菌的试剂盒及其检测方法<160>1<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>30<212>DNA<213>人工合成<400>1tttaatcaca caacaccgtg cttcaagctt30
权利要求
1.一种结核分枝杆菌的试剂盒，其特征是该试剂盒包括酶标板，生物素标记核酸适 配子，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素及其显色底物；所述的生物素标记核酸适配子NK2 将NK2序列合成，生物素标记NK2的5，端为 bio-NK2,并用无菌双蒸水稀释为400nM的浓度，_20°C保存。
2.一种结核分枝杆菌的试剂盒检测结核分枝杆菌的方法，其步骤是A、将待检样品，痰液或血液或体液或细菌1000CFU/mL/痰液加在96孔酶标板，100μ 1/ 孔，4度孵育过夜；B、含有5/10000 吐温-20 的 PBS, PBS 溶液=NaCl 8g, KCl 0. 2g, Na2HPO4L 44g, KH2PO4 0. 24g,加去离子水溶解，定容至1000ml，调pH至7. 4，15磅灭菌20min，置4°C保存，洗涤六 遍；CU% g/ml牛血清白蛋白PBS溶解，封闭96孔板，100 μ 1/孔，37度封闭1小时；D、用含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍；Ε、加入bio-NK2,400nM/孔，PBS稀释，37度孵育1小时;F、含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍；G、加入加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素1 1000，PBS稀释，100 μ 1/孔，37度孵 育1小时；H、含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍；J、加入底物显色剂，显色2分钟，用2Μ浓硫酸中止显色；KU小时内在多功能酶标仪450ηΜ下检测吸光度；所述的底物显色剂配方包括Α底物是TMB 20mg，先用无水乙醇IOml溶解，充分振荡， 加双蒸水定容到IOOml ；B底物是取1水柠檬酸2. lg，无水Na2HP04 2. 82g，0. 75%的过氧 化氢0. 6細1，双蒸水定容至100ml，A底物与B底物各取5ml混勻。
3.权利要求1所述的一种结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于所述的生物素标记核 酸适配子NK2，其序列为SEQIDN0. 1所示的核苷酸序列。
全文摘要
本发明公开了一种结核分枝杆菌的试剂盒及其检测方法。包括酶标孔板，生物素标记单链DNA适配子，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素及其显色底物。采用结核分枝杆菌H37Rv的生物素标记的单链DNA适配子为探针，采用类似间接ELISA法，用于检测结核分枝杆菌。将结核分枝杆菌或待检痰液或体液样品以及对照样品加入酶标孔板孵育，结合在板上的结核分枝杆菌再用生物素标记的单链DNA适配子捕获，洗涤后，加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，加入底物显色，显色终止后，在酶标仪450nm的吸收波长上测其OD值。本发明检测结核分枝杆菌，或痰、血液和体液中的结核分枝杆菌或菌体抗原，检测速度快，方便安全，省时效率高，价格低廉，检测灵敏度和精确度都很高，应用前景广阔。
文档编号G01N33/52GK102081091SQ20091027304
公开日2011年6月1日 申请日期2009年11月30日 优先权日2009年11月30日
发明者李莹滢, 章晓联 申请人:武汉大学