专利名称：用于生物传感器的新型Au/Ag核-壳复合材料的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于生物传感器的AuAg核-壳复合材料；更具体而言，涉及一种 其中受体的一端与Au纳米颗粒的表面结合使得受体的一部分嵌入細纳米颗粒层中并且受 体的目标材料识别位点暴露于Ag纳米颗粒层的外面的Au/Ag核-壳复合材料，以及其制备 方法。
背景技术：
从大约10年之前，有关使用金属纳米颗粒用于检测生物材料(脱氧核糖核酸 (DNA)、蛋白质等)的方法研究就已经取得进展，并且已开发出使用新的平台技术的生物传 感器。金(Au)纳米颗粒具有归因于特定的表面等离子共振(SPR)的物理、化学和光学性质。 这种性质主要用于生物分子的信号检测。使用Au纳米颗粒的方法提供了优于通过连结磷而形成阵列的技术的灵敏性，并 使得快速而容易的分析以及高的重现性成为可能。另外，Au纳米颗粒的数个优势在于，它 能够与其表面上的多种有机分子形成稳定的结合，并且即使在生物材料(寡核苷酸、蛋白 质等)能够维持固有结构的高生理盐分浓度下也可以维持稳定结合状态。因此，当使用Au 纳米颗粒的生物传感器利用寡核苷酸(DNA片段)或蛋白质作为受体时，寡核苷酸可以与具 有互补序列的目标DNA形成强的氢键，而蛋白质可以通过抗原-抗体反应与目标蛋白质形 成强键，使得能够检测特定的目标材料。但是，由于Au纳米颗粒的拉曼散射效应弱于银(Ag)纳米颗粒的拉曼散射效应，因 而Au纳米颗粒的表面增强拉曼散射(SERQ效应低。另一方面，Ag纳米颗粒的拉曼散射效应优异，但是在生物材料能够维持其固有结 构的高盐浓度和高温下的稳定性低。因此，已经进行了诸多努力以利用Au纳米颗粒的特性、Ag纳米颗粒的特性和生物 材料的特异性。结果是，已知如下方法能够以不同的方式组合Au纳米颗粒、Ag纳米颗粒 和DNA，并且通过利用Au纳米颗粒的特性、Ag纳米颗粒的特性以及DNA的互补氢键特性以 极低的检出限检测不同的DNA序列。特别地，通过利用Ag纳米颗粒强的光学特性的SERS 来检测DNA序列的方法是众所周知的且被广泛地使用。但是，为了 SERS，在目标寡核苷酸和用作为受体的寡核苷酸改性的Au纳米颗粒的 结合反应之后，Ag染是必须的。SERS通过该过程是可能的，但是可能出现非特异性染色。 在该情况下，假阳性反应出现，并且背景信号增强。同样，实现另外的Ag染。因此，已进行了研究以开发同时具有诸如Au纳米颗粒与生物材料的稳定结合以 及Ag纳米颗粒的优异光学特性之类的优点的生物传感器。通过这些研究，开发出Ag/Au核-壳复合材料(参见JACS，2001，123，7961-7962) 和Au-Ag合金纳米颗粒。但是，Au-^Vg合金纳米颗粒的稳定性低，这是因为在超过寡核苷酸杂交的高盐浓度 (0. 3M NaCl)下出现不可逆的团聚。
而且，在其中Ag纳米颗粒构成核而Au纳米颗粒构成壳的Ag/Au核-壳复合材料 的情况下，因为聚结生物材料附连到Au纳米颗粒壳上而形成更稳定的结合。因而，其适用 于比色测定。然而，由于Ag纳米颗粒存在于壳的内部，所以不能利用Ag纳米颗粒的光学特 性。J. Phys. Chem. C(2007,111,10806-10813)中报道了 Au/Ag 核-壳纳米材料。因 为Ag纳米颗粒构成壳，所以AuAg核-壳结构能够表现出SERS效应。已经报道了 Ag/Au 核-壳纳米材料几乎不能检测拉曼中的信号，而Au/Ag核-壳纳米材料能够检测拉曼中较 灵敏的信号。但是，为了应用到利用Au/Ag核-壳纳米材料的有用光学特性的生物传感器， 必需使作为受体的生物材料，例如寡核苷酸或蛋白质稳定地结合在构成壳的Ag纳米颗粒 的表面上。但是，在J. Phys. Chem. CQ007，111，10806-10813)中没有披露这样的方法。研究者已经致力于通过在Ag纳米颗粒的表面上强力地结合作为受体的生物材料 来改善稳定性。据报道，当寡核苷酸用作为受体的生物材料时，引入二巯基或四巯基代替单 巯基作为官能团的寡核苷酸序列结合到纯Ag纳米颗粒的表面上，从而改善形成上述结合 的細纳米颗粒的稳定性(Nucleic Acids Research 2002，30 (7)，1558-1562)。然而在此情 况下，由于没有使用可易于合成的与典型单巯基相结合的寡核苷酸，因而另外伴随着复杂 的寡核苷酸合成过程。因而，尽管Ag纳米颗粒的光学特性优异，但上述技术没有广泛地用 于纳米生物传感领域中。因此，存在对能够利用Ag纳米颗粒和Au纳米颗粒二者的优点并且能够维持作为 受体的生物材料的结合稳定性的生物传感器的需求。
发明内容
技术问题本发明的一个实施方案涉及提供一种Au/Ag核-壳复合材料、其制备方法以及使 用其的生物传感器。本发明的其他目的和优点可以通过以下描述加以理解，并且参照本发明的实施方 案变得显而易见。此外，对本发明领域的那些技术人员而言明显地是，本发明的目的和优点 可以通过所要求保护的方式及其组合来实现。技术方案根据本发明的一个方面，提供一种Au/Ag核-壳复合材料，其包括Au纳米颗粒、围 绕Au纳米颗粒的Ag纳米颗粒层，和具有与目标材料可结合或可反应的目标材料识别位点 的受体，其中所述受体的一端结合在Au纳米颗粒的表面上，使得受体的一部分嵌入細纳米 颗粒层，并且所述目标材料识别位点暴露于Ag纳米颗粒层的外面。根据本发明的另一方面，提供一种制备Au/Ag核-壳复合材料的方法，所述方法包 括在Au纳米颗粒的表面上结合受体的一端，所述受体具有与目标材料可结合或可反应的 目标材料识别位点；在所述Au纳米颗粒的表面上形成細纳米颗粒层，使得所述受体的一部 分嵌入^Vg纳米颗粒层中，并且所述受体的目标材料识别位点暴露于^Vg纳米颗粒层的外面。根据本发明的又一方面，提供一种通过使用Au/Ag核-壳复合材料来检测与受体 的目标材料识别位点相结合或反应的目标材料的生物传感器。根据本发明的还一方面，提供一种通过使用所述生物传感器来检测与受体的目标材料识别位点相结合或反应的目标材料的方法。有利效果根据本发明的实施方案，Au/Ag核-壳复合材料中的Au纳米颗粒和有机分子可以 稳定地结合在一起，并且所述Au/Ag核-壳复合材料可以表现出Ag纳米颗粒的优异光学特 性。因而，AuAg核-壳复合材料在高盐浓度、高温和长期储存的条件下表现出稳定的性能。 由于使用Au/Ag核-壳复合材料的生物传感器有效地进行目标生物材料的检测，因而Au/Ag 核-壳复合材料将被广泛地地用于生物材料的检测很重要的医学和药剂学领域。
图1为示出根据本发明实施例3的Au/Ag核-壳复合材料的示意图。图2为示出根据本发明实施例6的Au/Ag核-壳复合材料的示意图。图3为示出根据本发明实施例3的Au/Ag核-壳复合材料的制备方法的示意图。图4为示出根据本发明实施例6的Au/Ag核-壳复合材料的制备方法的示意图。图5示出根据本发明实施例3的Au/Ag核-壳复合材料的UV光谱。图6为根据本发明实施例3的AuAg核-壳复合材料的透射电子显微镜(TEM)图。图7为图6的放大图。图8示出根据本发明实施例3的EDX分析结果。图9示出根据本发明实施例4的Au/Ag核-壳复合材料的UV光谱。图10为根据本发明实施例4的Au/Ag核-壳复合材料的TEM图。图11示出根据本发明实施例6的Au/Ag核-壳复合材料的UV光谱。图12示出根据本发明实施例6的Au/Ag核-壳复合材料的TEM图。图13示出根据本发明实施例7的Au/Ag核-壳复合材料的消光随着AgNO3和对 苯二酚的量的变化。图14示出Au纳米颗粒和Ag纳米颗粒的简单混合物与实施例7的Au-Ag核-壳 复合材料的UV光谱。图15示出实施例8中稳定性试验的结果。图16示出包含在实施例9所用的Au/Ag核-壳复合材料中的寡核苷酸A和B，以 及具有互补碱基序列的目标寡核苷酸的碱基序列。图17示出实施例9中的比色测定结果。图18示出实施例9中熔点随时间的变化。图19禾Π 20为实施例10的TEM图。
具体实施例方式从以下参照附图描述的实施方案中，本发明的优点、特征以及方面将变得显而易 见，所述实施方案在下文中给出。根据本发明一个实施方案的Au/Ag核-壳复合材料包括Au纳米颗粒、围绕Au纳 米颗粒的Ag纳米颗粒层，和具有与目标材料可结合或可反应的目标材料识别位点的受体。 所述受体的一端与Au纳米颗粒的表面结合，并且所述受体的一部分嵌入細纳米颗粒层。所 述受体的目标材料识别位点暴露于Ag纳米颗粒层的外面。
Au纳米颗粒因其与有机分子的强亲合力可以与有机分子形成稳定结合，并且即使 在诸如DNA或蛋白质之类的生物大分子能够维持它们的固有结构的高生理盐分浓度下也 具有高的稳定性。因此，通过用Au纳米颗粒构成核-壳复合材料的核并且使受体结合在Au 纳米颗粒的表面上，即使在高盐浓度和高温下也表现出稳定的物理特性。因而，根据本发明 一个实施方案的Au/Ag核-壳复合材料可以应用于不同环境下的生物传感器。根据本发明的一个实施方案，Au纳米颗粒的尺寸可以为约Inm到约lOOOnm，具体 地为约Inm到约500nm，但并不限于此。而且，构成根据本发明的一个实施方案的Au/Ag核-壳复合材料的核的Au纳米颗 粒可以是一个纳米颗粒或者两个或更多个纳米颗粒的组合。根据本发明的一个实施方案，作为两个或更多个纳米颗粒的组合的Au纳米颗粒 可以利用寡核苷酸之间的互补氢键来形成。例如，如果分别与寡核苷酸(A)和寡核苷酸(B) (寡核苷酸(A)和寡核苷酸(B)能够与特定寡核苷酸(T)形成互补键)结合的两个Au纳米 颗粒，与特定寡核苷酸⑴相结合，则两个Au纳米颗粒可以形成二聚体。一种形成两个或更多个纳米颗粒的组合例如二聚体、三聚体等的方法，不限于利 用寡核苷酸之间的互补键，而是可以由本领域技术人员鉴于实验条件适当地进行选择。即使当Au纳米颗粒具有两个或更多个颗粒的组合时，Ag纳米颗粒层也可以形成 在各个颗粒上，如下文中所述。根据本发明的一个实施方案，Ag纳米颗粒层可以形成为围绕Au纳米颗粒。通过 形成Ag纳米颗粒层作为核-壳复合材料的壳，复合材料能够具有优异的光学特性。即，Ag 纳米颗粒层在Ag纳米颗粒之间具有称为热点或纳米结的接触点，并且SERS现象看来在这 些位置进一步加强。鉴于此，提供高的选择性和灵敏性，目标材料的多重检测可以使用多种 拉曼标记(Raman tags)。Ag纳米颗粒层可以如此之厚以致于覆盖一部分的受体并且使受体的目标材料识 别位点暴露于外面。具体而言，Ag纳米颗粒层的厚度可以根据间隔区和受体的种类而变。根据本发明的一个实施方案，受体可以包括与目标材料可结合或可反应的目标材 料识别位点。根据本发明的一个实施方案，受体与目标材料的结合或反应可以通过，但不限于， 共价键、氢键、抗原-抗体反应或静电引力来实现。受体的非限制性的实例可以是选自酶底物、配体、氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核酸、 寡核苷酸、脂质、辅助因子和碳水化合物的一种或更多种。根据本发明的一个实施方案，受体的一端结合在Au纳米颗粒的表面上，并且受体 的一部分嵌入Ag纳米颗粒中。目标材料识别位点暴露于Ag纳米颗粒层的外面。根据本发明的一个实施方案，受体可以包括间隔位点，在该位点处，其一端结合在 Au纳米颗粒的表面上，其另一端与目标材料识别位点相结合。当受体还包括间隔位点时，一端结合在Au纳米颗粒的表面上的间隔位点可以嵌 入Ag纳米颗粒层中，与间隔位点的另一端相结合的目标材料识别位点能够暴露于Ag纳米 颗粒层的外面。受体的间隔位点可以用来确保一段间隔，以使受体的与目标材料结合或反应的目 标材料识别位点不被Ag纳米颗粒层所覆盖。
受体的间隔位点的非限制性的实例包括由选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧 啶的一个碱基组成的碱基序列；聚乙二醇(PEG)；或所述碱基序列和聚乙二醇(PEG)的组
口 O由选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的一个碱基组成的碱基序列的碱基数， 或者聚乙二醇的长度不受限制，并且可以适当选择以使Ag纳米颗粒层能够形成在Au纳米 颗粒上，并且目标材料识别位点能够暴露于Ag纳米颗粒层的外面。根据本发明的一个实施方案，Au/Ag核-壳复合材料可以包括作为受体的DNA，所 述受体的间隔位点可以包括由选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的一个碱基组成的 碱基序列；聚乙二醇(PEG)；或者所述碱基序列和聚乙二醇的组合。Au/Ag核-壳复合材料还可以包括居间调节受体与Au纳米颗粒的结合的间隔分 子。其一端与Au纳米颗粒的表面相结合的间隔分子嵌入Ag纳米颗粒层中，并且与间 隔分子的另一端相结合的目标材料识别位点暴露于Ag纳米颗粒层的外面。与受体的上述间隔位点一样，所述间隔分子可以用来确保一段间隔，以使受体的 与目标材料结合或反应的目标材料识别位点不被Ag纳米颗粒层所覆盖。间隔分子的非限制性的实例包括选自蛋白质A、蛋白质G，和蛋白质A/G中的至少 一种。根据本发明的一个实施方案，受体可以是抗体或蛋白质，间隔分子可以是选自蛋 白质A、蛋白质G，和蛋白质A/G中的至少一种。在本发明的上述实施方案中，Au/Ag核-壳复合材料基本上具有Au/Ag核-壳结 构，一端结合在Au纳米颗粒的表面上的受体的一部分埋藏在Ag纳米颗粒层中，并且受体的 目标材料识别位点暴露于Ag纳米颗粒层的外面。根据本发明的一个实施方案，因为Au纳米颗粒与作为生物大分子的受体的稳定 结合，所以Au/Ag核-壳复合材料在用作生物传感器所需的高盐浓度和高温下可以表现出 稳定的物理性质，并且也可以通过利用Ag纳米颗粒层的光学性质而有效地使用信号放大 特性。因此，AuAg核-壳复合材料可以适用于以超高灵敏性检测多种生物材料并且可以 获得进一步定量的检测结果。根据本发明的一个实施方案，Au纳米颗粒的表面和受体、受体的间隔位点或者间 隔分子之间的结合可以通过共价键、静电引力等来形成。同样，根据本发明的一个实施方案，受体、受体的间隔位点或者间隔分子还可以包 括居间调节与Au纳米颗粒的结合的官能团。所述官能团的实例可以是选自胺基、羧基、巯基和磷酸酯基的一种或更多种。同时，根据本发明一个实施方案的一种制备AuAg核-壳复合材料的方法包括使 受体的一端结合在Au纳米颗粒的表面上，所述受体具有与目标材料可结合或可反应的目 标材料识别位点；并且在所述Au纳米颗粒的表面上形成^Vg纳米颗粒层，使得所述受体的一 部分嵌入Ag纳米颗粒层中，并且所述受体的目标材料识别位点暴露于Ag纳米颗粒层的外 面。根据本发明的一个实施方案，可以在添加或不添加表面稳定剂的情况下使用Au 纳米颗粒。此外，可以以分散在有机溶剂中或水溶液中的状态使用Au纳米颗粒。优选地，以分散在水溶液中的状态使用Au纳米颗粒。根据本发明的一个实施方案，Au纳米颗粒因其与有机分子的强亲合力可以与有机 分子形成稳定结合。例如，具有与目标材料可结合或可反应的目标材料识别位点的受体的 一端可以通过共价键或静电弓I力而结合在Au纳米颗粒的表面上。根据本发明的一个实施方案，在与受体结合的Au纳米颗粒的表面上形成Ag纳米 颗粒层可以通过Ag离子还原反应来进行。S卩，将Ag离子(Ag+)源和还原剂加入到与受体 结合的Au纳米颗粒的溶液中并且反应以在Au纳米颗粒的表面上形成Ag纳米颗粒层。在还原反应中，与受体结合的Au纳米颗粒的溶液浓度可以为约0. InM到约ΙΟΟηΜ， 具体为1. OnM到IOnM0在还原反应中可用的Ag离子(Ag+)源可以为Ag盐，具体为水溶性Ag盐，更具体 地为 iVgN03。此外，还原剂可以为对苯二酚、抗坏血酸盐、柠檬酸盐或者金属硼氢化物例如硼氢 化钠。优选地，还原剂为对苯二酚。在^Vg离子还原反应中可用的反应溶剂可以为有机溶剂、水性溶剂或其混合物。优 选地，反应溶剂为水性溶剂。此外，Ag离子还原反应中的反应温度可以为约-20°C到约100°C。优选地，反应温 度为约15°C到约35°C。如果反应温度低于_20°C，则Ag纳米颗粒可能团聚。如果反应温度 超过100°C，则诸如DNA或蛋白质之类的受体可能受损。在还原反应中，可以通过调节Ag离子(Ag+)源和还原剂的量来控制Ag纳米颗粒 层的厚度。因此，如上所述，受体的一部分嵌入Ag纳米颗粒层中，并且受体的目标材料识别 位点暴露于Ag纳米颗粒层的外面。以这种方式，Ag纳米颗粒层在Au纳米颗粒的表面上形 成达到适当的厚度。Ag离子(Ag+)源和还原剂的浓度可以根据具体的实验条件OVg纳米颗粒层的厚度 等)进行充分选择，例如，它们可以是约0. 00001M到约10M，但并不限于此。如果超出以上 范围，则Ag纳米颗粒层的厚度可能非特定性地增加。如果小于以上范围，则不能适当地形 成Ag纳米颗粒层。根据本发明的一个实施方案，可以优选通过温和的反应，例如隔绝光下的温和涡 流来实施Ag纳米颗粒层的形成，以不影响与Au纳米颗粒结合的受体的稳定性。根据本发明的另一个实施方案，所述制备Au/Ag核-壳复合材料的方法还可以包 括使间隔位点与受体的目标材料识别位点接触。根据该方法，受体的间隔位点的一端结合 在Au纳米颗粒的表面上。通过在Au纳米颗粒的表面上形成Ag纳米颗粒层，受体的间隔位 点嵌入Ag纳米颗粒层中并且受体的目标材料识别位点暴露于Ag纳米颗粒层的外面。以这 种方式，制得AuAg核-壳结构。根据本发明的又一个实施方案，所述制备Au/Ag核-壳复合材料的方法还可以包 括使间隔分子与Au纳米颗粒的表面连结。间隔分子居间调节Au纳米颗粒的表面与受体之 间的结合。根据该方法，间隔分子与Au纳米颗粒的表面连结，并且受体与间隔分子结合。通 过在Au纳米颗粒的表面上形成Ag纳米颗粒层，间隔分子嵌入Ag纳米颗粒层中并且受体的 目标材料识别位点暴露于Ag纳米颗粒层的外面。以这种方式，制得Au/Ag核-壳结构。根据本发明的一个实施方案，可以通过官能团的居间调节实现受体、受体的间隔位点或者间隔分子在Au纳米颗粒的表面上的结合。官能团的实例可以是选自胺基、羧基、巯基和磷酸酯基中的一种或更多种。同时，本发明的一个实施方案涉及一种生物传感器，其通过使用根据本发明实施 方案的上述Au/Ag核-壳复合材料来检测与受体的目标材料识别位点相结合或反应的目标 材料。由于使用Au/Ag核-壳复合材料，根据本发明实施方案的生物传感器具有在高盐 浓度和高温下的稳定性、优异的光学特性以及针对目标材料的特异结合特性。因而，所述生 物传感器能够以高效率和高灵敏性针对目标材料例如多种生物材料进行多重检测。同时，本发明的一个实施方案涉及一种通过使用根据本发明的一个实施方案的上 述生物传感器来检测与受体的目标材料识别位点相结合或反应的目标材料的方法。可以通过选自比色测定法、UV光谱法、拉曼光谱法、光学显微镜法、电敏感法和扫 描检测(scanometric)法的一种或更多种方法进行所述检测。根据本发明的一个实施方案，目标材料是与生物传感器的受体的目标材料识别位 点可结合或可反应的材料。优选地，目标材料为生物材料。更优选地，目标材料为酶、蛋白 质、核酸、寡核苷酸、低聚糖、肽、氨基酸、碳水化合物、脂质、细胞、癌细胞、癌干细胞、抗原、 适配体或者其他生物衍生材料。根据本发明的一个方面，当DNA或寡核苷酸用作受体时，目标材料与受体的目标 材料识别位点之间的结合可以通过互补氢键来形成。当蛋白质用作受体时，目标材料与受 体的目标材料识别位点之间的结合可以通过抗原-抗体反应来形成。使用根据本发明实施方案的AuAg核-壳复合材料的生物传感器可以灵敏而特异 性地检测期望的特定目标材料。实施例下文中，将参照附图详细地描述本发明的具体实施例。以下实施例仅仅是示例性 的，并且本发明不限于它们。本文所用的Au纳米颗粒购自Ted pel la (Redding，CA，USA)，作为Ag离子(Ag+)源 的AgNO3溶液和作为还原剂的对苯二酚溶液购自BBIinternational (Cardiff，UK)。与巯基 结合的寡核苷酸购自IDT(C0ralville，IA，USA)并且巯基是去保护的。此外，蛋白质A和抗 体购自piercenet. com (USA)。实验中所用的H2O为纳米纯水。实施例1 寡核苷酸的制备将从IDT购买的3'-烷基硫醇改性的寡核苷酸，3' -HO-(CH2)3-S-S-(CH2)3-Altl-P EG18-CTCCCTAATAACAAT-5'加入到0. IM的二硫苏糖醇中，并且通过将其置于室温下2小时 进行去保护反应。通过使经去保护的溶液通过NAP-5柱(S^hadex G-25介质，DNA级)的同时对其 进行纯化，制备寡核苷酸 A (3 ‘ -HS- (CH2) 3-A10-PEG18-CTCCCTAATAACAAT-5 ‘)。将溶解在蒸馏水中的AgNO3 (50mM)加到5 ‘-烷基硫醇改性的寡核苷酸(5 ‘ -HO -(CH2) 3-S-S- (CH2) 6-PEG18-ACTCTTATCAATATT-3 ‘)中并放置 20 分钟，通过添加二硫苏糖醇 (10mg/ml)5分钟来去除产生的沉淀。通过使上清液通过NAP-5柱(S^hadex G-25媒介，DNA级)的同时对其进行纯化， 制备寡核苷酸 B (5 ‘ -HS- (CH2) 6-A10-PEG18-ACTCTTATCAATATT-3 ‘)。
使用紫外-可见分光计测量消光，量化溶液内寡核苷酸的量。^MM 2 -MM^m (^) Au纳米颗粒的表面h的结合向1毫升直径为15nm的Au纳米颗粒的3. SnM溶液中添加通过实施例1的程序去 保护且与巯基和间隔位点结合的寡核苷酸，并且通过在室温下摇动12小时以上进行混合。调节溶液的组成，使得磷酸盐的浓度变为9mM以及十二烷基磺酸钠的浓度变为约 0.1%。在另外搅拌30分钟之后，最终盐浓度调节为0. 3MNaCl。在放置12小时以上之后，对溶液离心并倒掉上清液。然后，加入1毫升0. 3M的磷 酸盐溶液(IOmM PB, 0. 3M NaCl) 0重复这些步骤两次。以这种方式，寡核苷酸结合在Au纳米颗粒的表面上。^MM 3 与寡核苷酸结合的Au/Ag核-売复合材料的制各(1)利用由紫外-可见分光计测量的消光，计算实施例2中合成的与寡核苷酸结合的 Au纳米颗粒的溶液浓度。根据该结果对溶液进行浓缩或稀释，将溶液的浓度调节到InM。向250 μ 1溶液中，依次加入用蒸馏水稀释10倍的AgNO3溶液(稀释前12 μ 1)和 用蒸馏水稀释10倍的对苯二酚溶液(稀释前12 μ 1)，然后搅拌30分钟。其后，通过紫外-可见分光计测量溶液的消光。将溶液在室温下放置直至消光没 有变化之后，离心去除上清液并且用蒸馏水稀释。然后，再次对溶液离心以去除上清液，并 且用250 μ 1的蒸馏水稀释。以这种方式，就制得根据本发明的一个实施方案的与寡核苷酸结合的Au/Ag 核-壳复合材料。图1为示出Au/Ag核-壳复合材料的示意图，图3为示出该Au/Ag核-壳复合材 料的制备方法的示意图。图5示出通过紫外-可见分光计测量的溶液的消光随着时间的变化。从图5中可 见，在反应约30分钟之后，消光没有实质上的改变。此外，利用透射电子显微镜(TEM)确认所制得的AuAg核-壳复合材料的形状和 尺寸(参照图6和图7)。实施例3的AuAg核-壳复合材料为球形，尺寸为约16nm到约 17nm,而Ag纳米颗粒层的厚度为约1. 5nm。而且，通过利用能量散布X-射线微量分析法对溶液进行分析，确认Au纳米颗粒与 Ag纳米颗粒在所制得的Au/Ag核-壳复合材料中的组成比。根据图8的EDX分析，银(Ag)原子和金(Au)原子在Au/Ag核-壳复合材料中分 别为25%和75%。该结果与图6和图7的TEM分析结果相同。^MM 4Au/AR m - 合材料的泡丨备(2)利用由紫外-可见分光计测量的消光，计算实施例2中合成的与寡核苷酸结合的 Au纳米颗粒的溶液浓度。根据该结果对溶液进行浓缩或稀释，将溶液的浓度调节到InM。向250 μ 1溶液中，依次加入用蒸馏水稀释10倍的AgNO3溶液(稀释前M μ 1)和 用蒸馏水稀释10倍的对苯二酚溶液(稀释前μ μ υ，然后搅拌30分钟。其后，通过紫外-可见分光计测量溶液的消光。在溶液置于室温下直至消光没有 变化之后，离心去除上清液并且用蒸馏水稀释。然后，再次对溶液离心以去除上清液，并且 用250 μ 1的蒸馏水稀释。以这种方式，制得根据本发明的一个实施方案的与寡核苷酸结合的Au/Ag核-壳复合材料。图9示出由紫外-可见分光计测量的溶液消光随时间的变化。从图9中可见，在 反应约30分钟之后，消光没有实质上的改变。此外，利用TEM确认所制得的AuAg核-壳复合材料的形状和尺寸，结果示于图10 中。在图10的左上侧所示的图像为复合材料的放大图。作为TEM分析的结果，实施例4的Au/Ag核-壳复合材料为球形，尺寸为约20nm 到约22歷，并且Ag纳米颗粒层的厚度为约5nm到约7nm。棚列5:胃_八(丨、_好)㈤秘(剩本)m^mmmm卜滅合将溶有约10 μ g蛋白质A的溶液加到1毫升的直径为15nm的Au纳米颗粒的3. 8nM 溶液中并且通过在室温下在磷酸盐缓冲溶液(PH 4 10)中摇动1小时进行混合。将购自 piercenet. com的约10 μ g抗体(蛋白质受体)加入到溶液中并且通过在室温下摇动1 5小时进行混合。在加入表面活性剂例如BSA或SDS并且另外放置溶液12小时以上之后， 对溶液离心以去除上清液。以这种方式，去除没有与结合在Au纳米颗粒的表面上的蛋白质 A结合的抗体。通过添加1毫升的0. 15M磷酸盐(IOmM PB, 0. 15M NaCl)而对溶液进行稀释 的程序实施两次。以这种方式，蛋白质A结合在Au纳米颗粒的表面上，并且抗体与蛋白质A相结合。^MM 6 与蛋白质A和杭体结合的Au/Ag核-売复合材料的制各利用由紫外-可见分光计测量的消光，计算实施例5中合成的Au纳米颗粒的溶液 浓度，在所述Au纳米颗粒的溶液中，蛋白质A结合在其表面上且抗体与蛋白质A相结合。根 据该结果对溶液进行浓缩或稀释，将溶液的浓度调节到InM。向250 μ 1所述溶液中，依次加入用蒸馏水稀释10倍的AgNO3溶液(稀释前12μ 1) 和用蒸馏水稀释10倍的对苯二酚溶液(稀释前12 μ 1)，然后搅拌30分钟。其后，通过紫外-可见分光计测量溶液的消光。将溶液在室温下放置直至消光没 有变化之后，离心去除上清液并且用蒸馏水稀释。然后，再次对溶液离心以去除上清液，并 且用250 μ 1的蒸馏水稀释。以这种方式，制得根据本发明的实施方案的与抗体结合的Au/Ag核-壳复合材料。图2为示出Au/Ag核-壳复合材料的示意图，而图4为示出该Au/Ag核-壳复合 材料的制备方法的示意图。图11示出由紫外-可见分光计测量的溶液的消光随着时间的变化。从图11中可 见，在反应约30分钟之后，消光没有实质上的变化。此外，利用TEM确认所制得的Au/Ag核-壳复合材料的形状和尺寸，结果示于图 12中。作为TEM分析的结果，所制得的Au/Ag核-壳复合材料为球形，尺寸为约16nm到约 17nm,并且Ag纳米颗粒层的厚度为约1. 5nm。此外，根据EDX分析，银(Ag)原子和金(Au)原子在Au/Ag核-壳复合材料中分别 为25%和75%。该结果和实施例3的与寡核苷酸结合的Au/Ag核-壳复合材料的结果相 同(参见图8)。实施例7 以上实施例的AuZAg核-壳复合材料与纯Au纳米颗粒和Au纳米颗粒 混合物的对比为确认实施例3的Au/Ag核-壳复合材料的结构，将实施例3的Au/Ag核-壳复合材料的UV消光与尺寸为15nm的纯Au纳米颗粒和尺寸为15nm的纯Ag纳米颗粒的简单 混合物的UV消光进行对比。测量Au/Ag核-壳复合材料的UV消光并且示于图13中，所述Au/Ag核-壳复合 材料是按照实施例3制备的，区别在于通过如下表1所示调节AgNO3和对苯二酚的量来改 变Ag纳米颗粒层的厚度。表1示出Au/Ag核-壳复合材料的UV消光随着AgNO3和对苯二 酚的量的变化。表 1[表1]
权利要求
1.一种Au/Ag核-壳复合材料，包括 Au纳米颗粒；围绕Au纳米颗粒的Ag纳米颗粒层；和 具有与目标材料可结合或可反应的目标材料识别位点的受体， 其中所述受体的一端结合在所述Au纳米颗粒的表面上，使得所述受体的一部分嵌入 所述Ag纳米颗粒层中，并且所述目标材料识别位点暴露于所述Ag纳米颗粒层的外面。
2.根据权利要求1的AuAg核-壳复合材料，其中所述受体还包括间隔位点，所述间隔 位点的一端与所述Au纳米颗粒的表面结合，所述间隔位点的另一端结合在所述目标材料 识别位点上。
3.根据权利要求1的AuAg核-壳复合材料，还包括居间调节所述受体和所述Au纳米 颗粒之间的结合的间隔分子。
4.根据权利要求1到3中任一项的AuAg核-壳复合材料，其中所述受体包含选自酶 底物、配体、氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核酸、寡核苷酸、脂质、辅助因子和碳水化合物的一种 或更多种。
5.根据权利要求2的Au/Ag核-壳复合材料，其中所述间隔位点包括 由选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的一个碱基组成的碱基序列； 聚乙二醇(PEG)；或所述碱基序列和所述聚乙二醇(PEG)的组合。
6.根据权利要求2的Au/Ag核-壳复合材料，其中所述受体包括脱氧核糖核酸(DNA)，以及所述间隔位点包括由选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的一个碱基组成的碱基序列； 聚乙二醇(PEG)；或所述碱基序列和所述聚乙二醇(PEG)的组合。
7.根据权利要求3的AuAg核-壳复合材料，其中所述间隔分子包括选自蛋白质A、蛋 白质G和蛋白质A/G的一种或更多种。
8.根据权利要求3的AuAg核-壳复合材料，其中所述受体包括抗体或蛋白质，所述间 隔分子包括选自蛋白质A、蛋白质G和蛋白质A/G的一种或更多种。
9.根据权利要求1到3中任一项的Au/Ag核-壳复合材料，其中所述受体、所述受体的 间隔位点或者所述间隔分子还包括居间调节与所述Au纳米颗粒的结合的官能团。
10.根据权利要求9的Au/Ag核-壳复合材料，其中所述官能团包括选自胺基、羧基、巯 基和磷酸酯基的一种或更多种。
11.根据权利要求1到3中任一项的Au/Ag核-壳复合材料，其中所述Au纳米颗粒包 括一个纳米颗粒，或者两个或更多个纳米颗粒的组合。
12.—种制备Au/Ag核-壳复合材料的方法，所述方法包括使受体的一端结合在Au纳米颗粒的表面上，所述受体具有与目标材料可结合或可反 应的目标材料识别位点；在所述Au纳米颗粒的表面上形成Ag纳米颗粒层，使得所述受体的一部分嵌入所述Ag 纳米颗粒层中，并且所述受体的目标材料识别位点暴露于所述Ag纳米颗粒层的外面。
13.权利要求12的方法，还包括在使所述受体的一端结合在Au纳米颗粒的表面上之 前，使间隔位点连接到所述受体的目标材料识别位点，其中使所述受体的一端结合是通过使所述受体的间隔位点的一端结合在所述Au纳米 颗粒的表面上进行的，以及所述形成Au纳米颗粒层包括在所述Au纳米颗粒的表面上形成Ag纳米颗粒层，使得所 述受体的间隔位点嵌入所述Ag纳米颗粒层中，并且所述受体的目标材料识别位点暴露于 所述Ag纳米颗粒层的外面。
14.根据权利要求12的方法，还包括在使所述受体的一端结合在Au纳米颗粒的表面上 之前，使间隔分子与所述Au纳米颗粒的表面连结，其中使所述受体的一端结合是通过使连结至所述Au纳米颗粒的表面的所述间隔分子 和所述受体结合进行的，以及所述形成Au纳米颗粒层包括在所述Au纳米颗粒的表面上形成Au纳米颗粒层，使得所 述间隔分子嵌入所述Ag纳米颗粒层中，并且所述受体的目标材料识别位点暴露于所述Ag 纳米颗粒层的外面。
15.根据权利要求12到14中任一项的方法，其中使所述受体、所述受体的间隔位点或 者所述间隔分子结合在所述Au纳米颗粒的表面上是通过官能团的居间调节进行的。
16.一种生物传感器，所述生物传感器通过使用权利要求1到3中任一项的Au/Ag 核-壳复合材料来检测待与受体的目标材料识别位点结合或反应的目标材料。
17.—种通过使用权利要求16的生物传感器来检测待与受体的目标材料识别位点结 合或反应的目标材料的方法。
18.根据权利要求17的方法，其中所述检测是通过使用选自比色测定法、UV光谱法、拉 曼光谱法、光学显微镜法、电敏感法和扫描检测法的一种或更多种方法进行的。
全文摘要
根据本发明的一个方面，提供一种Au/Ag核-壳复合材料，其包括Au纳米颗粒、围绕Au纳米颗粒的Ag纳米颗粒层，以及具有与目标材料可结合或可反应的目标材料识别位点的受体，其中所述受体的一端结合在Au纳米颗粒的表面上，使得受体的一部分嵌入Ag纳米颗粒层中，并且所述目标材料识别位点暴露于Ag纳米颗粒层的外面。Au/Ag核-壳复合材料可以提供Au纳米颗粒和有机分子之间的稳定结合，以及Ag纳米颗粒的优异光学特性。因而，使用根据本发明的一个方面的复合材料的生物传感器能够有效和高效地检测目标生物材料并且广泛地用于医学和制药学中。
文档编号G01N21/65GK102066941SQ200980122818
公开日2011年5月18日 申请日期2009年5月7日 优先权日2008年5月7日
发明者南左闷, 林东权, 金认情 申请人:首尔大学校产学协力财团