一种近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的制备方法
【专利摘要】一种近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的制备方法。本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的制备方法。本发明是为了解决诊疗试剂不能够在时间、空间和剂量上的可控制释放的问题。方法：一、合成上转换纳米粒子内核；二、合成包覆外壳的上转换纳米粒子；三、在上转换纳米粒子外层包覆介孔二氧化硅；四、核壳结构纳米粒子外表面修饰氨基；五、去除表面活性剂形成介孔；六、在核壳结构纳米粒子外表面修饰客体分子；七、负载盐酸阿霉素及孔道封堵。本发明用于癌症治疗中，实现抗癌药物在肿瘤组织定时和定量的可控释放。
【专利说明】
一种近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的制备方法
技术领域
[0001]本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的制备方法。
【背景技术】
[0002]随着纳米医学的快速发展，设计与构建智能响应型纳米分子阀癌症治疗平台，将抗癌药物无泄漏地输送到癌组织，在病灶部位富集并可控释放，已成为纳米医药科学重要发展方向。目前，用来打开分子阀的外界刺激智能响应方式主要有:PH、氧化还原、酶、光、热等几种。其中pH、氧化还原、酶响应为体内控释，响应灵敏度差，难以精确调控。光响应体系因具有体外控释、响应灵敏性高、并可通过光波长、功率及光照时间精确调控等特点而备受青睐。但可见光和紫外光因其穿透力弱及对细胞组织可能造成损伤等因素，在实际应用中受到限制。
[0003]近红外光(波长700?900nm)因为具有较深的生物组织穿透能力及极低的的生物光照损伤，特别适合构建光响应型药物控释体系。稀土掺杂上转换发光纳米粒子，能在近红外光的激发下，产生多波段紫外/可见/近红外区域的发射，(其中某一波段光用于成像，其它波段光用于治疗)，因此在纳米医药科学光化学反应中发挥了重要角色。目前基于上转换纳米材料/介孔二氧化娃核-壳结构设计药物控释平台是癌症纳米治疗技术的一个新研究热点，它以上转换纳米粒子为核，外层包覆介孔二氧化硅为壳的核壳结构，介孔内部用于装载药物。在近红外光的照射下，被细胞吞噬的上转换纳米粒子吸收生物穿透力强能量低的近红外光并上转换为能量高的紫外光诱导激发各种光化学反应，从而达到癌症治疗的目的。基于上转换纳米材料/介孔二氧化娃核-壳结构近红外光响应的药物控释优点在于:实现了光的深层组织穿透光控激发，避免了紫外光直接照射穿透深度浅，对生物组织伤害大的缺点。
[0004]智能响应型纳米分子阀癌症诊疗平台的核心关键技术在于药物控释阀门开关的设计。大环分子主体由于可以与某些客体分子组装成具有更大体积的超分子“主体-客体”络合物，封堵介孔二氧化硅孔道(直径2?4nm)，因此可作为智能响应型药物控释体系的超分子阀门。这些阀门在介孔二氧化硅载药平台实施药物控释的机制主要有两种:1、利用PH、酶、谷胱甘肽等作用导致连接主体或客体与硅球之间的化学键断裂，堵口络合物离去，阀门打开;2、利用热，pH和竞争试剂或光响应分离主客体，络合物解离，纳米阀门打开。
[0005]其中光响应的络合物解离分子阀门由于是外部刺激响应，适应各种环境，具有较大优势与潜能。但一方面目前对这种控释方式的研究相对较少，另一方面少量文献报导大多基于紫外或可见光诱导偶氮苯分子的异构化来实现。紫外或可见光由于生物组织穿透性问题应用受到严重制约。
【发明内容】
[0006]本发明是为了解决诊疗试剂不能够在时间、空间和剂量上的可控制释放的问题，而提供了一种近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的制备方法。
[0007]—种近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的制备方法具体是按以下步骤进行的:
[0008]一、合成上转换纳米粒子内核:将NaYF4:Yb/Tm上转换纳米粒子分散于环己烷中，得到上转换纳米粒子内核；
[0009]二、合成包覆外壳的上转换纳米粒子:向六水合氯化乾中加入油酸、十八稀和步骤一得到的上转换纳米粒子内核，得到反应体系，在氩气保护和搅拌的条件下将反应体系的温度从室温升温至160°C，并在氩气保护和温度为160°C的条件下搅拌1.5h，然后将温度从160°C自然冷却至50°C，再加入混合液A，然后在氩气保护和温度为50°C的条件下搅拌0.5h，再将温度从50 V升温至80 V，并在氩气保护和温度为80 V的条件下保持30min，然后将反应体系的温度在20min内从80°C升温至300°C，并在氩气保护和温度为300°C的条件下磁力搅拌1.5h，反应结束后，将反应体系自然冷却至室温，采用乙醇作为溶剂进行离心分离得到固体，将固体采用甲醇清洗3?5次，得到包覆外壳的氟化钇钠纳米粒子，然后将包覆外壳的氟化钇钠纳米粒子分散于环己烷中，得到核壳结构的氟化钇钠纳米粒子分散液;所述六水合氯化乾的质量与油酸的体积比为Img:(0.03?0.04)mL;所述六水合氯化乾的质量与十八稀的体积比为Img:(0.09?0.1 )mL;所述六水合氯化乾与步骤一得到的上转换纳米粒子内核中NaYF4:Yb/Tm上转换纳米粒子的摩尔比为1: (I?3);所述混合液A是将氟化铵和氢氧化钠溶解在甲醇中，其中氟化铵的质量与甲醇的体积比为Img: (0.06?0.07)mL，氢氧化钠的质量与甲醇的体积比为Img: (8?12)mL;所述六水合氯化钇与混合液A中氟化铵的摩尔比为1:4；
[0010]三、在上转换纳米粒子外层包覆介孔二氧化硅:将十六烷基三甲基溴化铵加入到水中配成溶液，将溶液与步骤二得到的核壳结构的氟化钇钠纳米粒子分散液混合后在室温下搅拌2h后超声0.5h，得到超声溶液，在温度为80°C的条件下加热至待超声溶液透明后采用氢氧化钠溶液调整超声溶液的PH为8?10，得到调整pH后的超声溶液，然后采用蠕动栗以0.5mL/h的速度向调整pH后的超声溶液中加入浓度为20%的四乙氧基硅烷乙醇溶液后，在温度为35°C的条件下反应24h后，通过离心分离得到固体，将固体采用乙醇清洗3?5次，然后在真空干燥箱内真空干燥24h，得到核壳结构纳米粒子;步骤三中所述的十六烷基三甲基溴化钱的质量与水的体积比为Img: 0.04mL;步骤三中所述的十六烧基三甲基溴化钱的质量与核壳结构的氟化乾钠纳米粒子分散液的体积比为Img: (0.001?0.005)mL；
[0011]四、核壳结构纳米粒子外表面修饰氨基:将核壳结构纳米粒子加入到无水甲苯中超声分散后再加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，得到反应液，将反应液在氮气保护的条件下加热回流24h后，通过离心分离得到固体，将固体采用甲醇清洗3?5次，然后在真空干燥箱内真空干燥24h，得到表面氨基修饰的未除去表面活性剂的核壳结构纳米粒子;步骤四中所述的核壳结构纳米粒子的质量与无水甲苯的体积比为Img: 0.1mL;步骤四中所述的核壳结构纳米粒子的质量与3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为Img:(0.0004?0.0008)mL；
[0012]五、去除表面活性剂形成介孔:将表面氨基修饰的未除去表面活性剂的核壳结构纳米粒子分散在甲醇溶液中，然后加入浓盐酸，在温度为700C的条件下搅拌24h后，通过离心分离得到固体，将固体采用甲醇清洗3?5次，然后在真空干燥箱内真空干燥24h，得到外表面修饰氨基的核壳结构纳米粒子;步骤五中所述的表面氨基修饰的未除去表面活性剂的核壳结构纳米粒子的质量与甲醇溶液的体积比为Img: 0.1mL;步骤五中所述的表面氨基修饰的未除去表面活性剂的核壳结构纳米粒子的质量与浓盐酸的体积比为I m g:(0.0 O O O 5?0.0002)mL；
[0013]六、在核壳结构纳米粒子外表面修饰客体分子:将外表面修饰氨基的核壳结构纳米粒子加入到二氯甲烷中超声分散后，依次加入I，2-萘醌-2-二叠氮-5-磺酰氯和三乙胺，在室温下搅拌24h后，通过离心分离得到固体，将固体采用甲醇清洗3?5次，然后在真空干燥箱内真空干燥24h，得到修饰客体分子的核壳结构纳米粒子;步骤六中所述的外表面修饰氨基的核壳结构纳米粒子的质量与二氯甲烧的体积比为I m g: 0.1 m L;步骤六中所述的外表面修饰氨基的核壳结构纳米粒子与1,2-萘醌-2-二叠氮-5-磺酰氯的质量比为1: (0.5?0.7);步骤六中所述的外表面修饰氨基的核壳结构纳米粒子的质量与三乙胺的体积比为Img:(0.001?0.005)mL;
[0014]七、负载盐酸阿霉素及孔道封堵:将修饰客体分子的核壳结构纳米粒子加入到盐酸阿霉素水溶液中超声分散，然后在室温下搅拌24h，再向其中加入β-环糊精后持续在室温下搅拌60h，反应结束后离心分离，固体物采用pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液清洗3?5次，然后在真空干燥箱内真空干燥24h，得到近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体;步骤七中所述的修饰客体分子的核壳结构纳米粒子的质量与盐酸阿霉素水溶液的体积比为Img: (0.12?0.15)mL;步骤七中所述的修饰客体分子的核壳结构纳米粒子与β-环糊精的质量比为1: (40?60)。
[0015]本发明制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的应用是将近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体用于体外近红外光控制药物释放研究中，具体使用方法如下:称量2.0mg载药的核壳结构药物载体，放置到比色皿的底脚处，缓慢加入2mL磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)，保证纳米粒子在角落集中静止，之后用激光对准粒子照射60min，每隔1min利用紫外可见光谱仪监测药物盐酸阿霉素的浓度。
[0016]称量2.0mg载药的核壳结构药物载体，放置到比色皿的底脚处，缓慢加入2mL磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)，保证纳米粒子在角落集中静止，之后用激光对准粒子以1min为周期进行间歇照射释药，紫外可见光谱仪监测药物盐酸阿霉素的浓度。
[0017]工作原理:
[0018]本发明利用核壳结构的上转换纳米粒子/介孔二氧化硅作为药物控释平台，二氧化硅介孔孔道用于负载抗癌药物，介孔口处修饰近红外光响应超分子阀门，利用生物穿透能力强的近红外光操控分子阀门，实现对药物的光控释。光控机理为:主体环糊精(大环分子)疏水内腔与疏水客体分子(D N Q)通过疏水作用形成络合物实现对介孔口的封堵；在980nm近红外光作用下，上转换纳米材料核将近红外光转变为紫外光及近红外光，诱导超分子阀门中DNQ的光化学重排反应，生成亲水产物茚羧酸，导致客体疏水性变为亲水性，主客体原来基于疏水的络合作用被破坏，主体分子环糊精离去，开关打开，从而达到光控药物释放的目的。另外，近红外光具有生物体穿透能力强、对细胞损伤小，可以体外实施精确控释等优点，利用近红外光源结合上转换材料实现智能响应最佳方案之一。
[0019]本发明的有益效果:
[0020]1、本发明设计与构建了基于上转换纳米粒子/介孔二氧化娃核-壳结构的近红外光激发超分子阀门光控释药平台。目前，近红外光激发下，充分利用上转换材料多发射荧光带激发超分子阀门实现远程控制药物释放的文献未见报道。
[0021]2、超分子阀门的打开首次基于近红外光诱导客体的重排反应，利用客体水溶性的突变破坏络合作用使主体离去，这一过程避免了载药平台与刺激源的直接接触。
[0022]3、利用近红外光具有的穿透深、低毒性的特点，结合上转换纳米粒子搭建具有近红外响应的药物控释平台，实现定时、定位的光控药物释放，其精度高，操作简单。文献报导应用于癌症诊疗平台的理想粒子直径应在10nm以下，以避免粒子随血液体内循环时堵塞毛细血管。本平台设计制备的上转换纳米粒子/介孔二氧化娃核-壳纳米粒子直径约70nm。
【附图说明】
[0023]图1为实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的透射电镜图；
[0024]图2为实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的氮气吸脱附曲线；
[0025]图3为实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的介孔孔径分布曲线；
[0026]图4为980nm近红外激光激发下实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的上转换荧光发射光谱图；
[0027]图5为980nm近红外光照射前后实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的紫外可见吸收光谱;其中I为光照前，2为光照后；
[0028]图6为不同功率近红外光照射时的实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体水溶液PH值变化曲线，其中I为未光照的实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体水溶液PH值变化曲线，2为近红外光功率为lW/cm2时实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体水溶液pH值变化曲线，3为近红外光功率为2W/cm2时实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体水溶液pH值变化曲线，4为近红外光功率为3W/cm2时实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体水溶液pH值变化曲线；
[0029]图7为不同功率近红外光照射时的实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体药物释放效果图，其中a为未光照的实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体药物释放曲线，b为近红外光功率为lW/cm2时实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体药物释放曲线，c为近红外光功率为2W/cm2时实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体药物释放曲线，d为近红外光功率为3W/cm2时实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体药物释放曲线，I为光照停止位置；
[0030]图8为近红外光功率为2W/cm2时对实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体间歇性照射时的药物模型释放效果图，其中I为近红外光源关，2为近红外光源开。
【具体实施方式】
[0031 ]【具体实施方式】一:本实施方式的一种近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的制备方法具体是按以下步骤进行的:
[0032]一、合成上转换纳米粒子内核:将NaYF4:Yb/Tm上转换纳米粒子分散于环己烷中，得到上转换纳米粒子内核；
[0033]二、合成包覆外壳的上转换纳米粒子:向六水合氯化乾中加入油酸、十八稀和步骤一得到的上转换纳米粒子内核，得到反应体系，在氩气保护和搅拌的条件下将反应体系的温度从室温升温至160°C，并在氩气保护和温度为160°C的条件下搅拌1.5h，然后将温度从160°C自然冷却至50°C，再加入混合液A，然后在氩气保护和温度为50°C的条件下搅拌0.5h，再将温度从50 V升温至80 V，并在氩气保护和温度为80 V的条件下保持30min，然后将反应体系的温度在20min内从80°C升温至300°C，并在氩气保护和温度为300°C的条件下磁力搅拌1.5h，反应结束后，将反应体系自然冷却至室温，采用乙醇作为溶剂进行离心分离得到固体，将固体采用甲醇清洗3?5次，得到包覆外壳的氟化钇钠纳米粒子，然后将包覆外壳的氟化钇钠纳米粒子分散于环己烷中，得到核壳结构的氟化钇钠纳米粒子分散液;所述六水合氯化乾的质量与油酸的体积比为Img:(0.03?0.04)mL;所述六水合氯化乾的质量与十八稀的体积比为Img:(0.09?0.1 )mL;所述六水合氯化乾与步骤一得到的上转换纳米粒子内核中NaYF4:Yb/Tm上转换纳米粒子的摩尔比为1: (I?3);所述混合液A是将氟化铵和氢氧化钠溶解在甲醇中，其中氟化铵的质量与甲醇的体积比为Img: (0.06?0.07)mL，氢氧化钠的质量与甲醇的体积比为Img: (8?12)mL;所述六水合氯化钇与混合液A中氟化铵的摩尔比为1:4；
[0034]三、在上转换纳米粒子外层包覆介孔二氧化硅:将十六烷基三甲基溴化铵加入到水中配成溶液，将溶液与步骤二得到的核壳结构的氟化钇钠纳米粒子分散液混合后在室温下搅拌2h后超声0.5h，得到超声溶液，在温度为80°C的条件下加热至待超声溶液透明后采用氢氧化钠溶液调整超声溶液的PH为8?10，得到调整pH后的超声溶液，然后采用蠕动栗以0.5mL/h的速度向调整pH后的超声溶液中加入浓度为20%的四乙氧基硅烷乙醇溶液后，在温度为35°C的条件下反应24h后，通过离心分离得到固体，将固体采用乙醇清洗3?5次，然后在真空干燥箱内真空干燥24h，得到核壳结构纳米粒子;步骤三中所述的十六烷基三甲基溴化钱的质量与水的体积比为Img: 0.04mL;步骤三中所述的十六烧基三甲基溴化钱的质量与核壳结构的氟化乾钠纳米粒子分散液的体积比为Img: (0.001?0.005)mL；
[0035]四、核壳结构纳米粒子外表面修饰氨基:将核壳结构纳米粒子加入到无水甲苯中超声分散后再加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，得到反应液，将反应液在氮气保护的条件下加热回流24h后，通过离心分离得到固体，将固体采用甲醇清洗3?5次，然后在真空干燥箱内真空干燥24h，得到表面氨基修饰的未除去表面活性剂的核壳结构纳米粒子;步骤四中所述的核壳结构纳米粒子的质量与无水甲苯的体积比为Img: 0.1mL;步骤四中所述的核壳结构纳米粒子的质量与3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为Img:(0.0004?0.0008)mL；
[0036]五、去除表面活性剂形成介孔:将表面氨基修饰的未除去表面活性剂的核壳结构纳米粒子分散在甲醇溶液中，然后加入浓盐酸，在温度为700C的条件下搅拌24h后，通过离心分离得到固体，将固体采用甲醇清洗3?5次，然后在真空干燥箱内真空干燥24h，得到外表面修饰氨基的核壳结构纳米粒子;步骤五中所述的表面氨基修饰的未除去表面活性剂的核壳结构纳米粒子的质量与甲醇溶液的体积比为Img: 0.1mL;步骤五中所述的表面氨基修饰的未除去表面活性剂的核壳结构纳米粒子的质量与浓盐酸的体积比为I m g: (0.0 O O O 5?
0.0002)mL；
[0037]六、在核壳结构纳米粒子外表面修饰客体分子:将外表面修饰氨基的核壳结构纳米粒子加入到二氯甲烷中超声分散后，依次加入I，2-萘醌-2-二叠氮-5-磺酰氯和三乙胺，在室温下搅拌24h后，通过离心分离得到固体，将固体采用甲醇清洗3?5次，然后在真空干燥箱内真空干燥24h，得到修饰客体分子的核壳结构纳米粒子;步骤六中所述的外表面修饰氨基的核壳结构纳米粒子的质量与二氯甲烧的体积比为I m g: 0.1 m L;步骤六中所述的外表面修饰氨基的核壳结构纳米粒子与1,2-萘醌-2-二叠氮-5-磺酰氯的质量比为1: (0.5?0.7);步骤六中所述的外表面修饰氨基的核壳结构纳米粒子的质量与三乙胺的体积比为Img:(0.001?0.005)mL;
[0038]七、负载盐酸阿霉素及孔道封堵:将修饰客体分子的核壳结构纳米粒子加入到盐酸阿霉素水溶液中超声分散，然后在室温下搅拌24h，再向其中加入β-环糊精后持续在室温下搅拌60h，反应结束后离心分离，固体物采用pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液清洗3?5次，然后在真空干燥箱内真空干燥24h，得到近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体;步骤七中所述的修饰客体分子的核壳结构纳米粒子的质量与盐酸阿霉素水溶液的体积比为Img: (0.12?0.15)mL;步骤七中所述的修饰客体分子的核壳结构纳米粒子与β-环糊精的质量比为1: (40?60)。
[0039]本实施方式中步骤二中将温度从50°C升温至80°C，在温度为80°C的条件下保持30min中的目的是将甲醇蒸出。
[0040]本实施方式中步骤三中在温度为80°C的条件下加热0.5h待超声溶液透明的目的是将环己烷蒸出。
[0041 ]本实施方式步骤七中在室温下搅拌24h的目的是保证药物分子能充分进入介孔孔道。
[0042]本实施方式步骤七中持续在室温下搅拌60h的目的是保证主体分子与客体分子能够通过疏水作用充分络合。
[0043]本实施方式中所述离心分离的转速为10000r/min。
[0044]【具体实施方式】二:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:步骤二中所述六水合氯化乾的质量与油酸的体积比为Img: 0.035mL。其他步骤及参数与【具体实施方式】一相同。
[0045]【具体实施方式】三:本实施方式与【具体实施方式】一或二不同的是:步骤二中所述六水合氯化钇的质量与十八烯的体积比为lmg:0.098mL。其他步骤及参数与【具体实施方式】一或二相同。
[0046]【具体实施方式】四:本实施方式与【具体实施方式】一至三之一不同的是:步骤二中所述六水合氯化钇与上转换纳米粒子内核的摩尔比为1: 2。其他步骤及参数与【具体实施方式】
一至三之一相同。
[0047]【具体实施方式】五:本实施方式与【具体实施方式】一至四之一不同的是:步骤三中所述的十六烷基三甲基溴化铵的质量与核壳结构的氟化钇钠纳米粒子分散液的体积比为Img: 0.003mL。其他步骤及参数与【具体实施方式】一至四之一相同。
[0048]【具体实施方式】六:本实施方式与【具体实施方式】一至五之一不同的是:步骤四中所述的核壳结构纳米粒子的质量与3-氨丙基三乙氧基娃烧的体积比为Img: 0.0006mL。其他步骤及参数与【具体实施方式】一至五之一相同。
[0049]【具体实施方式】七:本实施方式与【具体实施方式】一至六之一不同的是:步骤五中所述的表面氨基修饰的未除去表面活性剂的核壳结构纳米粒子的质量与浓盐酸的体积比为Img: 0.0OOlmL。其他步骤及参数与【具体实施方式】一至六之一相同。
[0050]【具体实施方式】八:本实施方式与【具体实施方式】一至七之一不同的是:步骤六中所述的外表面修饰氨基的核壳结构纳米粒子与1,2-萘醌-2-二叠氮-5-磺酰氯的质量比为1:
0.68。其他步骤及参数与【具体实施方式】一至七之一相同。
[0051]【具体实施方式】九:本实施方式与【具体实施方式】一至八之一不同的是:步骤六中所述的外表面修饰氨基的核壳结构纳米粒子的质量与三乙胺的体积比为Img: 0.003mL。其他步骤及参数与【具体实施方式】一至八之一相同。
[0052]【具体实施方式】十:本实施方式与【具体实施方式】一至九之一不同的是:步骤七中所述的修饰客体分子的核壳结构纳米粒子与β-环糊精的质量比为1:50。其他步骤及参数与【具体实施方式】一至九之一相同。
[0053 ]通过以下实施例验证本发明的有益效果:
[0054]实施例一:本实施例的一种近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的制备方法具体是按以下步骤进行的:
[0055]一、将六水合氯化乾(210.8mg,0.695mmoL)、六水合氯化镱(116.2mg,0.3mmoL)和六水合氯化镑(1.9mg，0.005mmoL)加入到三口圆底烧瓶中，然后加入6mL油酸和5mL十八稀；在通氩气的情况下，将混合物搅拌并加热到160°C保持30min，随后再加入1mL十八烯，混合物在温度为160°C的条件下搅拌1.5h后自然冷却至50°C ;向混合物中加入1mL甲醇溶解的氟化钱(148.2mg，4mmoL)与氢氧化钠(10mg，2.5mmoL)溶液，保持50 °C搅拌30min成核，之后在温度为80°C的条件下将甲醇蒸去，将混合物在20min内加热至300°C并在磁力搅拌下保持Ih，反应结束后，将混合物自然降至室温，加入乙醇，产物用离心机在10000转下离心，用乙醇清洗固体，此过程反复3次;最后得到的NaYF4:Yb/Tm上转换纳米粒子分散到1mL环己烷中，得到上转换纳米粒子核；
[0056]二、合成包覆外壳的上转换纳米粒子:向六水合氯化乾(151.7mg,0.5mmoL)中加入6mL油酸、15mL十八烯和上转换纳米粒子内核，得到反应体系，在氩气保护和搅拌的条件下将反应体系的温度从室温升温至160°C，并在氩气保护和温度为160°C的条件下搅拌1.5h，然后将温度从160°C自然冷却至50°C，再加入混合液A，然后在氩气保护和温度为50°C的条件下搅拌0.5h，再将温度从50°C升温至80°C，并在氩气保护和温度为80°C的条件下保持30min，然后将反应体系的温度在20min内从80°C升温至300°C，并在氩气保护和温度为3000C的条件下磁力搅拌1.5h，反应结束后，将反应体系自然冷却至室温，采用乙醇作为溶剂进行离心分离得到固体，将固体采用甲醇清洗3?5次，得到包覆外壳的氟化钇钠纳米粒子，然后将包覆外壳的氟化钇钠纳米粒子分散于1mL环己烷中，得到核壳结构的氟化钇钠纳米粒子分散液;所述混合液A是将氟化铵(74.1mg，2mmoI)和氢氧化钠(50mg，1.25mmoI)溶解在5mL甲醇中；所述六水合氯化I乙与上转换纳米粒子内核中NaYF4:Yb/Tm上转换纳米粒子的摩尔比为1:(1?3);
[0057]三、在上转换纳米粒子外层包覆介孔二氧化硅:将200mg十六烷基三甲基溴化铵加入到SmL水中配成溶液，将溶液与600yL核壳结构的氟化钇钠纳米粒子分散液混合后在室温下搅拌2h后超声0.5h，得到超声溶液，在温度为80°C的条件下加热至待超声溶液透明后采用氢氧化钠溶液调整超声溶液的PH为8?10，得到调整pH后的超声溶液，然后采用蠕动栗以
0.5mL/h的速度向调整pH后的超声溶液中加入1.5mL浓度为20%的四乙氧基硅烷乙醇溶液后，在温度为35°C的条件下反应24h后，通过离心分离得到固体，将固体采用乙醇清洗3?5次，然后在真空干燥箱内真空干燥24h，得到核壳结构纳米粒子；
[0058]四、核壳结构纳米粒子外表面修饰氨基:将10mg核壳结构纳米粒子加入到1mL无水甲苯中超声分散后再加入60yL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，得到反应液，将反应液在氮气保护的条件下加热回流24h后，通过离心分离得到固体，将固体采用甲醇清洗3?5次，然后在真空干燥箱内真空干燥24h，得到表面氨基修饰的未除去表面活性剂的核壳结构纳米粒子；
[0059]五、去除表面活性剂形成介孔:将10mg表面氨基修饰的未除去表面活性剂的核壳结构纳米粒子分散在1mL甲醇溶液中，然后加入10yL浓盐酸，在温度为70°C的条件下搅拌24h后，通过离心分离得到固体，将固体采用甲醇清洗3?5次，然后在真空干燥箱内真空干燥24h，得到外表面修饰氨基的核壳结构纳米粒子；
[0060]六、在核壳结构纳米粒子外表面修饰客体分子:将10mg外表面修饰氨基的核壳结构纳米粒子加入到1mL二氯甲烷中超声分散后，依次加入68mg I，2-萘醌-2-二叠氮-5-磺酰氯和0.3mL三乙胺，在室温下搅拌24h后，通过离心分离得到固体，将固体采用甲醇清洗3?5次，然后在真空干燥箱内真空干燥24h，得到修饰客体分子的核壳结构纳米粒子；
[0061]七、负载盐酸阿霉素及孔道封堵:将30mg修饰客体分子的核壳结构纳米粒子加入至lj4mL浓度为0.5mg/mL的盐酸阿霉素水溶液中超声分散，然后在室温下搅拌24h，再向其中加入150mgi3-环糊精后持续在室温下搅拌60h，反应结束后离心分离，固体物采用pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液清洗3?5次，然后在真空干燥箱内真空干燥24h，得到近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体。
[0062]图1为实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的透射电镜图；从图1可以看出近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体具有尺寸均一的核-壳结构，呈单分散状态，介孔硅球包覆之后纳米粒子的尺寸为70nm左右。
[0063]图2为实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的氮气吸脱附曲线；图3为实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的介孔孔径分布曲线;从图2和图3可以看出氮气吸附脱附高压区滞后环的存在表明合成材料为介孔，孔径在2.3nm左右。介孔可用来装载药物，表面可进一步修饰超分子阀门，用于近红外光控制药物释放。
[0064]图4为980nm近红外激光激发下实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的上转换荧光发射光谱图；从图中可以看出在980nm激光器的激发下，近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体产生三个波段的发光，分别为365nm紫外光，450nm可见光及800nm近红外光，其中紫外光与近红外光用于激发超分子阀门对药物进行控制释放。
[0065]图5为980nm近红外光照射前后实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的紫外可见吸收光谱;其中I为光照前，2为光照后;从图中可以看出在980nm近红外光照射后，近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体在330nm和399nm处紫外可见吸收峰几乎消失，证明上转换纳米核的紫外或近红外发射荧光诱导核-壳纳米粒子表面客体分子发生了光化学反应。
[0066]图6为不同功率近红外光照射时的实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体水溶液PH值变化曲线，其中I为未光照的实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体水溶液PH值变化曲线，2为近红外光功率为lW/cm2时实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体水溶液pH值变化曲线，3为近红外光功率为2W/cm2时实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体水溶液pH值变化曲线，4为近红外光功率为3W/cm2时实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体水溶液pH值变化曲线;从图中可以看出在980nm近红外光照射后，近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体水溶液PH值明显下降，证明上转换纳米核的紫外或近红外发射荧光诱导其表面的DNQ分子发生了光化学反应，生成了亲水产物茚羧酸，客体的水溶性由疏水变为亲水;相同时间内，激光功率越大，PH值变化越大，表明DNQ分子光化学反应速率随激光功率增加而增大。
[0067]实施例二:3.0Wcnf2功率密度近红外激光连续60min照射下的光控药物释放:
[0068 ]称量2.0mg实施例一得到的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体，放置到比色皿的底脚处，缓慢加入2mL磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)，保证纳米粒子在角落集中静止，之后用激光对准粒子进行连续照射60min，利用紫外可见光谱仪跟踪测试药物盐酸阿霉素的浓度，得到累计释放量随时间的变化曲线，证明光控药物释放。同样称取2.0mg实施例一得到的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体在黑暗中进行空白放药实验，加入2mL磷酸盐缓冲溶液(pH = 7.4)，紫外可见光谱仪取相同的时间间隔测量药物的浓度变化。
[0069]实施例三:2Wcm—2功率密度近红外激光连续60min照射下的光控药物释放:操作过程与实施例二相同。
[0070]图7为不同功率近红外光照射时的实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体药物释放效果图，其中a为未光照的实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体药物释放曲线，b为近红外光功率为lW/cm2时实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体药物释放曲线，c为近红外光功率为2W/cm2时实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体药物释放曲线，d为近红外光功率为3W/cm2时实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体药物释放曲线，I为光照停止位置;从图中可以看出没有光照的对照组(曲线a)，基本不放药，说明超分子阀门有效封堵孔道。当用近红外激光照射后，所有曲线显示累计药物释放，增加明显，说明近红外光照射下，客体光化学重排反应发生导致β-环糊精离去，超分子阀门打开，药物释放。随着激光功率密度的增大，药物的释放量逐渐增加，表明该体系可通过调节激光功率大小，精确地调控药物的释放。当光照停止后，药物释放也随之停止(图7中60min后)，表明该体系对光源的开关有着敏感的响应。[0071 ]实施例四:2.0Wcnf2功率密度近红外激光1min周期间歇照射下的光控药物释放:
[0072]称量2.0mg实施例一得到的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体，放置到比色皿的底脚处，缓慢加入2mL磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)，保证纳米粒子在角落集中静止，之后用激光对准粒子以1min为周期进行间歇照射释药，紫外可见光谱仪监测药物盐酸阿霉素的浓度。
[0073]图8为近红外光功率为2W/cm2时对实施例一制备的近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体间歇性照射时的药物模型释放效果图，其中I为近红外光源关，2为近红外光源开;从图中可以看出近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体能在激光功率大小及光源开关的双模式调控下实现药物的精准释放。这对于应对复杂的生物环境、提高治疗效率以及减少毒副作用具有重要的意义。
【主权项】
1.一种近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的制备方法，其特征在于近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的制备方法具体是按以下步骤进tx的: 一、合成上转换纳米粒子内核:将NaYF4:Yb/Tm上转换纳米粒子分散于环己烧中，得到上转换纳米粒子内核； 二、合成包覆外壳的上转换纳米粒子:向六水合氯化乾中加入油酸、十八稀和步骤一得到的上转换纳米粒子内核，得到反应体系，在氩气保护和搅拌的条件下将反应体系的温度从室温升温至160°C，并在氩气保护和温度为160°C的条件下搅拌1.5h，然后将温度从160°C自然冷却至50°C，再加入混合液A，然后在氩气保护和温度为50°C的条件下搅拌0.5h，再将温度从50°C升温至80°C，并在氩气保护和温度为80°C的条件下保持30min，然后将反应体系的温度在20min内从80°C升温至300°C，并在氩气保护和温度为300°C的条件下磁力搅拌1.5h，反应结束后，将反应体系自然冷却至室温，采用乙醇作为溶剂进行离心分离得到固体，将固体采用甲醇清洗3?5次，得到包覆外壳的氟化钇钠纳米粒子，然后将包覆外壳的氟化钇钠纳米粒子分散于环己烷中，得到核壳结构的氟化钇钠纳米粒子分散液;所述六水合氯化乾的质量与油酸的体积比为Img:(0.03?0.04)mL;所述六水合氯化乾的质量与十八稀的体积比为Img:(0.09?0.1 )mL;所述六水合氯化乾与步骤一得到的上转换纳米粒子内核中NaYF4:Yb/Tm上转换纳米粒子的摩尔比为1: (I?3);所述混合液A是将氟化铵和氢氧化钠溶解在甲醇中，其中氟化铵的质量与甲醇的体积比为Img: (0.06?0.07)mL，氢氧化钠的质量与甲醇的体积比为Img: (8?12)mL;所述六水合氯化钇与混合液A中氟化铵的摩尔比为1:4； 三、在上转换纳米粒子外层包覆介孔二氧化硅:将十六烷基三甲基溴化铵加入到水中配成溶液，将溶液与步骤二得到的核壳结构的氟化钇钠纳米粒子分散液混合后在室温下搅拌2h后超声0.5h，得到超声溶液，在温度为80°C的条件下加热至待超声溶液透明后采用氢氧化钠溶液调整超声溶液的PH为8?10，得到调整pH后的超声溶液，然后采用蠕动栗以0.5mL/h的速度向调整pH后的超声溶液中加入浓度为20%的四乙氧基硅烷乙醇溶液后，在温度为35°C的条件下反应24h后，通过离心分离得到固体，将固体采用乙醇清洗3?5次，然后在真空干燥箱内真空干燥24h，得到核壳结构纳米粒子;步骤三中所述的十六烷基三甲基溴化钱的质量与水的体积比为Img: 0.04mL;步骤三中所述的十六烧基三甲基溴化钱的质量与核壳结构的氟化乾钠纳米粒子分散液的体积比为Img: (0.001?0.005)mL； 四、核壳结构纳米粒子外表面修饰氨基:将核壳结构纳米粒子加入到无水甲苯中超声分散后再加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，得到反应液，将反应液在氮气保护的条件下加热回流24h后，通过离心分离得到固体，将固体采用甲醇清洗3?5次，然后在真空干燥箱内真空干燥24h，得到表面氨基修饰的未除去表面活性剂的核壳结构纳米粒子;步骤四中所述的核壳结构纳米粒子的质量与无水甲苯的体积比为Img: 0.1mL;步骤四中所述的核壳结构纳米粒子的质量与3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为Img:(0.0004?0.0008)mL； 五、去除表面活性剂形成介孔:将表面氨基修饰的未除去表面活性剂的核壳结构纳米粒子分散在甲醇溶液中，然后加入浓盐酸，在温度为70°C的条件下搅拌24h后，通过离心分离得到固体，将固体采用甲醇清洗3?5次，然后在真空干燥箱内真空干燥24h，得到外表面修饰氨基的核壳结构纳米粒子;步骤五中所述的表面氨基修饰的未除去表面活性剂的核壳结构纳米粒子的质量与甲醇溶液的体积比为Img: 0.1mL;步骤五中所述的表面氨基修饰的未除去表面活性剂的核壳结构纳米粒子的质量与浓盐酸的体积比为I m g:(0.0 O O O 5?0.0002)mL； 六、在核壳结构纳米粒子外表面修饰客体分子:将外表面修饰氨基的核壳结构纳米粒子加入到二氯甲烷中超声分散后，依次加入I，2_萘醌-2-二叠氮-5-磺酰氯和三乙胺，在室温下搅拌24h后，通过离心分离得到固体，将固体采用甲醇清洗3?5次，然后在真空干燥箱内真空干燥24h，得到修饰客体分子的核壳结构纳米粒子;步骤六中所述的外表面修饰氨基的核壳结构纳米粒子的质量与二氯甲烧的体积比为Img: 0.1mL;步骤六中所述的外表面修饰氨基的核壳结构纳米粒子与1,2-萘醌-2-二叠氮-5-磺酰氯的质量比为1: (0.5?0.7);步骤六中所述的外表面修饰氨基的核壳结构纳米粒子的质量与三乙胺的体积比为I m g:(0.001?0.005)mL; 七、负载盐酸阿霉素及孔道封堵:将修饰客体分子的核壳结构纳米粒子加入到盐酸阿霉素水溶液中超声分散，然后在室温下搅拌24h，再向其中加入β-环糊精后持续在室温下搅拌60h，反应结束后离心分离，固体物采用pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液清洗3?5次，然后在真空干燥箱内真空干燥24h，得到近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体;步骤七中所述的修饰客体分子的核壳结构纳米粒子的质量与盐酸阿霉素水溶液的体积比为Img: (0.12?0.15)mL;步骤七中所述的修饰客体分子的核壳结构纳米粒子与β-环糊精的质量比为1: (40?60)。2.根据权利要求1所述的一种近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的制备方法，其特征在于步骤二中所述六水合氯化乾的质量与油酸的体积比为I m g:0.035mLo3.根据权利要求1所述的一种近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的制备方法，其特征在于步骤二中所述六水合氯化乾的质量与十八稀的体积比为Img:0.098mLo4.根据权利要求1所述的一种近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的制备方法，其特征在于步骤二中所述六水合氯化乾与步骤一得到的上转换纳米粒子内核的摩尔比为1:2。5.根据权利要求1所述的一种近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的制备方法，其特征在于步骤三中所述十六烷基三甲基溴化铵的质量与步骤二得到的核壳结构的氟化钇钠纳米粒子分散液的体积比为Img: 0.003mLo6.根据权利要求1所述的一种近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的制备方法，其特征在于步骤四中所述的步骤三得到的核壳结构纳米粒子的质量与3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为Img: 0.0006mLo7.根据权利要求1所述的一种近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的制备方法，其特征在于步骤五中所述步骤四得到的表面氨基修饰的未除去表面活性剂的核壳结构纳米粒子的质量与浓盐酸的体积比为Img: 0.0OOlmLo8.根据权利要求1所述的一种近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的制备方法，其特征在于步骤六中所述的所述步骤五得到的外表面修饰氨基的核壳结构纳米粒子与I，2-萘醌-2-二叠氮-5-磺酰氯的质量比为1:0.68ο9.根据权利要求1所述的一种近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的制备方法，其特征在于步骤六中所述的步骤五得到的外表面修饰氨基的核壳结构纳米粒子的质量与三乙胺的体积比为Img:0.003mL。10.根据权利要求1所述的一种近红外光激发超分子阀门光控释药的核壳结构药物载体的制备方法，其特征在于步骤七中所述步骤六得到的修饰客体分子的核壳结构纳米粒子与β-环糊精的质量比为1:50。
【文档编号】A61P35/00GK105903016SQ201610421622
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月12日
【发明人】王铀, 韩仁璐
【申请人】哈尔滨工业大学