专利名称：具有荧光标记性质的壳聚糖纳米粒子及其制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种医药技术领域的产品及方法，具体是一种具有荧光标记性质 的壳聚糖纳米粒子及其制备方法。
背景技术：
利用荧光标记物进行分子识别是近年来生命科学领域中的研究热点，荧光标记技 术是指利用一些能发射荧光的物质共价结合或物理吸附在所要研究分子的某个基团上，利 用它的荧光特性来提供被研究对象的信息。有机物质分子在吸收光能后，分子从第1单重 激发态的最低振动能级向基态跃迁时的发射光称为荧光。利用与被研究对象吸附或共价结 合后其荧光特性发生改变，从而反映有关研究对象性能。随着现代医学、分子生物学和各种 先进荧光检测仪器及技术的应用，荧光标记作为一种非放射性的标记技术已应用于生命科 学的各个研究领域，并取得了迅速的发展。荧光标记具有非放射性、操作简便、高稳定性、高 灵敏度和高选择性等特点，且荧光标记染料种类多、方法灵活，可应用于多种生物大分子及 药物的标记。目前，用于荧光标记的物质主要有纳米半导体量子点(如CdSe、CdTe、CdS、 ZnS等)、荧光蛋白(如荧光绿色蛋白、藻胆蛋白、植物荧光蛋白等)、有机荧光染料(如荧光 素、罗丹明等)。但是，量子点作为生物材料应用，存在难包覆、荧光信号容易淬灭，不确定的 生物毒性等一些问题。荧光蛋白的标记技术的局限性，主要体现在与蛋白质偶联后可能会 影响蛋白质空间结构，分离、提纯步骤较多，较难大批量生产。相比较而言，有机荧光染料的光稳定性好，荧光量子产率高，其活性基团易于被标 记分子中的活性基团相结合。虽然有机荧光染料也存在一些缺点，如光淬灭率高、PH敏感 性强和发射波谱宽等。但是，人们针对有机荧光染料的不足之处提出很多改进措施，如激光 诱导荧光法、近红外分析法，特别是将有机荧光染料包覆在纳米粒子内部，改善光淬灭率缺 点，避免和降低散射和背景荧光的干扰。包覆有机染料的纳米粒子不仅可以应用于蛋白质 和核酸分析，还可用于荧光标记多糖、荧光标记药物、以及荧光标记表征生物活性分子的自经过对现有技术的检索发现，制备具有荧光标记性质的纳米粒子，一般采用共价 化学合成的方法，将荧光基团以侧链或者主链的形式引入到聚合物中。如异硫氰酸荧光素， 通过加成反应接到半乳糖的羟基链端上，再与两亲性聚合物聚己内酯_右旋糖酐接枝聚合 得到具有荧光标记性质的纳米粒子。但是现有技术，不仅合成过程繁琐，产物产率低，成本 较高，并且过程中多利用一些污染比较重的化学溶剂，因此在各种高性能荧光标记纳米材 料的设计与合成上遇到了瓶颈。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种具有荧光标记性质的壳聚糖纳米 粒子及其制备方法，制备工艺简单可以进行多功能修饰，所得纳米粒子具有良好的生物相 容性、低毒及体内代谢能力。
本发明是通过以下技术方案实现的本发明涉及一种具有荧光标记性质的壳聚糖纳米粒子，其结构式为 所述的壳聚糖纳米粒子的平均粒径为150 440nm，热分解温度是194°C，Zeta电 位值是+35. 4 士 1. 8mY,荧光激发波长为365 士 lOnm，显示蓝色荧光。本发明涉及上述具有荧光标记性质的壳聚糖纳米粒子的制备方法，包括以下步 骤第一步、首先配置壳聚糖盐酸盐水溶液，然后配置荧光小分子溶液；所述的壳聚糖盐酸盐水溶液的浓度为0. 1-lOmg/mL，其中的壳聚糖盐酸盐为阳 离子型聚合物或水溶性壳聚糖类阳离子型聚合物，其粘度为5-500mpa s，脱乙酰度为 50. 0% -99. 0%。所述的荧光小分子溶液是以二酸蒽甲酯为溶质，以四氢呋喃、乙醇、甲醇或丙酮中 的一种或其组合为溶剂的浓度为0. 01-10mg/mL的小分子溶液。所述的二酸蒽甲酯的结构通式如下 其中n= 2 ；所述的二酸蒽甲酯通过以下方式制备得到a)在室温下，将蒽甲醇加入到丁二酸酐的二氯甲烷溶液中搅拌均勻，然后将混合 溶液升温至35 °C并进一步搅拌24 48小时；所述的蒽甲醇与丁二酸酐的摩尔比为1 2 1 10;b)待混合溶液冷却至室温，加入冰水混合物再升温到室温，依次用二氯甲烷萃取、 酸洗、碱洗、水洗干燥过滤处理后经30°C旋蒸和真空干燥得到荧光小分子丁二酸蒽甲酯。所述的酸洗是指用质量百分比浓度为5%的盐酸水溶液调节混合溶液的pH值 < 7。所述的碱洗是指用饱和NaHC03的水溶液中和混合溶液中过量的残留盐酸，调节 混合溶液的pH值 7。所述的水洗干燥过滤处理是指采用二次重蒸水水洗三次后用无水硫酸钠进行干 燥，最后采用传统漏斗过滤。
第二步、将荧光小分子溶液滴入到持续搅拌的壳聚糖盐酸盐水溶液中，搅拌均勻 后加入疏水性药物，进一步搅拌均勻后静置，得到载药壳聚糖纳米粒子溶液，最后采用微孔 滤膜过滤后得到具有荧光标记性质的壳聚糖纳米粒子。所述的荧光小分子溶液与壳聚糖盐酸盐水溶液的电荷摩尔比0.01 1 2. 0 1 ；所述的疏水性药物包括盐酸尼卡地平、盐酸尼莫地平或者硝苯地平等结构中含硝 基的药物中的一种或其组合；所述的微孔滤膜的孔径为0. 2-0. 8 u m。本发明的具有荧光标记性质的壳聚糖纳米粒子具有以下优点本发明是对天然高 分子壳聚糖进行功能改性制备载药材料，具有良好的生物相容性、低毒及体内代谢能力；本 发明制备方法上采用离子自组装技术，制备工艺简单、成本低、条件温和、无需提纯等后续 处理，而且可以进行多功能修饰；壳聚糖纳米粒子能负载多种疏水药物，并具有荧光标记性 质。现在，在波长为365nm的紫外光照射下，壳聚糖纳米粒子显现出蓝色荧光，负载疏水药 物后，蓝色荧光被药物淬灭而消失。随着疏水药物逐渐释放出来后，蓝色荧光又再次恢复。 通过观察壳聚糖纳米粒子蓝色荧光的恢复程度，从而判断药物的释放情况，达到荧光标记 的作用，方法简单、易操作。
图1是实施例1得到的具有荧光标记性质的壳聚糖纳米粒子的SEM图。图2是实施例1得到的具有荧光标记性质的壳聚糖纳米粒子在荧光显微镜下的照 片。(波长为365nm的紫外光激发)图3是实施例1得到的载有药物盐酸尼卡地平的具有荧光标记性质的壳聚糖纳米 粒子在荧光显微镜下的照片。(波长为365nm的紫外光激发)图4是实施例1得到的具有荧光标记性质的壳聚糖纳米粒子经过6h的释放药物 盐酸尼卡地平后在荧光显微镜下的照片。(波长为365nm的紫外光激发)
具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。实施例1具有荧光标记性质的壳聚糖纳米粒子的制备(1)如图1所示，称取壳聚糖盐酸盐溶于水中，在室温下搅拌使其完全溶解，壳聚 糖盐酸盐的浓度0. 3mg/mL，脱乙酰度80. 0% -90. 0%，粘度10_120mpa s。(2)称取实验室自制的荧光小分子丁二酸蒽甲酯，溶解在四氢呋喃溶液中，溶液浓 度为 0. 4mg/mL。所述的荧光性小分子丁二酸蒽甲酯的制备过程如下在室温下，将蒽甲醇加入到20mL 20mg/mL的丁二酸酐的二氯甲烷溶液中，所述的 蒽甲醇与丁二酸酐的摩尔比为1 4，然后将溶液升温到35°C，搅拌30小时。反应完后，冷却到室温，加入冰水混合物溶液，再次升温到室温后，二氯甲烷萃取、酸洗、碱洗、水洗、无水 硫酸钠干燥，过滤，30°C旋蒸，真空干燥得到黄色荧光小分子丁二酸蒽甲酯，产率40%。(3)将上述荧光小分子溶液滴入到持续搅拌的壳聚糖盐酸盐的水溶液中，滴入 量按荧光小分子与壳聚糖盐酸盐摩尔电荷比例为0. 15计算，继续搅拌120分钟后，静置 5-10min ；(4)用0. 8 y m微孔滤膜过滤上述混合后的溶液，得到具有荧光标记性质的壳聚糖 纳米粒子溶液。本实施例制备所得壳聚糖纳米粒子，其结构式为 其中n = 2，该壳聚糖纳米粒子性能稳定，近似于球形，表面光滑，粒径在200nm左 右，见图1。该粒子具有荧光特征，在365nm的紫外光照射下激发，纳米粒子呈现蓝色荧光， 见图2。实施例2载有药物盐酸尼卡地平的具有荧光标记性质壳聚糖纳米粒子的制备(1)如图1所示，称取壳聚糖盐酸盐溶于水中，在室温下搅拌使其完全溶解，壳聚 糖盐酸盐的浓度为0. 3mg/mL，脱乙酰度80. 0% -90. 0%，粘度10-120mpa s。(2)称取实验室自制的荧光性小分子丁二酸蒽甲酯溶解在四氢呋喃溶液中，溶液 浓度为0. 3mg/mL。所述的荧光性小分子丁二酸蒽甲酯的制备过程如下在室温下，将蒽甲醇加入到20mL 20mg/mL的丁二酸酐的二氯甲烷溶液中，所述的 蒽甲醇与丁二酸酐的摩尔比为1 4，然后将溶液升温到35°C，搅拌30小时。反应完后，冷 却到室温，加入冰水混合物溶液，再次升温到室温后，二氯甲烷萃取、酸洗、碱洗、水洗、无水 硫酸钠干燥，过滤，30°C旋蒸，真空干燥得到黄色荧光小分子丁二酸蒽甲酯，产率40%。(3)将上述荧光小分子溶液滴入到持续搅拌的壳聚糖盐酸盐的水溶液中，滴入量 按荧光小分子与壳聚糖盐酸盐摩尔电荷比例为0. 2计算，加入盐酸尼卡地平的无水甲醇溶 液，药物加入量为壳聚糖质量的60%，继续搅拌120分钟后，室温下敞口挥发甲醇两天，离 心过滤除去未负载上的药物。(4)用0. 8 y m微孔滤膜过滤上述混合后的溶液，得到负载盐酸尼卡地平药物的具 有荧光标记性质的壳聚糖纳米粒子溶液。将制备的负载盐酸尼卡地平药物的具有荧光标记性质的壳聚糖纳米粒子溶液进 行冷冻干燥，再用去离子水溶解、定容，用紫外光谱仪测得载药量为13. 63%。本实施例制备所得壳聚糖纳米粒子，其结构式为 其中n = 2。实施例的药物释放将实施例2制备的载有药物盐酸尼卡地平的具有荧光标记性质的壳聚糖纳米粒 子溶液装入截留分子量为3500的透析袋中，浸入250mL、37°C的去离子水中进行模拟体外 药物释放实验。持续搅拌6h后，将透析袋中的纳米粒子溶液取出，波长为365nm的紫外光 激发下，用荧光显微镜观察纳米粒子的荧光恢复情况，见图4。
权利要求
一种具有荧光标记性质的壳聚糖纳米粒子，其特征在于，所述的壳聚糖纳米粒子结构式为其中n＝2。FDA0000021301550000011.tif
2.根据权利要求1所述的具有荧光标记性质的壳聚糖纳米粒子，其特征是，所 述的壳聚糖纳米粒子的平均粒径为150 440nm，热分解温度194°C，Zeta电位值是 +35. 4 士 1. 8mV。
3.根据权利要求1所述的具有荧光标记性质的壳聚糖纳米粒子，其特征是，所述的壳 聚糖纳米粒子经365nm的紫外光激发后，纳米粒子具有蓝色荧光。
4.一种如权利要求1所述的具有荧光标记性质的壳聚糖纳米粒子的制备方法，其特征 在于，包括以下步骤第一步、首先配置壳聚糖盐酸盐水溶液，然后配置荧光性小分子溶液；第二步、将荧光小分子溶液滴入到持续搅拌的壳聚糖盐酸盐水溶液中，搅拌均勻后加 入疏水性药物，进一步搅拌均勻后静置，挥发有机溶液，离心过滤未负载上的药物，最后采 用微孔滤膜过滤后得到具有荧光性质的壳聚糖纳米粒子。
5.根据权利要求4所述的具有荧光标记性质的壳聚糖纳米粒子的制备方法，其 特征是，所述的壳聚糖盐酸盐水溶液的浓度为0. 1-lOmg/mL，其中的壳聚糖盐酸盐为阳 离子型聚合物或水溶性壳聚糖类阳离子型聚合物，其粘度为5-500mpa· s，脱乙酰度为 50. 0% -99. 0%。
6.根据权利要求4所述的具有荧光标记性质的壳聚糖纳米粒子的制备方法，其特征 是，所述的荧光性小分子溶液是以二酸蒽甲酯为溶质，以四氢呋喃、乙醇、甲醇或丙酮中的 一种或其组合为溶剂的浓度为0. Ol-lOmg/mL的小分子溶液。
7.根据权利要求6所述的具有荧光标记性质的壳聚糖纳米粒子的制备方法，其特征 是，所述的二酸蒽甲酯的结构通式如下 其中n = 2。
8.根据权利要求6或7所述的具有荧光标记性质的壳聚糖纳米粒子的制备方法，其特 征是，所述的二酸蒽甲酯通过以下步骤制备得到a)在室温下，将蒽甲醇加入到丁二酸酐的二氯甲烷溶液中搅拌均勻，然后将混合溶液 升温至35 °C并进一步搅拌24 48小时；所述的蒽甲醇与丁二酸酐的摩尔比为1 2 1 10;b)待混合溶液冷却至室温，加入冰水混合物再升温到室温，依次用二氯甲烷萃取、酸 洗、碱洗、水洗干燥过滤处理后经30°C旋蒸和真空干燥得到荧光小分子丁二酸蒽甲酯。
9.根据权利要求4所述的具有荧光标记性质的壳聚糖纳米粒子的制备方法，其特征 是，所述的荧光小分子溶液与壳聚糖盐酸盐水溶液的摩尔比为0.01 1 2.0 1。
10.根据权利要求4所述的具有荧光标记性质的壳聚糖纳米粒子的制备方法，其特征 是，所述的微孔滤膜的孔径为0. 2-0. 8 μ m。
全文摘要
一种医药技术领域的具有荧光标记性质的壳聚糖纳米粒子及其制备方法，该纳米粒子的结构式为其中n＝2，平均粒径为150～440nm，热分解温度是194℃。本发明方法制备工艺简单可以进行多功能修饰，所得纳米粒子具有药物的荧光标记特性，以及良好的生物相容性。
文档编号G01N21/64GK101838344SQ20101016929
公开日2010年9月22日 申请日期2010年5月12日 优先权日2010年5月12日
发明者崔巍, 路庆华, 陆学民 申请人:上海交通大学