基因工程单链抗体检测黄曲霉毒素B₁的试剂盒及方法

专利名称：基因工程单链抗体检测黄曲霉毒素B₁的试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及一种利用基因工程单链抗体检测真菌毒素的检测试剂盒，更具体地涉 及了利用基因工程单链抗体检测黄曲霉毒素B1的试剂盒，进一步涉及使用该试剂盒检测黄 曲霉毒素B1的方法。
背景技术：
目前，用于免疫检测黄曲霉毒素B1的抗体都是单克隆抗体。单克隆抗体的生产采 用抗原免疫动物，然后利用免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，最后筛 选出具有高抗体活性而又能大量繁殖的杂交瘤细胞。整个生产过程复杂，消耗的时间长，费 用高，尤其是它必需要熟练的专业技术人员才能胜任。

发明内容
为了克服现有单克隆抗体生产费时费力费钱的不足，本发明提供了一种基因工程 单链抗体检测黄曲霉毒素B1的试剂盒及方法，使整个生产过程变得非常简单，省时省力省 钱。本发明的技术方案如下本发明的利用基因工程单链抗体检测黄曲霉毒素B1的试剂盒，其试剂包括(1)样品提取液50%体积比甲醇的生理盐水；(2) AFB1标准试剂分别为含0. 1，0. 5，1. 0,5. 0，10ng/mL AFB1的样品提取液；(3)酶标抗原试剂为含AFBl-HRP偶联蛋白的0. OlM PBS溶液，保存于体积比 50%的甘油内，-20°C保存，效价为5000 ；使用时用BSA试剂稀释；(4)洗涤液TNT溶液；配方组份体积比为0. 05%吐温-20，20mmol/L Tris-HCl， 150mmol/LNaCl, pH 7. 4 ；(5) BSA 试剂含 5% BSA 的 TNT 溶液(6)显色底物10ml 显色液；配方组份250 μ L 20mg/mL DAB,40 μ L 40mg/mL NiCl，9. 75ml 的 1. Omol/L Tris-HCl (pH 6. 8)，-20°C保存；使用时加 7 μ L 30% H2O2 ；(7)终止液去离子水中含0. lmol/L亚硫酸钠，2mol/L硫酸。使用上述利用基因工程单链抗体检测黄曲霉毒素B1的试剂盒检测黄曲霉毒素B1 的方法，依次包括以下步骤(1)样品处理在Ig样品中加入4ml样品提取液，液氮或机械研磨粉碎，超声萃取 10min，5000g，离心lOmin，上清液即为含样品的样品提取液；含样品的样品提取液取100 μ 1与100 μ 1酶标抗原试剂混和均勻，即成A试剂；系列浓度的AFB1 标准试剂 0. 1,0.5,1.0,5.0,10ng/mL 各 100 μ L 分别与 100 μ L 酶 标抗原试剂混和均勻，即成系列浓度的B试剂；(2)试剂平衡将试剂盒自-20°C冰箱取出，放置15min以上，平衡至室温；(3)小孔编号根据需要取出酶标条放置在反应板支架上。1号孔为阴性孔，2-6号
3孔为AFB1标准对照孔，其余孔为样品孔；酶标条每孔内已经有固相化抗AFB1单链抗体；(4)洗涤每孔加入250 μ L洗涤液，洗液不得溢出，放置2min后，去掉洗涤液，在 吸水纸上拍干，重复洗板一次；(5)加样1号孔加上50μ L BSA试剂，2-6号孔分别加入系列浓度的B试剂50μ L， 样品孔加入相应的A试剂50 μ L，轻轻震荡，使各孔混勻；(6)反应将反应板放入37°C恒温箱中孵育30min ；(7)洗涤取出反应板，去掉反应液，拍干。每孔加入250 μ L洗涤液，洗液不得溢 出，放置2min后，去掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板4次；(8)显色每孔加入显色底物100 μ L，摇勻，将反应板放入37°C恒温箱中存放 15min ；(9)终止与仪器测定每孔分别加入终止液50 μ L，然后用酶标仪在450nm处测定 各孔的吸光值A，以B试剂的系列浓度为横坐标，以其相应的吸光值A为纵坐标绘制标准曲 线，根据标准曲线得到样品中AF B1W浓度，根据计算公式AF B1含量(ng/g) =C*V/m，其中 C-AFB1的浓度，ng/mL ；V-样品提取液的体积，mL ；m_样品质量，g ；计算样品中AF B1的含量。 其中所述抗AFB1单链抗体制备方法如下从免疫小鼠的脾脏中提取总RNA(使用Trizol试 剂盒提取小鼠脾脏总RNA)，经反转录成cDNA。经PCR扩增抗体重链可变区Vh基因和轻链 可变区八基因，PCR 扩增程序为 94°C 5min ；94°C 45s, 55°C 45s, 72°C 45s，33 循环；72°C延 伸IOmin ；然后的琼脂糖凝胶电泳，验证PCR扩增产物；由于PCR产物均只有一条带，回 收 Vh 和 V J勺 PCR 产物。通过一段连接肽(Linker, Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly GlyGly Ser Gly Gly Gly Gly Ser)把Vh和八连接成单链抗体(scFv)，然后克隆到载体上构建噬 菌体抗体文库，再通过生物淘选以获得对黄曲霉毒素B1具高亲和力的单链抗体。所述抗AFB1单链抗体的序列如SEQ ID No. 1所示。本发明的抗AFB1单链抗体，其结构如图1所示。该单链抗体(scFv)是用基因工 程方法将抗体重链可变区(Vh)和轻链可变区通过一段连接肽(Linker)连接而成的重 组蛋白，如图2所示抗黄曲霉毒素B1抗体重链可变区(Vh)的大小为345bp ；如图3所示抗 黄曲霉毒素B1抗体轻链可变区(\)的大小为325bp ；如图4所示抗黄曲霉毒素B1单链抗体 (scFv)的大小为750bp ；该单链抗体(scFv)保持了亲本抗体的抗原亲和活性和特异性的最 小功能性抗体片段，可在细菌中很经济地大规模生产，使得用于免疫检测的抗体生产变得 非常容易、简便和经济，进而大大减少诊断试剂的费用。本试剂盒的最小检出量为0. 01 μ g/ Kg。本发明的显著优点可以在大肠杆菌中高效表达这种抗黄曲霉毒素B1小分子基因工程单链抗体并大 规模生产，整个生产过程变得非常简单，省时省力省钱。需检测的样品经样品提取液提取 后，与1/5000稀释后的酶标抗原试剂等体积混合，酶标条每孔加入50 μ L ；37°C孵育30min 后，250 μ L洗涤液洗4次，每次2min ；加入显色底物100 μ L，摇勻，将反应板放入37°C恒温 箱中存放15min ；加入终止液50 μ L，然后测定450nm处样品的吸光值A ；对照由系列浓度的 AFB1标准试剂绘制的AFB1浓度标准曲线图即可确定样品内AFB1的含量。在1. 5_2h时间内 即可确定样品是否受AFB1污染，以及所含AFB1的量，使用方便快捷，成本低廉。


图1是本发明的单链抗体结构示意图；图2是本发明的单链抗体重链基因Vh扩增的电泳图；图3是本发明的单链抗体轻链基因\扩增的电泳图；图4是本发明的单链抗体基因scFv扩增的电泳图；图5是本发明的单链抗体竞争ELISA检测曲线图。
具体实施例方式以下为本发明的具体实例，进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此。实施例1按以下配方制作利用基因工程单链抗体检测黄曲霉毒素B1的试剂盒(1)样品提取液50%体积比甲醇的生理盐水；(2) AFB1标准试剂分别为含0. 1，0. 5，1. 0,5. 0，IOngAiLAFB1的样品提取液；(3)酶标抗原试剂为含AFBl-HRP偶联蛋白的0. OlM PBS溶液，保存于体积比 50%的甘油内，-20°C保存，效价为5000 ；使用时用BSA试剂稀释；(4)洗涤液TNT溶液；配方组份体积比为0. 05%吐温-20，20mmol/L Tris-HCl， 150mmol/LNaCl, pH 7. 4 ； (5) BSA 试剂含 5 % BSA 的 TNT 溶液(6)显色底物IOml 显色液；配方组份250 μ L 20mg/mL DAB, 40 μ L 40mg/mL NiCl，9. 75ml 的 1. Omol/L Tris-HCl (pH 6. 8)，-20°C保存；使用时加 7 μ L 30% H2O2 ；(7)终止液去离子水中含0. lmol/L亚硫酸钠，2mol/L硫酸。按以下程序检测黄曲霉毒素B1 (1)样品处理在Ig样品(花生、玉米、小麦或大米)中加入4ml样品提取液，液 氮或机械研磨粉碎，超声萃取10min，5000g，离心lOmin，上清液即为含样品的样品提取液；含样品的样品提取液取100 μ 1与100 μ 1酶标抗原试剂混和均勻，即成A试剂；系列浓度的AFB1 标准试剂 0. 1,0.5,1.0,5.0,10ng/mL 各 100 μ L 分别与 100 μ L 酶 标抗原试剂混和均勻，即成系列浓度的B试剂；(2)试剂平衡将试剂盒自-20°C冰箱取出，放置15min以上，平衡至室温；(3)小孔编号根据需要取出酶标条放置在反应板支架上。1号孔为阴性孔，2-6号 孔为AFB1标准对照孔，其余孔为样品孔；酶标条每孔内已经有固相化抗AFB1单链抗体；所 述抗AFB1单链抗体制备步骤为从免疫小鼠的脾脏中提取总RNA，经反转录成cDNA，经PCR 扩增抗体重链可变区Vh基因和轻链可变区\基因，通过一段连接肽(Linker)把Vh和八连 接成单链抗体(scFv)，然后克隆到载体上构建噬菌体抗体文库，再通过生物淘选以获得对 黄曲霉毒素B1具高亲和力的单链抗体。(4)洗涤每孔加入250 μ L洗涤液，洗液不得溢出，放置2min后，去掉洗涤液，在 吸水纸上拍干，重复洗板一次；(5)加样:1号孔加上50μ L BSA试剂，2-6号孔分别加入系列浓度的B试剂50μ L， 样品孔加入相应的A试剂50 μ L，轻轻震荡，使各孔混勻；(6)反应将反应板放入37°C恒温箱中孵育30min ；
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(7)洗涤取出反应板，去掉反应液，拍干。每孔加入250 μ L洗涤液，洗液不得溢 出，放置2min后，去掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板4次；(8)显色每孔加入显色底物100 μ L，摇勻，将反应板放入37°C恒温箱中存放 15min ；(9)终止与仪器测定每孔分别加入终止液50 μ L，然后用酶标仪在450nm处测定 各孔的吸光值A，以B试剂的系列浓度为横坐标，以其相应的吸光值A为纵坐标绘制标准曲线。通过抗黄曲霉毒素B1单链抗体上的E-tag将抗黄曲霉毒素B1单链抗体与固定于 酶标板上的抗E-tag抗体结合，形成固相抗体；加入待测样品和抗黄曲霉毒素B1酶标抗原， 样品中的抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，待测样品中抗原含量越高，则与固相抗体 结合的越多，使得酶标抗原与固相抗体结合的机会就越少，甚至没有机会结合，这样加入底 物后就不显色或显色很浅，显色深者为阴性。如表1所示，随着所加入的标准浓度AFB1的 浓度的逐步升高，相对应的吸光值OD值逐步减少。根据此数据绘制的黄曲霉毒素B1标准 浓度曲线如图5所示，0D450nm处吸光值与待测样品的浓度呈反比关系，因此根据待测样品 的0D450nm处吸光值就可判断其中含有的黄曲霉毒素B1的浓度。根据计算公式样品中AF B1含量(ng/g) = C*V/m，其中C-样品中AFB1的浓度， ng/mL ；V-样品提取液的体积，mL ；m_样品质量，g ；计算样品中AFB1的含量。当吸光值为 1. 0502 时，AFB1 含量0. 05*4/1 = 0. 2ng/g。表1本发明的单链抗体的竞争ELISA检测 注浓度为Ong/mL时，一抗为本发明噬菌体单链抗体和等体积的PBS，其他样品孔 加入等体积的AFB1标准溶液(浓度分别为0. 1,0. 5,1. 0,5. 0U0ng/mL)。
权利要求
一种基因工程单链抗体检测黄曲霉毒素B1的试剂盒，其特征在于其试剂包括(1)样品提取液50％体积比甲醇的生理盐水；(2)AFB1标准试剂分别为含0.1，0.5，1.0，5.0，10ng/mLAFB1的样品提取液；(3)酶标抗原试剂为含AFB1-HRP偶联蛋白的0.01M PBS溶液，保存于体积比50％的甘油内，-20℃保存，效价为5000；使用时用BSA试剂稀释；(4)洗涤液TNT溶液；配方组份体积比为0.05％吐温-20，20mmol/L Tris-HCl，150mmol/LNaCl，pH 7.4；(5)BSA试剂含5％BSA的TNT溶液；(6)显色底物10ml显色液；配方组份250μL 20mg/mL DAB，40μL 40mg/mL NiCl，9.75ml的1.0mol/L Tris-HCl(pH 6.8)，-20℃保存；使用时加7μL 30％H2O2；(7)终止液去离子水中含0.1mol/L亚硫酸钠，2mol/L硫酸。
2.一种利用基因工程单链抗体检测黄曲霉毒素B1的试剂盒的方法，其特征在于依次 包括以下步骤(1)样品处理在Ig样品中加入4ml样品提取液，液氮或机械研磨粉碎，超声萃取 10min，5000g，离心lOmin，上清液即为含样品的样品提取液；含样品的样品提取液取100 μ 1与100 μ 1酶标抗原试剂混和均勻，即成A试剂；系列浓度的AFB1标准试剂0. 1,0. 5，1. 0，5. 0，10ng/mL各100 μ L分别与100 μ L酶标 抗原试剂混和均勻，即成系列浓度的B试剂；(2)试剂平衡将试剂盒自-20°C冰箱取出，放置15min以上，平衡至室温；(3)小孔编号根据需要取出酶标条放置在反应板支架上。1号孔为阴性孔，2-6号孔 为AFB1标准对照孔，其余孔为样品孔；酶标条每孔内已经有固相化抗AFB1单链抗体；(4)洗涤每孔加入250μ L洗涤液，洗液不得溢出，放置2min后，去掉洗涤液，在吸水 纸上拍干，重复洗板一次；(5)加样1号孔加上50yLBSA试剂，2-6号孔分别加入系列浓度的B试剂50 μ L，样 品孔加入相应的A试剂50 μ L，轻轻震荡，使各孔混勻；(6)反应将反应板放入37°C恒温箱中孵育30min；(7)洗涤取出反应板，去掉反应液，拍干。每孔加入250μ L洗涤液，洗液不得溢出，放 置2min后，去掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板4次；(8)显色每孔加入显色底物100μ L，摇勻，将反应板放入37°C恒温箱中存放15min ；(9)终止与仪器测定每孔分别加入终止液50μ L，然后用酶标仪在450nm处测定各孔 的吸光值A，以B试剂的系列浓度为横坐标，以其相应的吸光值A为纵坐标绘制标准曲线，根 据标准曲线得到样品中AF B1W浓度，根据计算公式AF B1含量(ng/g) = C*V/m，其中C-AFB1 的浓度，ng/mL ；V-样品提取液的体积，mL ；m-样品质量，g ；计算样品中AF B1的含量。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于步骤(3)所述抗AFB1单链抗体制备方 法如下从免疫小鼠的脾脏中提取总RNA，经反转录成cDNA，经PCR扩增抗体重链可变区Vh 基因和轻链可变区\基因，通过一段连接肽把Vh和\连接成单链抗体，然后克隆到载体上 构建噬菌体抗体文库，再通过生物淘选以获得对黄曲霉毒素B1具高亲和力的单链抗体。
4.根据权利要求2或3所述利用基因工程单链抗体检测黄曲霉毒素B1的试剂盒的方 法，其特征在于所述抗AFB1单链抗体的序列如SEQ ID No. 1所示。
全文摘要
本发明提供了一种基于基因工程单链抗体的黄曲霉毒素B1检测试剂盒及方法，本发明的试剂盒中，其试剂包括其试剂包括样品提取液、AFB1标准试剂、酶标抗原试剂、洗涤液、BSA试剂、显色底物、终止液。通过样品处理、试剂平衡、洗涤、加样、孵育、洗涤、显色、终止，获得对黄曲霉毒素B1具高亲和力的单链抗体。本发明可以在大肠杆菌中高效表达抗黄曲霉毒素B1小分子基因工程单链抗体并大规模生产，整个生产过程变得非常简单，省时省力省钱。使用方便快捷，成本低廉。
文档编号G01N21/78GK101881771SQ20101018480
公开日2010年11月10日 申请日期2010年5月15日 优先权日2010年5月15日
发明者庄振宏, 杨燕凌, 林玲, 汪世华, 袁军, 高媛媛 申请人:福建农林大学