专利名称：一种罗丹明b酶联免疫检测方法
技术领域：
一种罗丹明B酶联免疫检测方法，涉及一类色素残留检测方法，更具体的说是用 酶联免疫吸附方法(ELISA)检测罗丹明B的残留。属于酶联免疫检测(ELISA)技术领域。
背景技术：
罗丹明B(Rhodamine B)为三苯甲烷类碱性染料，具有潜在的致癌和致突变性，我 国和欧盟等都不允许在食品中使用。它是一种具有鲜桃红色的人工合成的染料，在溶液中 有强烈的荧光，用作实验室中细胞荧光染色剂、有色玻璃、特色烟花爆竹等行业，不容许用 作食品染色。罗丹明B具有脂溶性，会被非法用作调味品(主要是辣椒粉和辣椒油)染色 剂。使用了被污染的调味品制作食品时会造成残留。调味品使用罗丹明B染色时含量较高， 甚至直接掺入，可进行现场检测。食品中因其含量较低，需送实验室检测。罗丹明B残留分析方法，主要包括高效液相法(HPLC)，尽管这些方法灵敏度较高， 但样品的前处理步骤较多，相对费时且检测费用较高，特别是不适用于大量样品的筛选。酶联免疫吸附测定法(ELISA)提供了一种痕量罗丹明B的快速、灵敏、选择性检测 方法。
发明内容
本发明的目的建立了罗丹明B残留ELISA检测方法，为罗丹明B残留检测提供了 快速高效的检测手段，由于采用的是多克隆抗体，费用较低并且稳定性和重复性较好。检测 限(IC90)为0. 028ng/mL、半数抑制量(IC50)为1. 3ng/mL和检测范围(IC20 IC80)为 0. 07 17. 5ng/mL。本发明的技术方案一种罗丹明B酶联免疫检测方法，利用胥传来，宋珊珊，林菲 (一种罗丹明B人工抗原的合成方法[P].中国专利CN200910031727. 5)合成的罗丹明B 免疫原免疫健康白兔得到多克隆抗体，以罗丹明B为标准品，以罗丹明B半抗原与OVA的偶 联物作为包被原，建立调味品中的罗丹明B的间接竞争酶联免疫捡测方法。本发明通过以下步骤实现(1)以0.05M的碳酸盐缓冲溶液稀释罗丹明B-0VA包被原，稀释质量比为 1 1000 1 64000，稀释后加入酶标板中，每孔lOOilL ;4°C孵育过夜，按照常规ELISA 方法封闭、洗涤；(2)将系列浓度梯度的罗丹明B标准品加入酶标板中，每孔50 y L ；同时加入以抗 体稀释液稀释为1 1000 1 4000的多克隆抗体，每孔50iiL;37°C竞争0. 5h后以含吐 温的磷酸盐缓冲液PBST洗涤3 5次，加入以抗体稀释液稀释为1 1000 1 3000的 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔(GAR-HRP)，每孔100 u L，37°C作用0. 5h后以PBST洗涤3 5次；所述PBST 溶液含 0. 05% Tween-20 的 0. 01M PBS 溶液；所述封闭液含0. 1 %明胶的pH 9.6,0. 05M碳酸盐缓冲溶液；
所述抗体稀释液含0. 1 %明胶的PBST溶液；(3)配置显色液A 液配方为每 100mL 超纯水中加入 0. 933g 柠檬酸，3. 68g Na2HP04 12H20,18 u L 30% H202 ；B液配方为60mg四甲基联苯胺溶于lOOmL乙二醇中；使用前将A液与B液以5 1体积比混合。(4)加入显色液100 u L，37°C显色15min ；加入终止液2M硫酸溶液，酶标仪450nm 测吸光值(0D)；根据不同浓度罗丹明B标准液的吸光值绘制罗丹明B浓度-吸光值标准曲 线.
一入 ，(5)调味品的提取液作为样品溶液，直接加样于微孔中，进行ELISA测定，酶标仪 450nm测吸光值0D，对照标准曲线测出调味品的罗丹明B浓度。调味品的提取方法为(1)以l-5ng/g水平的罗丹明B加入阴性样品，在室温下至少静置15min ；(2)取辣椒粉lg，加入10mL含20%丙酮的正己烷，振摇lOmin，静置或过滤使分离 出上层清液；残渣加入10mL含20%丙酮的正己烷重复提取一次，合并2次提取液，混勻；(3)移取提取液于氮吹仪上吹干，用0. 01M的PBS重溶；(4)移取50 y L重溶液，作样品溶液，直接加样于微孔中，进行ELISA测定。更详细的步骤为主要溶液配制1)配制磷酸盐0. OIM(PBS)缓冲液Na2HP04 12H203. 62gKH2P040. 2gNaCl0. 2gKC18. Og加超纯水稀释至1000mL。2)配制碳酸盐(CBS)缓冲溶液(0. 05M)pH9. 6Na2C031. 59gNaHC032. 93g加超纯水稀释至1000mL。3)配制 PBST 溶液含 0. 05% Tween-20 的 PBS 溶液。4)配制封闭液含0. 1 %明胶的pH 9.6,0. 05M碳酸盐缓冲溶液。5)配制抗体稀释液含0. 1 %明胶的PBST溶液。6)显色液A 液0.933g 柠檬酸，3.68g Na2HP04 12H20，18 y L 30 % H202 用超纯水定容至 100mL。B液60mg 3，3，5，5_四甲基联苯胺(TMB)溶于lOOmL乙二醇中。使用前将A液与B液以5 1体积比混合。7)终止液2M 的 H2S04。间接竞争ELISA实验方法的步骤如下
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预先将罗丹明B标准品配制成1000 u g/mL的甲醇溶液作为工作母液，在4°C保存 待用。配制 PBST 溶液(0. 01mol/L、pH7. 4、0. 15mol/L NaCl，0. 5% Tween-20)，以此为基础 配制系列反应液，用以稀释竞争物标准液和抗血清(多克隆抗体)。a、包被用设定浓度的包被原包被酶联反应板，100 u L/孔，4°C过夜。b、洗涤用PBST洗涤反应板三次，每次3min，200 u L/孔，然后甩干反应板。c、封闭含 0. 明胶的 CBS,200u L/ 孔，37°C封闭 2h。d、洗涤同 b。e、竞争用PBS将罗丹明B母液稀释成0. 25，0. 5,1,2. 5，5，10，20ng/mL系列浓度， 另设一个PBS空白对照，50 u L/孔。然后每孔加入50 y L稀释4000倍的抗血清，于37°C温 育 0. 5h。f、洗涤同 b。g、加酶标二抗(羊抗兔 HRP_IgG，l 3000)，1001117孔，371反应0.511。h、洗涤同 b。i、显色加TMB配制的显色液100 ii L/孔，显色15min。j、终止加终止液100 ii L/孔。k、测定用酶标仪检测0D 450nm。本发明的有益效果以罗丹明B半抗原与OVA的偶联物作为包被原，建立了罗丹明 B的间接ELISA方法，为罗丹明B的残留检测提供了快速高效的检测手段，由于采用的是多 克隆抗体，费用较低并且稳定性和重复性较好。检测限(ICJ为0.028ng/mL、半数抑制量 (IC50)为 1. 3ng/mL 和检测范围(IC20 IC80)为 0. 07 17. 5ng/mL。
图1罗丹明B的标准抑制曲线。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。
一、仪器
TGL-40B台式低速离心机上海安亭科学仪器厂
KFL0W纯水机凯佛隆公司
ZD-9556水平摇床太仓科教器材厂
Costar 96孔8X 12可拆酶标板上海吉泰生物科技有限公司
MuLtiska Mks 酶标仪Thermo Labsystems 公司
可调试移液器Thermo Labsystems 公司
涡旋混合器上海沪西仪器分析
二、试齐U
辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(HRP-IgG) 康成生物工程公司
四甲基联苯胺(TMB)华美生物工程公司
其他试剂均为分析纯试剂
三、步骤
1、免疫原和包被原的合成用混合酸酐法合成免疫原(罗丹明B半抗原与牛血清白蛋白BSA偶联)，用碳二亚 胺法偶联合成包被原(罗丹明B半抗原与卵清蛋白OVA偶联物)，具体步骤如下免疫原的制备A液20mg罗丹明B溶于lmL DMF中，全溶后冰浴下加10 y L三丁氨混勻后再加 10 U L氯甲酸异丁酯磁力搅拌lh ；B液40mg BSA溶于3mL pH 7. 4的磷酸盐缓冲液中，4°C保存备用。冰浴下将A液逐滴加入B液中，然后置4°C下温孵3h，即得罗丹明B完全抗原混合 液；透析袋前处理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60°C的去离子水冲洗 3min，保存在4°C去离子水中备用；透析将罗丹明B完全抗原混合液移入透析袋中，用2 X 2L (每次2L，进行2次，下 同)的0. 01M的pH7. 4的磷酸盐缓冲溶液和2X2L的去离子水透析3天，最后使用冻干法 将透析袋中的液体制成粉末，即得到罗丹明B完全抗原；包被原制备A液10mg罗丹明B，6mg EDC (碳二亚胺)，4mg NHS (羟基琥珀酸亚胺)溶于2mL 卩85(0.0说)，磁力搅拌311。B液15mg OVA溶于3mL pH 7. 4的磷酸盐缓冲液中，4°C保存待用。将A液逐滴加入B液中，然后置4°C下温孵3小时。即得包被原混合液。透析袋前处理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60°C的去离子水冲洗 3min，保存在4°C去离子水中备用。将人工包被原混合液移入透析袋中，用2 X 2L的0. 01M的PBS溶液和2 X 2L的去 离子水透析3天。最后使用冷冻干燥法将透析袋中的液体制成粉末，即得到包被原罗丹明 B-0VA。2、抗血清(多克隆抗体)的制备1)实验动物选14只2月龄、体重为1.5_2kg的健康新西兰大白兔，雌雄各半，每 两只为一个实验组。2)抗原配置将免疫原用生理盐水溶解，配成2mg/mL的溶液。3)乳化将上述溶液与等量完全或不完全福氏佐剂用混合搅拌法将其乳化，直至 将一滴乳剂滴入水中，不散开漂在水面。4)免疫方法初次免疫将乳化好的试剂于兔子背部多点注射，lmL/只。初次免疫 后的免疫称为加强免疫，加强免疫用福氏不完全佐剂乳化，加强免疫于肌肉注射，10d加强 免疫一次，剂量与初次免疫相同。5)采血4次加强免疫后从耳缘静脉采血，采用间接酶联免疫法测定抗血清效价。 待效价达到要求后，采用耳静脉放血与心脏放血相结合获得抗血清，收集于50mL灭菌塑料
离心管中。6)抗体的纯化和保存以一定数量的DEAE52放入烧杯中，加入0. 01mol/L、pH 8.0PBS缓冲液，静置30min，去上清细粒，再重复一次。用布氏漏斗(内放两层滤纸)过滤。 以5g湿重的DEAE-纤维素加lmL血清及3mL蒸馏水混合液的比例，加入各成分，充分搅拌。于4°C中放置lh，中间搅拌数次。用布氏漏斗抽滤，再用0. Olmol/L.pH 8. 0PBS缓冲液冲洗 纤维素，抽滤。滤液即为提取的IgG液。放于20°C冰箱保存备用。3、ELISA 反应过程1)将包被原用包被缓冲液作系列稀释包被96孔酶标板，100 PL/孔，于4°C冰箱过 夜。次日取出酶标板回至室温，每孔注入200 yLPBST溶液，摇床上振荡3min，用力甩掉洗涤 液，在吸水纸上拍干，继续洗涤2次。以下洗涤方法相同。2)充分洗涤后，用封闭缓冲液封闭酶标板，200 u L/孔，于37°C温育箱内温育2h后 取出烘干待用。3)将阳性血清系列稀释对应加入到酶标板的前7行列，第8行加入阴性血清， 100 u L/孔，37°C孵育lh后洗涤、拍干。4)每孔加入100 ii L，1 3000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，37°C孵育lh后洗涤、拍干。5)每孔加入100 u L显色液(TMB与底物液比例为1:5)，暗处37°C反应15min, 取出后每孔加入100 u L终止液(2mol/L的硫酸)，用酶标仪测定吸光值A450。4、回收率及样品提取方法的确定(1)以lng/g和5ng/g的水平加入罗丹明B样品，在室温下至少静置15min。(2)取辣椒粉lg，加入10mL含20%丙酮的正己烷，振摇lOmin，静置或过滤使分离 出上层清液，残渣加入10mL含20%丙酮的正己烷重复提取一次，合并2次提取液，混勻。(3)移取提取液于氮吹仪上吹干，用PBS(0. 01M)重溶。(4)移取50yL样品溶液，直接加样于微孔中，进行ELISA测定。(5)回收率的计算根据不同添加浓度的样品0D值计算相应的抑制率，再根据相 应的抑制率从标准曲线上查到各自的浓度。检测浓度与真实浓度之比为对应浓度的回收 率。试验结果如下标准曲线本实验所获得的抗原检测的线性范围为0. 07 17. 5ng/mL，具体请见 图1。灵敏度灵敏度是所得90%最大吸光值所对应的标准品的浓度，即IC9Q为 0. 028ng/mLo交叉反应率(CR % ):利用罗丹明B结构类似物进行交叉反应研究。
。由下表可知，此抗体特异性很好。符合多残留ELISA方法检测的要求。表1交叉反应率的测定 回收率测定
加标样品回收后进行ELISA检测，回收率分别是67 % 89 %，变异系数小于20 %。表2加标回收率的测定(n = 5)
权利要求
一种罗丹明B酶联免疫检测方法，其特征在于利用合成的罗丹明B免疫原免疫健康白兔得到多克隆抗体，以罗丹明B为标准品，以罗丹明B半抗原与OVA的偶联物作为包被原，建立调味品中的罗丹明B的间接竞争酶联免疫检测方法；步骤如下(1)以0.05M的碳酸盐缓冲溶液稀释罗丹明B-OVA包被原，稀释质量比为1∶1000～1∶64000，稀释后加入酶标板中，每孔100μL；4℃孵育过夜，封闭、洗涤；(2)将系列浓度梯度的罗丹明B标准品加入酶标板中，每孔50μL；同时加入以抗体稀释液稀释为1∶1000～1∶4000的多克隆抗体，每孔50μL；37℃竞争0.5h后以含吐温的磷酸盐缓冲液PBST洗涤3～5次，加入以抗体稀释液稀释为1∶1000～1∶3000的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR-HRP，每孔100μL，37℃作用0.5h后以PBST洗涤3～5次；所述PBST溶液含0.05％Tween-20的0.01M PBS溶液；所述封闭液含0.1％明胶的pH 9.6、0.05M碳酸盐缓冲溶液；所述抗体稀释液含0.1％明胶的PBST溶液；(3)配置显色液A液配方为每100mL超纯水中加入0.933g柠檬酸，3.68gNa2HPO4·12H2O，18μL30％H2O2；B液配方为60mg四甲基联苯胺溶于100mL乙二醇中；使用前将A液与B液以5∶1体积比混合；(4)加入显色液100μL，37℃显色15min；加入终止液2M硫酸溶液，酶标仪450nm测吸光值OD；根据不同浓度罗丹明B标准液的吸光值绘制罗丹明B浓度-吸光值标准曲线；(5)调味品的提取液作为样品溶液，直接加样于微孔中，进行ELISA测定，酶标仪450nm测吸光值OD，对照标准曲线测出调味品的罗丹明B浓度。
2.根据权利要求1所述的罗丹明B酶联免疫检测方法，其特征在于调味品的提取方法为(1)以l-5ng/g水平的罗丹明B加入阴性样品，在室温下至少静置15min；(2)取辣椒粉lg，加入IOmL含20%丙酮的正己烷，振摇lOmin，静置或过滤使分离出上 层清液；残渣加入IOmL含20%丙酮的正己烷重复提取一次，合并2次提取液，混勻；(3)移取提取液于氮吹仪上吹干，用0.OlM的PBS重溶；(4)移取50μ L重溶液，作样品溶液，直接加样于微孔中，进行ELISA测定。
全文摘要
一种罗丹明B酶联免疫检测方法，属于酶联免疫检测(ELISA)技术领域。本发明公开了一种罗丹明B多克隆抗体酶联免疫检测方法，利用合成的罗丹明B免疫原免疫健康的新西兰大白兔得到多克隆抗体，以罗丹明B为标准品，以罗丹明B半抗原与OVA的偶联物作为包被原，建立了罗丹明B的间接ELISA方法，为罗丹明B的残留检测提供了快速高效的检测方法，由于采用的是多克隆抗体，费用较低并且稳定性和重复性较好。检测限(IC90)为0.028ng/mL、半数抑制量(IC50)为1.3ng/mL和检测范围(IC20～IC80)为0.07～17.5ng/mL。免疫反应的高特异性和亲和性使ELISA检测罗丹明B具有极高的选择性和灵敏度。
文档编号G01N33/531GK101871936SQ201010196590
公开日2010年10月27日 申请日期2010年6月3日 优先权日2010年6月3日
发明者刘微波, 宋珊珊, 林菲, 胥传来, 赵书阁, 赵媛 申请人:江南大学