专利名称：用于样品中梨源性成分检测的引物及方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于样品中梨源性成分检测的寡核苷酸引物，用于测定样品中梨源性成分的实时荧光PCR检测方法，用于快速检测样品中梨源性成分的PCR检测试剂盒，以及样品中梨源性成分的特异性寡核苷酸引物和探针在检测样品中梨源性成分中的应用。
背景技术：
梨是我国继苹果、柑橘之后的第三大水果，其营养丰富，具多种对身体有益成分。 近年来研究证明梨还具有防癌作用，因此梨汁及其相关饮料的贸易量和消费量一直在以较高的速度增长，具有巨大的发展空间和增长潜力。随着人民生活水平的提高和需求的不断变化，梨汁及其饮料产品日趋多元化。然而，由于全球果汁产量受原料来源、原料价格、产品品质等诸多因素的制约，一些不法厂商通过勾兑果汁、以次充好、虚假标注等手段制作的掺假梨汁充斥市场，严重地损害了消费者的利益和健康，也使得食品成分、品质和质量安全等问题逐渐凸现。食品过敏是一个世界性的公共卫生问题，据估计全世界有近2%的成年人和4 % 6 %的儿童患有食物过敏。梨等水果中含有的类甜蛋白Thaumat in-Like Protein(TLP)作为梨的一种重要过敏源，逐渐受到关注。TLP目前已从多种食物中提取出来，如梨、苹果、桃、小麦、番茄和马铃薯等，它是植物在受到病原微生物侵害时体内诱导产生的病程相关蛋白(I3Rs)家族的重要成员，参与多种真菌抗性反应过程。目前市场上果汁饮料中的类甜蛋白成分可能因为标识不清或掺杂造假，造成部分人群对其过敏而侵犯消费者权益。因此，对各类果汁饮料等食源性过敏源的检测也显得尤为重要。近些年，随着市场果汁品种的丰富，加工手段的多样化，添加剂的广泛使用，如何快速鉴别果汁产品的真实成分已成为食品安全的重点和难点。这主要是由于水果中所含化学成分易受品种、产地、气候和采收时间等因素的影响，成分非常复杂且大多数经过了破碎、搅拌、高温、高压和化学以及生物反应等多种多样的加工过程，并且用于果汁掺杂又多是与其组成比较接近、或某些性质比较接近的物质，通常难以用一般化学方法直接鉴别真伪；尤其是现在的食品掺伪水平和手段越来越高明，使许多检测鉴伪的传统方法不再有效。从果汁成分鉴定方法来看，有感官评定法、仪器检测法、同位素法、免疫法、分子生物学法等；从鉴伪的对象来看，可概括为基因表达的结果(表现型)和DNA(基因型)两方面，以基因表达的结果(表现型)为基础的分子检测鉴别技术，包括色谱技术、电泳技术、人工神经网络技术、蛋白质芯片-飞行质谱技术等，以DNA水平为基础的分子检测鉴别技术， 包括PCR及其相关技术(RFLP、RAPD、AFLP、SSR和ISSR)和微卫星标记、基因芯片技术以及 DNA序列分析等。现代生物技术以其方便、准确、迅速、简洁的特点，从基因水平分析食品原料和产品的特性和来源，灵敏度更高、特异性更强，其结果为证明食品的真伪提供了真实、可靠的依据，给食品种类鉴别、产品溯源等食品鉴伪研究注入了新鲜血液，已成为近年来世界各国的许多机构和学者致力研究的方向。但是，分子生物学技术在果汁鉴伪方面的应用还处于初步探索阶段，分子生物学技术在梨汁鉴伪中尚未见研究报道。聚合酶链式反应(PCR)是通过扩增待测样品的DNA，使其能够从最初的微小数量增至足以达到检测限量的巨大数量。PCR方法已用于多种多样的基因检测中。实时荧光PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析，使PCR技术从定性水平发展到定量水平。近几年，在分子生物学研究中，利用定量PCR对基因表达结果进行检测，获得了应用。由于其大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性、并能有效地减少实验过程中产生污染的危险，目前已广泛应用于各个领域。目前，国内外尚未见报道能够快速、简单、特异且灵敏地检测样品中梨源性成分的方法以及试剂盒。因此，本领域需要一种快速、特异性好、灵敏度高的样品中梨源性成分的检测方法以及用于快速检测样品中梨源性成分的试剂盒，进行样品中梨源性成分的检测。
发明内容
本发明的一个目的在于，提供快速检测样品中梨源性成分的特异性寡核苷酸引物。本发明的另一个目的在于，提供快速测定样品中梨源性成分的PCR检测方法。本发明的再一个目的在于，提供用于快速检测样品中梨源性成分的PCR检测试剂
品.ο本发明的还一个目的在于，提供样品中梨源性成分的特异性寡核苷酸引物和探针在检测样品中梨源性成分中的应用。针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案根据本发明的一个实施方案，本发明提供用于实时荧光PCR方法检测样品中梨源性成分的特异性寡核苷酸引物对，所述引物对是根据类甜蛋白基因内含子和核糖体DNA的ITS区序列在不同植物物种中具有差异性的特点而设计的。在一个实施方案中，其中所述引物对选自 No2-F CCACACTAGATTGTAATACTGTTAGTGA (SEQ ID NO 1)和 No2-R :GGTTAGTTCACTGATATTTATCCG(SEQ ID NO :2) ；No3_F :GACCTGCCAATGTTAATGC(SEQ ID NO 3)禾口 No3-R :CAGCAGTACTTCGAATCACC(SEQ ID NO :4)；以及 Trnk-F GTTGAATACTCAGTTGATCGACCC(SEQ ID NO :5)和 Trnk-R :CGATCGTAGAAATGGAAATTCTA(SEQ ID NO 6)。在一个优选的实施方案中，所述用于实时荧光PCR方法检测样品中梨源性成分的特异性寡核苷酸引物对是SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2。在另一个优选的实施方案中，所述用于实时荧光PCR方法检测样品中梨源性成分的特异性寡核苷酸引物对是SEQ ID N0:3和 SEQ ID NO :4。在另一个优选的实施方案中，所述用于实时荧光PCR方法检测样品中梨源性成分的特异性寡核苷酸引物对是SEQ ID NO 5和SEQ ID NO :6。根据本发明的另一个实施方案，本发明提供样品中梨源性成分的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括使用针对样品中梨源性成分的特异性寡核苷酸引物对，所述引物对是根据类甜蛋白基因内含子和核糖体DNA的ITS区序列在不同植物物种中具有差异性的特点而设计的。在一个实施方案中，在本发明的样品中梨源性成分的实时荧光PCR检测方法中所使用的特异性引物对选自SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2 ；SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4 ；以及 SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO :6。在本发明方法的一个优选的实施方案中，所述实时荧光PCR方法为STOR荧光染料法。在本发明方法的另一个优选的实施方案中，所述实时荧光PCR方法为Taqman荧光探针法。在一个实施方案中，在本发明的检测样品中梨源性成分的Taqman荧光探针法中，还使用特异性的探针。在一个优选的实施方案中，所使用的探针序列为No3-P :FAM-CGGCTGA TGGGACTGTCATCGCTTG-TAMAR(SEQ ID NO :7)。在一个实施方案中，本发明的样品中梨源性成分PCR检测方法还进一步包括提取样品总DNA的步骤。在一个实施方案中，所述DNA提取步骤，通过检测植物本身所具有的内源参照基因叶绿体trn基因，来测试样品总DNA的提取质量。在一个优选的实施方案中，所述内参基因植物叶绿体trn基因的通用引物序列为 Nol-F :CTTGATTTTACCAAAGATGATGA(SEQ ID NO :8)和 No I-R :TTCTTCGCATGTACCCGCAG(SEQ ID NO 9)。在本发明的样品中梨源性成分PCR检测方法中，所使用的对照样品包括苹果汁、 桃汁、橙汁、猕猴桃汁、番茄汁等。在一个实施方案中，使用梨源性成分的特异性寡核苷酸引物对和植物通用扩增引物进行双重PCR扩增。在一个优选的实施方案中，所使用的梨源性成分的特异性寡核苷酸引物对为SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2，所使用的植物通用扩增引物为SEQID NO :8和SEQ ID NO :9。在另一个优选的实施方案中，所使用的梨源性成分的特异性寡核苷酸引物对为SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4，所使用的植物通用扩增引物为SEQ ID NO :8和SEQ ID NO :9。在另一个优选的实施方案中，所使用的梨源性成分的特异性寡核苷酸引物对为SEQ ID NO 5和SEQ ID NO :6，所使用的植物通用扩增引物为SEQ ID NO 8和 SEQ IDNO :9。根据本发明的另一个实施方案，本发明提供样品中梨源性成分的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括使用本发明的针对样品中梨源性成分的特异性寡核苷酸引物对的组合。在一个实时方案中，根据本发明的实时荧光PCR检测方法，还包括使用内参基因植物叶绿体trn基因通用引物序列SEQ ID NO 8和SEQ ID NO :9，通过检测植物本身所具有的内源参照基因叶绿体trn基因，来测试样品总DNA的提取质量。在本发明的样品中梨源性成分的PCR检测方法中，还进一步包括对PCR扩增条件进一步优化的步骤。在一个优选的实施方案中，在PCR扩增条件优化的步骤中，使用不同的退火温度进行扩增。在一个优选的实施方案中，所述PCR扩增条件是95°C，IOmin ；95°C 15s ；60°C，lmin。根据本发明的另一个实施方案，本发明提供快速检测样品中梨源性成分的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的用于实时荧光PCR方法检测样品中梨源性成分的特异性寡核苷酸引物对和使用说明书。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包括用于样品DNA提取的试剂和用于PCR反应的试剂。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于样品中梨源性成分PCR扩增的条件的描述。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的说明书中给出的PCR扩增条件是95°C，IOmin ；95°C 15s ；60°C，lmin。根据本发明的再一个实施方案，本发明提供本发明的用于实时荧光PCR方法检测样品中梨源性成分的特异性寡核苷酸引物对在检测样品中梨源性成分中的应用。在一个优选的实施方案中，本发明提供样品中梨源性成分的特异性寡核苷酸引物对SEQ ID N0:1和 SEQ ID NO 2 ；SEQ IDNO 3 和 SEQ ID NO 4 ；或 SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO 6 在检测样品中梨源性成分中的应用。
本发明以梨的DNA为检测基础，根据类甜蛋白基因内含子和核糖体DNA的ITS区序列在不同植物物种中具有差异性的特点，克隆了梨类甜蛋白基因内含子及其核糖体DNA 的ITS1-5. 8S-ITS2区序列。根据这些序列设计引物，利用实时荧光PCR法检测样品中的梨源性成分。实时荧光定量PCR即在常规PCR方法的基础上，加入荧光标记的探针或者荧光染料，随着PCR产物的积累，探针或染料发出的荧光信号增强，而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每产生一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此可以实时监控整个PCR反应过程，并最终检测出待测样品的初始拷贝数， 从而可检测待测样品中所含梨源性成分。本发明的实时荧光PCR检测方法采用完全闭管检测，无需PCR后处理，避免了交叉污染和假阳性。本发明的方法巧妙地运用了 PCR技术的DNA高效扩增、核酸杂交的特异性和荧光检测技术的快速和敏感性，具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。本发明的按照引物序列制成的试剂盒，用于此类产品的定性、定量检测，具有灵敏度高、特异性强、结果稳定可靠且避免交叉污染造成假阳性的优点。使用本发明的PCR检测方法和PCR 检测试剂盒，既可用于定性检测，又可用于定量检测，其简单、快速、特异且灵敏的特点适合用于国内外市场上梨汁及其相关饮料的真伪鉴别和过敏源成分的检测等。
图1是显示待测样品DNA提取效果的凝胶电泳图，其中使用植物通用引物检测，各泳道的样品如下=M =DNA分子量标记(2000bp) ；1 雪花梨；2 汇源梨汁；3 海太梨汁；4 汇源梨果肉饮料；5 茹梦牌梨汁；6 乐天梨汁；7 国光苹果；8 光明苹果汁；9 汇源苹果汁； 10 大湖苹果汁；11 乐活滋100%苹果汁；12 水蜜桃；13 汇源桃汁；14 汇源桃果肉饮料；15 茹梦牌桃汁；16 海太桃汁；17 橙汁；18 猕猴桃汁；19 番茄汁；20 空白对照(无菌水)。图2是显示实时荧光PCR检测样品中梨的类甜蛋白基因的结果，其中荧光曲线从 1-12依次为阳性对照(雪花梨)、汇源梨汁、海太梨汁、汇源梨果肉饮料、茹梦牌梨汁、乐天梨汁、苹果汁、桃汁、橙汁、猕猴桃汁、番茄汁及空白对照。图3是显示通过实时荧光PCR检测样品中梨的ITS区序列的结果，其中荧光曲线 1-12依次为阳性对照(雪花梨)、汇源梨汁、海太梨汁、汇源梨果肉饮料、茹梦牌梨汁、乐天梨汁、苹果汁、桃汁、橙汁、猕猴桃汁、番茄汁及空白对照。图4是显示实时荧光PCR特异性检测梨的ITS区序列的结果，其中荧光曲线从 1-21依次为雪花梨、鸭梨、苹果梨、南果梨、黄冠梨、砀山梨、国光、嘎啦、乔纳金、富士、金帅、 水蜜桃、平谷甜桃、圆黄桃、蟠桃、草莓、葡萄、番茄、猕猴桃、甜橙及空白对照(ddH20)。图5是以雪花梨为例检测梨特异性引物探针组合的灵敏度的结果，其中1-8为进行实时荧光PCR扩增的DNA溶液的浓度，依次为IOOng/μ L、10ng/μ L、lng/μ L、100pg/μ L、 10pg/yLUpg/yL,0. Ipg/μ L 以及空白对照。
具体实施例方式通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。实施例1本实施例为通过使用植物通用引物测试样品总DNA的提取质量。通过检测植物本身所具有的内源参照基因叶绿体trn基因，可以测试样品总DNA 的提取质量。本实施例中所使用的用于检测样品中植物源性成分的植物叶绿体trn基因通用引物序列为 SEQ ID NO 8 和 SEQ ID NO :9。在本实施例中，检测了雪花梨、汇源梨汁(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、海太梨汁(海太，韩国)、汇源梨果肉饮料(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、茹梦牌梨汁 (大湖(天津)新鲜食品果汁有限公司，中国)、乐天梨汁(乐天，韩国)、国光苹果、光明苹果汁(光明乳业股份有限公司乳品工厂，中国)、汇源苹果汁(北京汇源食品饮料有限公司， 中国)、大湖苹果汁(大湖(天津)新鲜食品果汁有限公司，中国)、乐活滋100%苹果汁 (北京乐活滋科技发展有限公司，中国)、水蜜桃、汇源桃汁(北京汇源食品饮料有限公司， 中国)、汇源桃果肉饮料(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、茹梦牌桃汁(大湖(天津) 新鲜食品果汁有限公司，中国)、海太桃汁(海太，韩国)、橙子、猕猴桃、番茄的总DNA的提取质量。如图1所示，用植物通用引物扩增待测样品的DNA时均能在约159bp处出现条带， 表明所有待测样品DNA提取成功。实施例2本发明的发明人首次通过PCR克隆并测序了梨的类甜蛋白基因内含子序列。本实施例为通过PCR克隆测序获得梨的类甜蛋白基因内含子序列。根据类甜蛋白基因内含子在不同植物品种中具有差异性的特点，采用苹果类甜蛋白基因序列(Genbank No. AY792604)设计上下游引物扩增黄冠梨。按照Wizard Gel Extraction Kit (!Iomega，美国)的操作说明对黄冠梨PCR产物进行纯化、回收。按TaKaRa PMD19-T Vector试剂盒(TaKaRa，日本)的说明书将纯化产物与pMD19_T Vector连接，连接体系 10 μ L，其反应组分为:pMD19-T Vector 1 μ L、PCR 产物 2 μ L、ddH20 2 μ L,Solution I 5 μ L，同时设置阳性和阴性对照。将连接体系置于室温(22-37°C)反应30min，反应结束后，立即置于冰上。加连接产物于50 μ LTOP感受态细胞中，轻弹混勻，冰浴30min，42°C准确热激90s，立即置于冰上2min，然后加入800 μ L已灭过菌的脑心浸液，37°C、200r/min振荡培养lh。5000r/min低速离心lmin，弃600 μ L上清，将沉淀混勻，取100 μ L混合液涂于 Amp+、X-Gal和IPTG处理的营养琼脂平板上，37°C过夜培养后置于4°C冰箱中4h。挑取单菌落白斑，在含有终浓度200 μ g/mL的Amp的脑心浸液中在37°C、200r/min振荡过夜培养。(1)阳性克隆鉴定挑取单个白色克隆，进行菌落PCR反应，体系为25yL，其组份为反应IOXBuffer 2. 5μ L.dNTPs 1 μ L、上下游引物各0. 5 μ L、Taq酶0. 2 μ L，挑取单菌落作为模板，加水补至25 μ L。反应程序为94°C 5min，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin，40个循环。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。(2)测序确定阳性克隆后，挑取该菌落，在含有终浓度200μ g/mL Amp的5 μ L脑心浸液中在37°C、200r/min振荡过夜培养。取ImL菌液送生物公司进行测序鉴定。PCR克隆测序得到的梨类甜蛋白基因内含子部分序列如下
AAGATGAGAGAGACCAAGTAGCTTCCCTCCTCGGCCTCACCTTGGCCATACTCTTCTTCTCAGGTAATA TTATACAAACTTCTCATTATATTTTTTGTTCTTTTTGTTTCATATTAGTCTCTAGTATATTGTATGCATGCCTGCCG GATGCAAATATGAGAGGGGTTAGTCCACACTATATTGTAATACTGTTAGTGAAAGTAGGAAGTCTAAGAGAGAATAA TGATGATGGATAATTCCGTGACGTCTACTAATAATTTTATTAAAACAAGGAGTACTAGTACTTTTTAAAAGGATAC CATAAAAGTTCTCAATCCGGATAAATATAAGTGAACTAACCAATGCTGCGAACATGAGATTAGATATGTTTATMT TTGTATGCAGATTTTTCAGTATCAATATTCTTAGTATCTAGTTCTATGTTGAACATAAATGCAGGTGCACATGCAGC GAAAATCAC(SEQ ID NO 10)实施例3本实施例为通过使用梨的类甜蛋白基因的引物序列经实时荧光PCR特异性检测样品中梨源性成分的类甜蛋白基因序列。STOR荧光染料法STOR Green是高灵敏的DNA 荧光染料，在各种分析中至少可检出20pgDNA。STOR Green染料与双链DNA的亲和力非常高，在PCR反应中与产物dsDNA结合后荧光信号会增强800-1000倍且对分子生物学中常用的酶没有抑制作用。STOR Green PCR反应体系为Faststart Universal SYBRGreen Master (Roche) 12. 5 μ L ；上下游引物(10 μ mol/L)各 0. 5 μ L ；DNA 模板 5 μ L (约 50ng)，用无菌水补至总体系为25 μ L0采用Bio-Rad iQTM5多色实时PCR仪进行PCR扩增及结果分析，扩增条件如下95°C预变性IOmin ；95°C 10s,58°C 30s, 40个循环，在PCR反应后进行熔解曲线分析。引物序列为:SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :2。所使用的检测主要仪器微量移液器(10μ LUOOy LUOOOy L Eppendorf)、荧光定量 PCR 仪 (Mastercycler 印 realplex4 Eppendorf)、高速台式离心机(Picol7 Thermo)、高速粉碎机(IKA-WEARKE GERMANY)、凝胶成像系统(Gene Genius)、电泳仪(DYY22C型，北京六一仪器厂)、核酸蛋白分析仪(DYY-6C，北京六一仪器厂)、冷冻干燥机(Modulyod Freeze Dryer Thermo)、制冰机(XB70GRANT)等。检测主要试剂Taq酶、dNTPs、10XPCR Buffer、溴化乙锭、DNA Ladder Marker(2000) (Takara)购自上海生工公司；TaciMan Universal SYBR Green Master 购自 Roche 公司；引物(SEQ ID NO 1 ；SEQ ID NO :2)由上海奥科生物科技有限公司合成等。检测主要步骤IDNA 提取待测样品为雪花梨、汇源梨汁(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、海太梨汁 (海太，韩国)、汇源梨果肉饮料(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、茹梦牌梨汁(大湖 (天津)新鲜食品果汁有限公司，中国)、乐天梨汁(乐天，韩国)、苹果汁(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、桃汁(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、橙汁(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、猕猴桃汁(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、番茄汁(北京汇源食品饮料有限公司，中国)。取30mL果汁至一洁净培养皿中，抽真空冻干；称取0. 2g冷冻干物质至一洁净 50mL 离心管中，加入 5mLCTAB 裂解液(2% CTAB (ff/V), 0. lmol/LTris-HCl, 20mmol/L EDTA, 1. 4mol/LNaCl)，65°C 2h，间期不断混勻几次；8000rpm 15min,取ImL上清液至1支洁净2. OmL离心管中，加入700 μ L氯仿，剧烈混勻30s, 14500rpm IOmin,分别取650 μ L上清液至洁净 2. OmL 离心管中，加入 1300 μ L CTAB 沉淀液(0. 5% CTAB (W/V), 0. 04mol/LNaCl)， 剧烈混勻30s，室温静置Ih ； 14500rpm20min，弃上清液，加入350 μ L 1. 2Μ NaCl，剧烈振荡 30s，再加入350 μ L氯仿，剧烈混勻30s, 14500rpm IOmin ；分别取上清液320 μ L，加入0. 8 倍体积异丙醇，混勻后，-200C lh，14500rpm 20min，弃上清液，加入500 μ L 70%乙醇，混勻后，14500rpm 20min，弃上清液，晾至风干，加入30 μ L ddH20溶解，4°C储存备用。2实时荧光PCR检测所用引物SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :2。3实时荧光PCR反应体系Faststart Universal SYBR Green Master 12. 5μ L上游引物(10ymol/L)0·5μ L下游引物(10ymol/L)0·5μ L模板 DNA 5μ L加ddH20至总体积为25 μ L注每次PCR检测均设立相应的空白对照(用配制反应体系的超纯水代替DNA模板，检测试剂是否受到污染)；4实时荧光PCR反应参数95 "C IOmin95 "C 15s58 °C 30s40个循环反应。注不同仪器应将PCR各试剂及反应参数做适当调整。如图2所示，利用实时荧光PCR检测样品中梨的类甜蛋白基因时，雪花梨(阳性对照)、汇源梨汁(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、海太梨汁(海太，韩国)、汇源梨果肉饮料(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、茹梦牌梨汁(大湖(天津)新鲜食品果汁有限公司，中国)、乐天梨汁(乐天，韩国)样品PCR扩增片段的熔解曲线峰值均在71. 63士 1. 0°C, 而其他果汁(苹果汁(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、桃汁(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、橙汁(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、猕猴桃汁(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、番茄汁(北京汇源食品饮料有限公司，中国))及空白对照均无此熔解曲线峰值，表明该引物能有效检测样品中的梨源性成分。实施例4与根据实施例3所述的方法相同，只是以待测样品DNA为模板，采用类甜蛋白基因的引物序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2以及植物通用扩增引物对SEQ ID NO :8和SEQ ID NO :9，进行双重PCR扩增。实施例5本实施例为通过使用梨的ITS基因的引物序列经实时荧光PCR特异性检测样品中梨源性成分的序列。Taqman荧光探针法=TaqMan技术是一种对单管PCR产物进行实时荧光定量检测的技术，在普通PCR扩增系统中，加入一个与靶基因序列特异互补的双荧光标记探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定 9量分析。定量步骤①确定CT值(C表示循环数(Cycle)，T表示荧光域值(Threshold)，即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数；②利用标准曲线对未知样品进行定量测定。获得未知样品的CT值后，从标准曲线计算出该样品的起始拷贝数。每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，即起始拷贝数越多，CT值越小。 反应体系为TaqMan Universal probe Master 12.5yL;探针(10 μ mol/L) 0. 5 μ L ；上、下游引物(10 μ mol/L)各0. 5 μ L ；模板DNA 5 μ L ；加ddH20至总体积为25 μ L。反应程序为 950C IOmin ；95°C 15s ；60°C Imin0所使用的检测样品中梨源性成分的类甜蛋白基因引物序列为上游引物SEQ ID NO :3;下游引物SEQ ID NO :4;探针SEQ ID NO :7。TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。 荧光基团FAM[6-羧基荧光素6-carboxy fluo-rescein]和TAMRA连接在探针的5'末端， 而淬灭剂TAMAR[6-羧基罗丹明M-carboxy tetramethyl rhodamine]则在3'末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3'端的淬灭剂接近而淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5'外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。所使用的检测主要仪器微量移液器(10μ L、100 μ L、1000 μ L Eppendorf)、荧光定量 PCR 仪(ABI 7700 Applied Biosystems，USA))、高速台式离心机(Pico 17 Thermo)、高速粉碎机(IKA-WEARKE GERMANY)、凝胶成像系统(Gene Genius)、电泳仪(DYY22C型北京六一仪器厂)、核酸蛋白分析仪(DYY-6C北京六一仪器厂)、冷冻干燥机(Modulyod Freeze Dryer Thermo)、制冰机 (XB70GRANT)等检测主要试剂Taq 酶、dNTPs、10XPCR Buffer、溴化乙锭、DNA LadderMarker (2000) (Takara)购自上海生工公司；TaqMan Universal probe Master购自ABI公司；引物(上游引物SEQ ID NO :3;下游引物SEQ ID NO :4;探针SEQ ID NO :7。)由上海奥科生物科技有限公司合成等。检测主要步骤IDNA 提取待测样品为雪花梨、汇源梨汁(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、海太梨汁 (海太，韩国)、汇源梨果肉饮料(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、茹梦牌梨汁(大湖 (天津)新鲜食品果汁有限公司，中国)、乐天梨汁(乐天，韩国)、苹果汁(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、桃汁(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、橙汁(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、猕猴桃汁(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、番茄汁(北京汇源食品饮料有限公司，中国)。取30mL果汁至一洁净培养皿中，抽真空冻干；称取0. 2g冷冻干物质至一洁净 50mL离心管中，加入5mLCTAB裂解液，65°C 2h，间期不断混勻几次；8000rpm 15min，取ImL 上清液至1只洁净2. OmL离心管中，加入700 μ L氯仿，剧烈混勻30s, 14500rpm IOmin,分别取650 μ L上清液至洁净2. OmL离心管中，加入1300 μ L CTAB沉淀液，剧烈混勻30s，室温静置Ih ； 14500rpm 20min，弃上清液，加入350 μ L 1. 2MNaCl，剧烈振荡30s，再加入350 μ L 氯仿，剧烈混勻30s，14500rpm IOmin ；分别取上清液320 μ L，加入0. 8倍体积异丙醇，混勻后，-200C lh, 14500rpm 20min，弃上清液，加入 500 μ L 70% 乙醇，混勻后，14500rpm20min，弃上清液，晾至风干，加入30 μ L ddH20溶解，4°C储存备用。2实时荧光PCR检测所用引物和探针引物序列为上游引物SEQ ID NO 3 ；下游引物SEQ ID NO 4 ；探针SEQ ID NO 7 ；3实时荧光PCR反应体系TaqMan Universal PCR Master Mix 12. 5μ L探针(10μ mol/L) 0. 5 μ L上游引物(10ymol/L)0·5μ L下游引物(10ymol/L)0·5μ L模板 DNA 5μ L加ddH20至总体积为25 μ L注每次PCR检测均设立相应的空白对照(用配制反应体系的超纯水代替DNA模板，检测试剂是否受到污染)；4实时荧光PCR反应参数95 "C IOmin95 "C 15s60 °C Imin注不同仪器应将PCR各试剂及反应参数做适当调整。如图3所示，利用实时荧光PCR检测样品中梨的ITS基因序列时，雪花梨(阳性对照)、汇源梨汁(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、海太梨汁、汇源梨果肉饮料(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、茹梦牌梨汁(大湖(天津)新鲜食品果汁有限公司，中国)、 乐天梨汁(乐天，韩国)样品均出现PCR扩增，而其他果汁苹果汁(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、桃汁(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、橙汁(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、猕猴桃汁(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、番茄汁(北京汇源食品饮料有限公司，中国)及空白对照均未出现，表明该引物能有效检测出样品中的梨源性成分。实施例6与根据实施例5所述的方法相同，只是以待测样品DNA为模板，采用类甜蛋白基因的引物序列SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4以及探针SEQ IDNO 7和植物通用扩增引物对SEQ ID NO 8, SEQ ID NO :9，进行双重 PCR 扩增。实施例7本发明的发明人首次克隆并测序了梨的叶绿体Trnk基因和matK基因问区的序列。本实施例为通过PCR克隆测序获得苹果和梨的叶绿体Trnk基因和matK基因间区的序列。根据植物Trnk基因和matK基因间区的序列在不同植物品种中具有差异性的特点，采用苹果类甜蛋白基因序列(Genbank No. AY792604)设计上下游引物扩增梨和苹果的 DNA。按照Wizard Gel Extraction Kit (Promega，美国)的操作说明对梨和苹果的PCR产物进行纯化、回收。按TaKaRapMD 19-T Vector试剂盒(TaKaRa，日本)的说明书将纯化产物与pMD19-TVector连接，连接体系10 μ L，其反应组分为pMD19_T Vector 1 μ L、PCR产物2 μ L、ddH20 2 μ L、Solution I 5 μ L,同时设置阳性和阴性对照。将连接体系置于室温(22-370C )反应30min，反应结束后，立即置于冰上。加连接产物于50 μ LTOP感受态细胞中，轻弹混勻，冰浴30min，42°C准确热激90s，立即置于冰上2min，然后加入800 μ L已灭过菌的脑心浸液，37°C、200r/min振荡培养Ih0 5000r/min低速离心lmin，弃600 μ L上清， 将沉淀混勻，取100 μ L混合液涂于Amp+、X-Gal和IPTG处理的营养琼脂平板上，37°C过夜培养后置于4°C冰箱中4h。挑取单菌落白斑，在含有终浓度200 μ g/mL的Amp的脑心浸液 37°C、200r/min振荡过夜培养。(1)阳性克隆鉴定挑取单个白色克隆，进行菌落PCR反应，体系为25yL，其组份为反应IOXBuffer 2. 5μ L.dNTPs 1 μ L、上下游引物各0. 5 μ L、Taq酶0. 2 μ L，挑取单菌落作为模板，加水补至25 μ L。反应程序为94°C 5min，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin，40个循环。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。(2)测序确定阳性克隆后，挑取该菌落，在含有终浓度200μ g/mLAmp的5μ L脑心浸液中37°C、200r/min振荡过夜培养。取ImL菌液送生物公司进行测序鉴定。PCR克隆测序得到苹果和梨的叶绿体Trnk基因和matK基因间区的部分序列如下苹果CCTATACACGACTCTAAGAAAGTTGAATACTCAGTTGATCAACCCTTAATCTTACTGGATGAACATTTC ATAATAGAAATAAATTAATTTTTTGTTATCTCTTAATTTTTTGTTATCTCTTCATTATTTAATATTTAAATAGAATT TCCATTTCTACGATCGCATAACCAATTATTCA(SEQ ID NO :11)梨CCTATACACGACTTTAAGAAAGTTGAATACTCAGTTGATCAACCCTTAATCTTACTGGATGAACATTT CATAATAGAAATAAATTAATTTTTTGTTATCTCTTCATTATTTAAATAGAATTTCCATTTCTACGATCGCATAACC AATTATTCA(SEQ ID NO 12)通过叶绿体Trnk基因和matK基因间区的PCR引物定量检测样品中梨汁相对含量，用于定量检测苹果和梨混合样品中梨汁相对含量的叶绿体Trnk基因和matK基因间区的PCR引物为SEQ ID NO 5SEQ ID NO :6。以此对引物扩增混合样品的DNA，苹果成分所扩增的PCR产物长度为141bp，梨汁成分所扩增的PCR产物长度为116bp ；通过在2. 5%的琼脂糖或5%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，可以区分两种PCR片段，并根据两种PCR片段的相对丰度定量确定混合汁中苹果和梨所占的比例，但未曾尝试使用此引物进行实时荧光PCR。实施例8本发明的发明人通过如下试验对梨的引物和探针进行了特异性和灵敏度验证。选取雪花梨、鸭梨、苹果梨、南果梨、黄冠梨、砀山梨等6种梨作为验证样品，国光、 嘎啦、乔娜金、富士、金帅、水蜜桃、平谷甜桃、圆黄桃、蟠桃、草莓、葡萄、番茄、猕猴桃、胡萝卜等作为参照样品进行实时荧光PCR反应，以确定所设计的引物探针组合对梨的特异性。如图4所示，利用实时荧光PCR特异性检测梨的ITS基因时，雪花梨(阳性对照)、 鸭梨、苹果梨、南果梨、黄冠梨、砀山梨等均出现典型的扩增曲线，而其它样品国光、嘎啦、 乔纳金、富士、金帅、水蜜桃、平谷甜桃、圆黄桃、蟠桃、草莓、葡萄、番茄、猕猴桃及空白对照(ddH20)均未出现扩增曲线，充分说明本实验设计的引物探针对梨样品表现较好的特异性。为确定梨特异性引物探针组合的灵敏度，以雪花梨为例，将提取的DNA溶液用分别稀释为 IOOng/ μ L、IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L、0. Ipg/ μ L 的浓度，分别按上述条件进行实时荧光PCR扩增，结果如图5所示。雪花梨DNA浓度为IOOng/ μ L、IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L时有特异性扩增曲线，而浓度降至 lpg/μ L以下时，无特异性扩增曲线出现。实验结果表明建立的实时荧光PCR检测方法能够检出梨成分的含量为lpg/yL。实施例9本实施例提供快速检测样品中梨源性成分的试剂盒。所述试剂盒包括引物对SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6和引物对SEQ IDNO :8、SEQ ID NO :9，以及使用说明书，其中引物对SEQ ID NO 5,SEQID NO :6是用于PCR检测样品中梨源性成分的特异性寡核苷酸引物对，所述使用说明书中给出了 PCR扩增条件，该条件为95°C， IOmin ；95°C，30s, 55°C，30s, 72°C，30s ；72°C，5min。对于不同仪器，反应参数做适当调整。实施例10本实施例提供快速检测样品中梨源性成分的试剂盒。所述试剂盒包括引物对SEQ ID NO =USEQ ID NO :2和引物对SEQ IDNO :8、SEQ ID NO :9，以及使用说明书，其中引物对SEQ ID NO :1和SEQID NO :2是用于实时荧光PCR检测样品中梨源性成分的特异性寡核苷酸引物对，SEQ ID NO 8, SEQ ID NO :9是植物通用扩增引物，所述使用说明书中给出了 PCR扩增条件，该条件为95°C，IOmin ；95°C，15s ；58°C，30s。 对于不同仪器，反应参数做适当调整。实施例11本实施例提供快速检测样品中梨源性成分的试剂盒。所述试剂盒包括引物SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4以及探针SEQ IDNO 7和引物对SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9，以及使用说明书，其中引物对SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4以及探针SEQ ID NO :7是用于实时荧光PCR检测样品中梨源性成分的特异性寡核苷酸引物对，SEQ ID NO 8,SEQ ID NO :9是植物通用扩增引物，所述使用说明书中给出了 PCR扩增条件，该条件为95°C，IOmin ；95°C,15s ；60°C，lmin。对于不同仪器，反应参数做适当调整。虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到， 在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在附属权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。
权利要求
1.用于实时荧光PCR方法检测样品中梨源性成分的特异性寡核苷酸引物对，其中所述引物对选自以下引物对中的一种或多种:SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2 ；SEQ ID NO :3和SEQ ID NO 4 ；以及 SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO :6。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸引物对，其中所述引物对为SEQID NO :5和SEQ ID NO :6。
3.根据权利要求1所述的寡核苷酸引物对，其中所述实时荧光PCR方法为STOR荧光染料法，所述引物对为SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2。
4.根据权利要求1所述的寡核苷酸引物对，其中所述实时荧光PCR方法为Taqman荧光探针法，所述引物对为SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4，且所使用的探针为SEQ ID NO -J0
5.样品中梨源性成分的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括使用权利要求1-4中任一项所述的特异性寡核苷酸引物对。
6.根据权利要求5所述的实时荧光PCR检测方法，还包括使用植物叶绿体trn基因通用引物序列 SEQ ID NO 8 和 SEQ ID NO :9。
7.快速检测样品中梨源性成分的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-4中任一项所述的特异性寡核苷酸引物对和使用说明书。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括植物叶绿体trn基因通用引物序列 SEQ ID NO 8 和 SEQ ID NO :9。
9.权利要求1-4中任一项所述的特异性寡核苷酸引物对在检测样品中梨源性成分中的应用。
全文摘要
本发明涉及用于样品中梨源性成分检测的寡核苷酸引物。本发明还涉及用于测定样品中梨源性成分的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括使用针对样品中梨源性成分的特异性寡核苷酸引物。本发明还涉及用于快速检测样品中梨源性成分的PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括用于实时荧光PCR检测样品中梨源性成分的特异性寡核苷酸引物。本发明还涉及针对样品中梨源性成分的特异性寡核苷酸引物在检测样品中梨源性成分中的应用。使用本发明的PCR检测方法和PCR检测试剂盒，能够简单、快速、特异且灵敏地测定样品中是否含有梨源性成分。
文档编号G01N21/64GK102344951SQ20101024049
公开日2012年2月8日 申请日期2010年7月30日 优先权日2010年7月30日
发明者吴亚君, 邓婷婷, 陈颖, 韩建勋, 黄文胜 申请人:中国检验检疫科学研究院