专利名称：一种快速检测三聚氰胺的试剂盒及其应用的制作方法
一种快速检测三聚氰胺的试剂盒及其应用
(-)技术领域 本发明涉及原料乳及其加工后袋装纯牛奶中三聚氰胺的快速检测方法及试剂盒。
背景技术：
2008年9月我国发生了婴幼儿食用奶粉中毒甚至死亡的重大食品安全事故，追究 原因是来自牛奶收购站违规添加“蛋白精”"三聚氰胺所致，这起食品安全事故使我国的奶 制品以及相关行业导致重大打击，消费者对奶制品的安全信任下降到最低点，后续波及的 相关行业同样受到很大影响，影响到国际贸易以及国家名声。在三鹿奶粉事件之前，我国未 曾建立有食品中三聚氰胺测定方法，很少有三聚氰胺快速检测技术。在国家质检总局的主 持下，2008年10月7日国家标准委员会发布GB/T22388-2008原料乳和乳制品中三聚氰胺 检测方法，规定了液相色谱、气相色谱质谱法、液相色谱质谱法三种标准测定方法，但是三 种方法均需要大型精密仪器、熟练操作人员，复杂的样品前处理，目前检测部门收费一般为 200元/份-1000元/份，目前我国已经规定对液态乳制品进行批批检测，上述方法显然不 能满足乳制品行业生产检测要求，开发快速、简便的测定方法非常重要。目前针对液态奶中 三聚氰胺快速检测方法，国外除了 ELISA法外，还没见其他方法，国内还没有三聚氰胺抗体 生产报道，且ELISA需要一定的仪器设备和较熟练的操作人员，对样品数量少的检测(同样 需要制定标准曲线)，且成本较高，时间需要1. 0小时以上。国家科技部于2008年9月28日向社会公开征集液态奶中三聚氰胺快速检测技术 和产品。国内10月10日由国家质检总局的主持的现场盲样考试中，使用的方法原理主要 有离子色谱、ELISA、毛细管电泳、显微镜目视法、显色法等等。在结果公示中存在以下问题 有些方法需要大型仪器设备，至少几十万，仪器维护使用成本高；有些方法定性不准确，特 异性差等缺点。本发明采用化学浊度法开发原料奶及其加工后袋装纯牛奶中三聚氰胺快速检测 试剂盒，优化各种条件，使各种指标满足科技部招标要求，同时使用者不需要增加大型仪器 设备投入，以及特殊要求的操作人员，该产品的开发成功为促进奶制品的行业的健康发展 以及打击三聚氰胺的违法使用保障食品安全具有非常重要意义。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种三聚氰胺检测试剂盒。一种三聚氰胺检测试剂盒，包括蛋白沉淀剂A、淋洗试剂B、洗脱试剂C以及显示剂 D，所述的蛋白沉淀剂A选自下列之一甲醇、乙腈、三氯乙酸水溶液、2衬％乙酸铅水 溶液、三氯乙酸水溶液与乙腈按照体积比1 0. 5 2混合得到的混合溶液、1衬％亚 铁氰化钾水溶液与乙酸锌水溶液按照体积比1 1昆合得到的混合溶液；所述的淋 洗试剂B为30 60mmol/L盐酸溶液；所述的洗脱试剂C为3 6vol%氨化甲醇；所述的 显示剂D选自下列之一 0. 5衬％苦味酸水溶液、0. 5衬％氯化汞水溶液、0. 5衬％三聚氰酸 水溶液、体积比为1 0. 5 1.2的0. 5衬％氯化汞水溶液与0. 5wt%三聚氰酸水溶液形成的混合溶液。进一步，所述的蛋白沉淀剂A优选为Iwt %三氯乙酸水溶液与乙腈按照体积比 1 0.5 2混合得到的混合溶液；更优选三氯乙酸水溶液与乙腈按照体积比1 1 昆合得到的混合溶液。进一步，所述的显 示剂D优选为体积比为1 0. 5 1. 2的0. 5wt%氯化汞水溶液 与0.5衬％三聚氰酸水溶液形成的混合溶液；更优选体积比为1 1的0.5wt%氯化汞水溶 液与0. 5wt%三聚氰酸水溶液形成的混合溶液。本发明所述的淋洗试剂B和洗脱试剂C是SCX+C8固相萃取柱对应的淋洗试剂和 洗脱试剂，其中淋洗试剂B优选50mmol/L盐酸溶液，洗脱试剂C优选5vol%氨化甲醇。本 发明中氨化甲醇的浓度为体积浓度，由25 28衬％氨水和甲醇配制得到，比如5%氨化甲 醇中25 28wt%氨水与甲醇体积比为5 95。更进一步，本发明优选所述的试剂盒包括蛋白沉淀剂A、淋洗试剂B、洗脱试剂C以 及显示剂D，所述的蛋白沉淀剂A为三氯乙酸水溶液与乙腈按照体积比1 1昆合得 到的混合溶液；所述的淋洗试剂B为50mmol/L盐酸溶液；所述的洗脱试剂C为5vol %氨化 甲醇；所述的显示剂D为体积比为1 1的0.5衬％氯化汞水溶液与0.5wt%三聚氰酸水溶 液形成的混合溶液。本发明要解决的第二个技术问题是提供一种上述三聚氰胺检测试剂盒在快速检 测三聚氰胺中的应用。一种快速检测三聚氰胺的方法，其特征在于所述的方法包括以三聚氰胺含量为 2. Omg/L的原料乳或者加工后纯牛奶为标准样品，以待测的原料乳或者加工后纯牛奶为样 品，分别在相同条件下依次经步骤(1) (3)处理后，利用化学浊度法判断待测的样品中三 聚氰胺含量是否超过2. Omg/L 1)原料乳或者加工后纯牛奶中加入蛋白沉淀剂A，经过滤除去蛋白，得到滤液；所 述原料乳或者加工后纯牛奶与蛋白沉淀剂A的投料体积比为1 0.8 1.2;2)取SCX+C8固相萃取柱，活化后使步骤1)所得滤液过SCX+C8固相萃取柱，经过 淋洗试剂B除杂净化，然后用洗脱试剂C进行洗脱，所得洗脱液蒸干；3)在步骤2)得到的蒸干残留物中加入显示剂D，混勻后得到的显示后溶液吸入酶 标板内，利用化学浊度法测定三聚氰胺含量。进一步，本发明步骤(1)中所述原料乳或者加工后纯牛奶与蛋白沉淀剂A的投料 体积比优选为1:1。进一步，本发明步骤(2)使用的SCX+C8固相萃取柱可有不同规格，优选使用 300mg/6mL、500/6mL或1000/6mL规格的SCX+C8固相萃取柱，更优选使用300mg/6mL规格的 SCX+C8固相萃取柱。一般来说，对于SCX+C8固相萃取柱的使用，包括活化、上样、淋洗、洗脱四个步 骤，本领域技术人员可以采用常规操作。其中活化步骤可依次用甲醇、水、淋洗试剂B 活化柱子；样品、活化用试剂、淋洗试剂、洗脱试剂的用量可以根据柱子的规格而定，如 300mg/6mL、500/6mL、1000/6mL规格的SCX+C8固相萃取柱，样品、活化用试剂、淋洗试剂、洗 脱试剂的体积用量可选择在2 3mL。进一步，本发明步骤(3)中，所述显示剂D的加入量以蒸干残留物的质量计为2 5mL/g。所述蒸干残留物中除了三聚氰胺，还含有其他杂质。一般而言，当步骤(2)中样品、 活化用试剂、淋洗试剂、洗脱试剂的体积用量选择在2 3mL时，可在其所得的蒸干残留物 中加入0. 1 0. 5mL的显示剂D，优选加入0. 2mL的显示剂D。更进一步，本发 明优选步骤(1) (3)具体如下(1)取原料奶或者加工后袋装纯牛奶加入蛋白沉淀剂A，混勻后过滤，收集滤液待 用；所述原料奶或者加工后袋装纯牛奶与蛋白沉淀剂A的投料体积比为1 1。(2)取SCX+C8混合固相萃取柱，先用甲醇2 3mL、水2 3mL、淋洗试剂B 2 3mL润洗活化柱子，然后加2 3mL步骤(1)所得滤液过柱，先用2 3mL淋洗试剂B、2 3mL甲醇淋洗除杂，最后用2 3mL洗脱试剂C洗脱，收集洗脱液，将收集的洗脱液在沸水浴 中蒸干备用；所述的SCX+C8混合固相萃取柱的规格为300mg/6mL。(3)在上述蒸发残留物管中加显示剂D 0. 1 0. 5mL,涡旋混合器混勻，并移入酶 标板。本发明所述的化学浊度法包括目视比浊度法和浊度计法，本发明可采用其中一种 或者两种结合使用。进一步，所述的目视比浊度法为经步骤(3)处理后，如果样品所得溶液显示乳白 色浑浊，则样品中三聚氰胺含量大于2. Omg/L。具体含量可结合仪器法进一步定量。进一步，所述的浊度计法为将步骤(3)所得溶液使用浊度计以与步骤(3)相同体 积用量的显示剂D为空白测量浊度值，如果样品浊度值大于标准样品浊度值，则样品中三 聚氰胺含量大于2. Omg/L。更进一步，所述的浊度计法采用单波长检测，优选在405nm或450nm的单波长条件 下测定浊度值。更进一步，为提高浊度计法的精确度，标准样品的浊度值优选采用多次测量进行 确定。本发明所述方法适用于原料乳或者加工后袋装纯牛奶中的三聚氰胺的测定，具有 快速、特异、准确的特点，其检出限达2. Omg/L，方法操作简便易行、检测成本低，有利于在液 态奶、奶粉生产企业中推广和应用，也为政府部门检测原料乳或者加工后袋装纯牛奶中的 三聚氰胺提供了快速有效的检测方法。
图1为实施例1得到的各种蛋白质沉淀剂对浊度测定的影响。图2为实施例1得到的1 %三氯乙酸和乙腈混合比例对浊度测定的影响。图3为实施例2得到的各种规格固相萃取柱对测定结果的影响，注A、B和C代表 300mg/6mL、500mg/6mL 和 1000mg/6mL 规格萃取柱。图4为实施例3得到的三种显色剂与三聚氰胺的反应结果。图5为本发明使用的便携式浊度仪。图6为实施例4得到的不同波长对于测定结果的影响。图7为实施例4得到的三聚氰胺标准曲线。图8为实施例4得到的国产固相萃取柱对液态奶测定结果。图9为实施例4得到的进口固相萃取柱对液态奶测定结果。
图10为进口与国产固相萃取柱对液态奶空白测定结果。图11为进口与国产固相萃取柱对液态奶加标2. Omg/L测定结果。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此
本发明实施例使用的国产SCX+C8混合固相萃取柱，购自杭州福裕科技服务有限 公司；进口 SCX+C8混合固相萃取柱购自德国Dr. E公司。实施例1 原料乳中蛋白质的去除以及蛋白沉淀剂A的选择由于本方法采用浊度法，最后所采用的各种显示试剂均可以与蛋白质、小肽等形 成沉淀反应，因此本部分需要尽可能去除蛋白质，同时要便于下一步三聚氰胺的分离和净 化。实施例实验步骤如下1)取5mL不含三聚氰胺的鲜牛奶(样品空白)加入5mL蛋白沉淀剂，混勻后用滤 纸过滤，弃去前面10滴，收集后面4mL待用。2)取300mg/6mL的国产SCX+C8混合固相萃取柱，先用甲醇3mL、水3mL、50mmol/ mL盐酸溶液(淋洗试剂B) 3mL润洗活化柱子，然后加上述3mL滤液过柱，先用3mL淋洗试剂 B、3mL甲醇淋洗除杂，最后用3mL5%氨化甲醇(洗脱试剂C)洗脱，并用IOmL锥形玻璃管收 集，将收集的滤液在沸水浴中蒸干备用。3)在上述蒸发残留物管中加0.5wt%氯化汞+0.5衬％三聚氰酸(1 1 ν ν) (显示剂D)0. 2mL,涡旋混合器混勻，并移入酶标板，放置5min后以0. 2mL显示剂D作空白 校零，用便携式比浊计在450nm波长下测定吸光度值。取5mL添加有三聚氰胺的鲜牛奶(三聚氰胺添加量为2mg/L)为加标样品，实验条 件同上。每一组平行试验3次，取平均值作为测定结果。各种蛋白质沉淀剂最后测定结果见表1、图1。表1各种蛋白质沉淀剂对浊度测定的影响(η = 3)
权利要求
一种三聚氰胺检测试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包括蛋白沉淀剂A、淋洗试剂B、洗脱试剂C以及显示剂D，所述的蛋白沉淀剂A选自下列之一甲醇、乙腈、1wt％三氯乙酸水溶液、2wt％乙酸铅水溶液、1wt％三氯乙酸水溶液与乙腈按照体积比1∶0.5～2混合得到的混合溶液、1wt％亚铁氰化钾水溶液与2wt％乙酸锌水溶液按照体积比1∶1混合得到的混合溶液；所述的淋洗试剂B为30～60mmol/L盐酸溶液；所述的洗脱试剂C为3～6vol％氨化甲醇，所述的显示剂D选自下列之一0.5wt％苦味酸水溶液、0.5wt％氯化汞水溶液、0.5wt％三聚氰酸水溶液、体积比为1∶0.5～1.2的0.5wt％氯化汞水溶液与0.5wt％三聚氰酸水溶液形成的混合溶液。
2.如权利要求1所述的三聚氰胺检测试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包括蛋白沉淀 剂A、淋洗试剂B、洗脱试剂C以及显示剂D，所述的蛋白沉淀剂A为1衬％三氯乙酸水溶液 与乙腈按照体积比1 1昆合得到的混合溶液；所述的淋洗试剂B为50mmol/L盐酸溶液； 所述的洗脱试剂C为5vol%氨化甲醇；所述的显示剂D为体积比为1 1的0.5wt%氯化 汞水溶液与0. 5wt%三聚氰酸水溶液形成的混合溶液。
3.如权利要求1或2所述的三聚氰胺检测试剂盒在快速检测三聚氰胺中的应用，其特 征在于所述的应用具体包括以三聚氰胺含量为2. Omg/L的原料乳或者加工后纯牛奶为标 准样品，以待测的原料乳或者加工后纯牛奶为样品，分别在相同条件下依次经步骤(1) (3)处理后，利用化学浊度法判断待测的样品中三聚氰胺含量是否超过2. Omg/L (1)原料乳或者加工后纯牛奶中加入蛋白沉淀剂A，经过滤除去蛋白，得到滤液；所述 原料乳或者加工后纯牛奶与蛋白沉淀剂A的投料体积比为1 0. 8 1. 2 ；(2)取SCX+C8固相萃取柱，活化后使步骤1)所得滤液过SCX+C8固相萃取柱，经过淋洗 试剂B除杂净化，然后用洗脱试剂C进行洗脱，所得洗脱液蒸干；(3)在步骤(2)得到的蒸干残留物中加入显示剂D，混勻后得到的显示后溶液吸入酶标 板内。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的化学浊度法采用目视比浊度法和/或 浊度计法，所述的目视比浊度法为经步骤(3)处理后，如果样品所得溶液显示乳白色浑 浊，则样品中三聚氰胺含量大于2. Omg/L。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的化学浊度法采用目视比浊度法和/或 浊度计法，所述的浊度计法为将步骤(3)所得溶液使用浊度计以与步骤(3)相同体积用量 的显示剂D为空白测量浊度值，如果样品的浊度值大于标准样品的浊度值，则样品中三聚 氰胺含量大于2. Omg/L。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于标准样品的浊度值采用多次测量进行确定。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的浊度计法采用单波长检测，在405nm或 450nm的单波长条件下测定浊度值。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的SCX+C8固相萃取柱的规格为 300mg/6mL、500/6mL 或 1000/6mL。
9.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述显示剂D的加入量以蒸干残留物的质量 计为2 5mL/g。
10.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的步骤(1) 步骤(3)具体如下(1)取原料奶或者加工后袋装纯牛奶加入蛋白沉淀剂A，混勻后过滤，收集滤液待用；所述原料奶或者加工后袋装纯牛奶与蛋白沉淀剂A的投料体积比为11;(2)取SCX+C8混合固相萃取柱，先用甲醇2 3mL、水2 3mL、淋洗试剂B2 3mL润 洗活化柱子，然后加上述2 3mL滤液过柱，先用2 3mL淋洗试剂B、2 3mL甲醇淋洗除 杂，最后用2 3mL洗脱试剂C洗脱，收集洗脱液，将收集的洗脱液在沸水浴中蒸干备用；所 述的SCX+C8混合固相萃取柱的规格为300mg/6mL ；(3)在上述蒸发残留物管中加显示剂D0. 1 0. 5mL，涡旋混合器混勻，并移入酶标板。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测三聚氰胺的试剂盒及其应用，所述的试剂盒包括蛋白沉淀剂A、淋洗试剂B、洗脱试剂C和显示剂D。所述的应用包括以三聚氰胺含量为2.0mg/L的原料乳或者加工后纯牛奶为标准样品，将待测样品盒标准样品分别在相同条件下依次经步骤(1)～(3)处理后，利用化学浊度法判断待测样品中三聚氰胺含量是否超过2.0mg/L(1)原料乳或者加工后纯牛奶加入蛋白沉淀剂A除去蛋白，得到滤液；(2)滤液过SCX+C8固相萃取柱，经过淋洗试剂B除杂净化，然后用洗脱试剂C进行洗脱，所得洗脱液蒸干；(3)在蒸干残留物中加入显示剂D，混匀后得到的显示后溶液吸入酶标板内。本发明检测方法具有快速、特异、准确的特点，操作简便易行、检测成本低。
文档编号G01N21/82GK101968452SQ201010269289
公开日2011年2月9日 申请日期2010年9月1日 优先权日2010年3月5日
发明者吴平谷, 沈向红, 王立媛 申请人:浙江省疾病预防控制中心