专利名称：基于纳米探针的微流体芯片检测微量蛋白的方法
技术领域：
本发明属于微量蛋白的检测领域，特别涉及基于纳米探针结合微流体芯片技术来 检测目标蛋白的方法。
背景技术：
我国是病毒性肝炎发病率较高的国家，乙型肝炎(HBV)的发病率均居世界首位。 慢性感染可致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(HCC)， 对患者的健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题。因此早期及时有效地 对患者进行肝炎病毒的检测就显得尤为重要。目前临床诊断HBV主要方法有ELISA和聚合 酶链反应，但仍存在一定的局限性。前者的窗口期漏检是当前影响血液安全性进一步提高 的瓶颈，后者由于交叉污染而带来的假阳性问题。不同的检测方法针对同一种病原有不同 的窗口期，酶免检测的窗口期比较长，而HBsAg则为56天。处于窗口期的病人具有传染性， 但用这种检测方法无法检测到其病毒标志物，这一原因占血液漏检的90%以上。故酶免检 测的窗口期漏检几乎不可避免。为了大幅度地缩短检测窗口期，进一步提高血液安全性，因 此如何建立一种简单、快速、特异的乙型肝炎微量蛋白检测方法非常关键。近年来，纳米材料的优良特性受到人们越来越多地关注，如在免疫检测中受到广 泛应用的纳米级的胶体金颗粒，由于纳米金颗粒对蛋白质有很强的吸附功能，可以与蛋白 质/核酸等非共价结合，因而在生物医学基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。纳 米金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些 标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而广泛应用于定性或 半定量的快速检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为银染色。纳 米金颗粒标记技术具有简单、快速、准确和无污染等优点，且检测不依赖昂贵的激光检测仪 器，只需普通光学仪器，甚至肉眼即可辨别。目前，将纳米技术应用到临床医学中微量蛋白质的检测已成为热点。现已有报道， 如纳米金结合辣根过氧化物酶检测肿瘤蛋白、纳米金结合荧光染料对核蛋白的检测等方 法，但这些方法都存在一定的缺陷，前者需要特定的酶标仪，而后者需要荧光试剂及昂贵的 荧光检测仪，容易造成污染、假阳性。因此，需要建立一种无需特殊仪器仅靠肉眼观察的纳 米检测微量蛋白质的方法。基于以上所述，本发明拟将纳米技术、微流控技术、银染技术结合起来，建立一种 基于纳米探针的微流体芯片检测微量蛋白的方法，并将此方法用于乙型肝炎微量蛋白的检 测，因而引导出本发明的主要构思。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于纳米探针的微流体芯片检测微量蛋白的方法，针 对在临床血清中乙型肝炎的诊断。本发明是通过纳米磁珠和纳米金DNA结合微流体芯片技术，将样品混合、反应、分
6离及检测功能集成一体，在纳米金颗粒上同时标记单克隆二抗及信号放大作用的Barcode DNA，通过信号的逐级放大，达到对微量目标抗原的检测。该方法具有高灵敏度和特异性，并 且不需要复杂的仪器以及酶反应的PCR实验条件，有望应用于临床检验医学中乙型肝炎的 早期检测和筛查。具体的说本发明是由微流体芯片的制备、检测试剂及DNA的准备、单克隆抗体和 DNA的标记、检测与结果判读等四个过程组成的，主要通过纳米磁珠标记单克隆一抗，纳 米金同时标记单克隆二抗与Barcode DNA，两者与抗原形成三明治结构，然后通过变性将 Barcode DNA从三明治结构上的释放出来，并由微芯片的捕获区域流入检测区域，进一步与 金DNA、芯片DNA互补杂交，从而造成信号逐级放大，通过银染显色得出结果(流程见图1)。 具体技术方案阐述如下(一 )微流体芯片的制备微流体芯片(简称微芯片)中微结构的示意图如图2所示。利用标准的光刻工艺 实现微结构的制作，将点有DNA的醛基修饰玻璃片与微结构封接制备了所需的微芯片。该 芯片具有将生物样品的富集、分离和检测连接为一体，应用于微量蛋白质(抗原或抗体)的 检测。整个芯片大小为75mmX 25mm，分为捕获区域和检测区域，制备过程如下1、硅片为基底材料，甩SU-8光刻胶，曝光、显影制作管道模具和阀门模具；2、将PDMS、固化剂以20 1混合(重量比)，除气泡后浇注在管道模具上，90°C加 热固化1小时，制作管道微结构；3、将PDMS、固化剂以10 1混合(重量比)，除气泡后浇注在阀门模具上，90°C加 热固化1小时，制作阀门微结构；4、剥离阀门模具上的PDMS，用打孔针打进气孔(图2中A、B、C三个孔)；然后与
管道微结构贴合在一起；5、然后剥离管道-阀门粘合体，打孔(图2中1、3为进样孔，2、4为废液池)，并与 点有DNA的玻璃片健合，完成微芯片的制作。所述步骤(一)/1中阀门(包括阀门A、阀门B、阀门C)的宽度是管道宽度的1.5 倍；所述步骤(一)/2中管道微结构中PDMS单体与固化剂的重量混合比例20 1 ；所述步骤(一)/3中阀门微结构中PDMS单体与固化剂的重量混合比例10 1 ；所述步骤(一)/2、3中管道与阀门微结构的固化条件是90°C，1小时；( 二)检测试剂及DNA的设计1、纳米金溶液的制备配置浓度为ImM HAuC14 (四氯金酸)溶液及浓度为38. 8mM的柠檬酸三钠溶液。将 HAuC14溶液加热至120-140°C ；保证加热过程中搅拌充分，约20分钟时迅速加入新配好的 柠檬酸三钠溶液(此过程中注意保温，不要让HAuC14溶液降温)25ml，持续搅拌至溶液冷却 至室温、即形成为酒红色溶液。以0. 22 μ m硝酸纤维尼龙膜过滤溶液，即可得到颗粒均勻的 13nm纳米金溶液，4°C保存备用。2、DNA链的设计及合成设计了三条DNA探针，一条是Barcode DNA，用于标记单克隆二抗，起信号放大作 用；第二条是信号DNA，用于标记纳米金，与Barcode DNA—部分序列杂交互补反应，起信号放大作用；第三条是芯片DNA，固定于醛基修饰的玻璃片上，与Barcode DNA另一部分序列 杂交互补反应。DNA探针的合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，序列如下，Barcode DNA 5 ’ -GTGCCTTGGGTGGCTTTG-PEG9mer_AGCTACGAATAA-(CH2)3-SH-3 ’信号DNA :5，-HS- (CH2) 3-Poly (A) 10-TTA TTC GTA GCT-3，芯片DNA :5，-NH2-poly (A) 16-CAAAGCCACCCAAGGCAC-3(三)单克隆抗体和DNA的标记1、纳米磁珠标记单克隆一抗(MMP探针)将50ul 纳米磁珠(Dynal Invitrogen Corp. (USA))用等量 MES (2_ (N-吗啉)乙 磺酸，25Mm，PH6)清洗，去上清，依次加入50ul EDC (1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺 盐酸盐)和NHS (N-羟基硫代琥珀酰亚胺)，孵育后去上清、清洗；将活化好的磁珠溶于90ul 的MES，与5ul单克隆一抗混合均勻后孵育；然后加入IOOul Tris孵育，磁分离后用IOOul 的PBS (磷酸盐缓冲液，IOmM)清洗，去上清，加入50ul的PBS重新悬浮磁珠，4°C保存。MMP探针用于捕获待检测的微量抗原，由于抗原抗体反应形成MMP-抗原复合物。2、单克隆二抗、barcode DNA标记纳米金(NP探针)取200ul的纳米金，用碳酸钾调节PH为8. 2附近，加入30ul的单克隆二抗，放置1 个小时后，再加入3ul barcode DNA，孵育M小时；加5ul的10% PEG8000 (聚乙二醇8000) 孵育30min后，依次加入4ul的0. IM NaCL,0. OlM PB (磷酸氢二钠或磷酸二氢钠)，加三次，
使溶液维持一定盐浓度，4°C保存。NP探针可以与MMP-抗原复合物反应，形成三明治结构，信号初次放大。3、信号DNA与纳米金(金DNA)取Iml纳米金溶液4°C、9000rpm离心50min，弃上清，加入97 μ 1灭菌水和3 μ 1信 号DNA到金颗粒中，混合均勻后，4°C静置12小时；然后依次加入3 μ 1的0. IM PBUM NaCL, 总体积为18 μ 1 (1小时/次，三次)；混合均勻后，4°C静置48小时，再加入PB/NaCL混合液 (0. OlM PB,0. IM NaCL)使总体积为Iml ；离心50min后，弃上清，加入IOOul的PB/NaCL混 合液，4 °C保存。金DNA可与Barcode DNA杂交反应，信号再次放大。所述步骤(三)/1中磁珠的用量为500 μ g，抗体的用量为5 μ g ；所述步骤(三)/2中纳米金颗粒大小为13nm，纳米金溶液浓度为12. 2nM，单克隆 二抗的浓度为0. lmg/ml.；所述步骤(三)/3中信号DNA的浓度为300PM ；(四)检测与结果判读1、取10 μ 1的乙肝表面抗原加入微芯片的进样口 1，与MMP探针室温孵育30分 钟，抗原抗体免疫反应形成了抗原-MMP复合物；磁场作用下，用30 μ 1的IOmM PBS磷酸盐、 ΡΗ7. 4清洗，将未反应的多余抗原冲洗掉，废液从废液池2流走(阀门B、C处于关闭状态)。2、加入20 μ 1的NP探针，孵育30分钟，形成了三明治结构NP-抗原-ΜΜΡ，信号通 过NP探针上Barcode DNA初次放大；磁场作用下，用30 μ 1的IOmMPBS磷酸盐清洗，将未反 应的NP探针冲洗掉，废液从废液池2流走(阀门B、C处于关闭状态)。3、去磁场，加入20 μ 1 DTT，变性15min。打开阀门B，使释放的BarcodeDNA流入检 测区域，与微芯片上DNA杂交。
4、同时将20μ 1金DNA加入进样口 3，形成金DNA-Barcode DNA-DNA芯片杂交复合 物，信号通过金DNA再次放大，孵育15min后，加入银染试剂，5min后观察结果。当银离子遇 到DNA-Barcode DNA-金DNA复合物时，由于纳米金将银离子还原为银颗粒，造成银颗粒的 沉积放大，通过肉眼或显微镜观察可见黑褐色颗粒。综上所述，本发明涉及一种基于纳米探针的微流体芯片检测微量蛋白的方法，其 特征在于采用标准的光刻工艺实现微结构的制作，用玻璃片(点有DNA探针)与微结构 封接制备了所需的微流体芯片；在纳米金颗粒上同时标记单克隆二抗及信号放大作用的 Barcode DNA，并在磁珠上标记单克隆一抗；在微流体芯片管道内，通过抗原抗体免疫反应 以及信号的逐级放大、银染显色，从而达到对微量目标蛋白的检测。所述的方法将生物样品 的富集、分离和检测连接为一体，具有特异、快速和高灵敏的特点，可望应用于临床检验医 学中微量蛋白(抗原或抗体)的诊断和检测。灵敏度可达pg/ml，比临床中普通的LEISA法 提高了 1000倍。
图1为基于纳米探针的微流体芯片检测微量蛋白的流程图；图2为微流体芯片的结构示意图；图3为乙肝表面抗原(a)和小牛血清(b)的检测结果；图4为临场血清样本的检测结果，(a)稀释1000倍，(b)稀释100倍，(c)稀释10倍。
具体实施例方式下面通过
和具体实施例的解释，以进一步阐述本发明的实质性特点和显 著的进步。图1为本发明提供的检测微量蛋白的流程图，图中①微结构与DNA芯片封接构成 了微流体芯片，简称微芯片；②将MMP探针加入微芯片进样孔1中，在磁场作用下，固定于微管壁；③加入待测抗原(进样孔1)，与MMP探针抗原抗体反应，缓冲液冲洗；④加入NP探针(进样孔1)，与抗原-MMP形成三明治结构NP-抗原-MMP ；⑤加入DTT(进样孔1)孵育后，打开阀门B，Barcode DNA释放到微芯片的检测区 域；⑥同时在进样孔3中加入金DNA，形成金DNA-Barcode DNA-DNA芯片复合物；⑦加入银染试剂显色，由于银离子被纳米金氧化还原为银粒子，从而造成银沉积 显黑褐色；上述步骤1、2、3、4中阀门B和阀门C处于关闭状态；步骤6、7中阀门A和阀门B 处于关闭状态。图2为微流体芯片的结构示意图，微流体使用是1)将阀门PDMS模型作好后，打阀 门A、B、C的进气孔；2)将阀门与管道PDMS粘合后，打进样孔1、3，废液池2、4 ；3)当反应在捕获区域时，通过气压来控制阀门B、阀门C处于关闭状态；
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4)当反应在检测区域时，通过气压来控制阀门B、阀门A处于关闭状态。实施例1 标准品乙肝表面抗原的检测(一)微流体芯片的制备1、硅片为基底材料，甩SU-8光刻胶，曝光、显影制作管道模具和阀门模具；2、将PDMS、固化剂以20 1混合(重量比)、除气泡后浇注在管道模具上，90°C加 热固化1小时，制作管道微结构；3、将PDMS、固化剂以10 1混合(重量比)、除气泡后浇注在阀门模具上，90°C加 热固化1小时，制作阀门微结构；4、剥离阀门模具上的PDMS，用打孔针打进气孔(图2中A、B、C三个孔)；然后与
管道微结构贴合在一起；5、然后剥离管道-阀门粘合体，打孔(图2中1、3为进样孔，2、4为废液池)，并与 点有DNA的玻璃片健合，完成微芯片的制作。 (二)检测试剂及DNA的准备1、纳米金溶液的制备配置浓度为ImM HAuC14(四氯金酸)溶液及浓度为38. 8mM的，柠檬酸三钠溶液。 将HAuC14溶液加热至130°C，保证加热过程中搅拌充分，约20分钟时迅速加入新配好的柠 檬酸三钠溶液(此过程中注意保温，不要让HAuC14溶液降温)25ml，持续搅拌至溶液冷却 至室温、即形成为酒红色溶液。以0. 22 μ m硝酸纤维尼龙膜过滤溶液，即可得到颗粒均勻的 13nm纳米金溶液，4°C保存备用。2、DNA链的设计及合成设计了三条DNA探针，一条是Barcode DNA，用于标记单克隆二抗，起信号放大作 用；第二条是信号DNA，用于标记纳米金，与Barcode DNA—部分序列杂交互补反应，起信号 放大作用；第三条是芯片DNA，固定于醛基修饰的玻璃片上，与Barcode DNA另一部分序列 杂交互补反应。DNA探针的合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，序列如下，Barcode DNA :5， -GTGCCTTGGGTGGCTTTG-PEG9mer_AGCTACGAATAA-(CH2)3-SH-3，信号DNA :5，-HS- (CH2) 3-Poly (A) 10-TTA TTC GTA GCT-3，芯片DNA :5，-NH2-poly (A) 16-CAAAGCCACCCAAGGCAC-3(三)单克隆抗体和DNA的标记1、纳米磁珠标记单克隆一抗(MMP探针)将50ul 纳米磁珠(Dynal Invitrogen Corp. (USA))用等量 MES (2_ (N-吗啉)乙 磺酸，25Mm，PH6)清洗，去上清，依次加入50ul EDC (1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺 盐酸盐)和NHS (N-羟基硫代琥珀酰亚胺)，孵育后去上清、清洗；将活化好的磁珠溶于90ul 的MES，与5ul单克隆一抗混合均勻后孵育；然后加入IOOul Tris孵育，磁分离后用IOOul 的PBS (磷酸盐缓冲液，IOmM)清洗，去上清，加入50ul的PBS重新悬浮纳米磁珠，4°C保存。MMP探针用于捕获待检测的微量抗原，由于抗原抗体反应形成MMP-抗原复合物。2、单克隆二抗、barcode DNA标记纳米金(NP探针)取200ul的纳米金，用碳酸钾调节PH为8. 2附近，加入30ul的单克隆二抗，放置1 个小时后，再加入3ul barcode DNA，孵育M小时；加5ul的10% PEG8000 (聚乙二醇8000) 孵育30min后，依次加入4ul的0. IM NaCL,0. OlM PB (磷酸氢二钠或磷酸二氢钠)，加三次，
10使溶液维持一定盐浓度，4°C保存。NP探针可以与MMP-抗原复合物反应，形成三明治结构，信号初次放大。3、信号DNA与纳米金(金DNA探针)取Iml纳米金溶液4°C、9000rpm离心50min，弃上清，加入97 μ 1灭菌水和3 μ 1信 号DNA到金颗粒中，混合均勻后，4°C静置12小时；然后依次加入3 μ 1的0. IM PBUM NaCL, 总体积为18 μ 1 (1小时/次，三次)；混合均勻后，4°C静置48小时，再加入PB/NaCL混合液 (0. OlM PB,0. IM NaCL)使总体积为Iml ；离心50min后，弃上清，加入IOOul的PB/NaCL混 合液，4 °C保存。金DNA可与Barcode DNA杂交反应，信号再次放大。(四)检测与结果判读1、取10 μ 1的乙肝表面抗原加入微芯片的进样口 1，与MMP探针室温孵育30分钟， 抗原抗体免疫反应形成了抗原-MMP复合物；在磁场作用下，用30 μ 1的IOmM PBS磷酸盐、 ΡΗ7. 4清洗，将未反应的多余抗原冲洗掉，废液从废液池2流走(阀门B、C处于关闭状态)。2、加入20 μ 1的NP探针，孵育30分钟，形成了三明治结构NP-抗原-ΜΜΡ，信号通 过NP探针上Barcode DNA初次放大；在磁场作用下，用30 μ 1的IOmMPBS磷酸盐清洗，将未 反应的NP探针冲洗掉，废液从废液池2流走(阀门B、C处于关闭状态)。3、去磁场，加入20 μ 1 DTT，变性15min。打开阀门B，使释放的BarcodeDNA流入检 测区域，与微芯片上DNA杂交。4、同时将20μ 1金DNA加入进样口 3，形成金DNA-Barcode DNA-DNA芯片杂交复合 物，信号通过金DNA再次放大，孵育15min后，加入银染试剂，5min后观察结果。结果判读，抗原与磁珠上抗体结合，然后与NP探针形成三明治结构，通过Barcode DNA释放，与芯片DNA、金-DNA杂交，银染显色。见图3。本发明对比了标准品乙肝表面抗原与标准品小牛血清的对照结果，由于MMP抗体 可以捕获到乙肝表面抗原，并于NP探针形成三明治结构，从而Barcode DNA的释放，进一步 与芯片DNA、金DNA杂交反应，通过银染可以显示出黑褐色(见图3-a)；而标准品小牛血清 中不含靶抗原，不会形成三明治结构及Barcode DNA的释放，也没有杂交反应，银染显示无 黑褐色出现(见图3-b)。实施例2 临床血清样品检测(lng/ml乙肝血清标本)(一)微流体芯片的制备与实施案例1中(一)相同。( 二)检测试剂及DNA的准备与实施案例1中(二)相同。(三)单克隆抗体和DNA的标记与实施案例1中(三)相同。(四)检测与结果判读1、样品的处理将临床血清样品用小牛血清稀释，浓度为lpg/ml、10pg/ml、100pg/ml，取IOul加 入进样口 1。2、方法与实施案例1中(四)相同，结果见图4。
本发明将临床血清样本稀释了 1000、100、10倍做灵敏度试验，由于MMP抗体可以 捕获到临床血清样本中乙肝表面抗原，并于NP探针形成三明治结构，从而Barcode DNA的 释放，进一步与芯片DNA、金DNA杂交反应，通过银染可以显示出黑褐色。如图4-a为稀释 1000倍的血清(lpg/ml)，图4-b稀释100倍的血清(10pg/ml)，图4_c稀释10倍的血清 (100pg/ml)。因此，本方法的灵敏度可达到lpg/ml，比普通方法高了 1000倍。通过对临床血清样品的检测，发现纳米金结合微流体方法的灵敏度可达pg/ml，比 临床中普通的ELISA法高了 1000倍。
权利要求
1.基于纳米探针的微流体芯片检测微量蛋白的方法，其特征在于是通过纳米磁珠和纳 米金DNA结合微流体芯片技术，将样品混合、反应、分离及检测功能集成一体，通过纳米磁 珠标记单克隆一抗，纳米金同时标记单克隆二抗与Barcode DNA，两者与抗原形成三明治结 构，然后通过变性将BarcodeDNA从三明治结构上的释放出来，并由微芯片的捕获区域流入 检测区域，进一步与金DNA、芯片DNA互补杂交，从而造成信号逐级放大，通过银染显色得出 结果。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步骤(A)微流体芯片的制备利用标准的光刻工艺实现微结构的制作，将点有DNA的醛基修饰玻璃片与微结构封接 制备了所需的微流体芯片；所制作的微流体芯片具有将生物样品的富集、分离和检测连接 为一体，应用于微量蛋白质抗原或抗体的检测；制备过程如下a)硅片为基底材料，用SU-8光刻胶，曝光、显影制作管道模具和阀门模具；b)将PDMS、固化剂以质量比为20 1比例混合，除气泡后浇注在管道模具上，90°C加 热固化1小时，制作管道微结构；c)将PDMS、固化剂以质量比为10 1比例混合，除气泡后浇注在阀门模具上，90°C加 热固化1小时，制作阀门微结构；d)剥离阀门模具上的PDMS，用打孔针打A、B、C三个进气孔；然后与管道微结构贴合在 一起；e)然后剥离管道-阀门粘合体，打进样孔和废液池孔，并与点有DNA的玻璃片健合，完 成微芯片的制作；(B)检测试剂及DNA的设计a)纳米金溶液的制备配置浓度为ImM四氯金酸溶液及浓度为38. SmM的柠檬酸三钠溶液。将四氯金酸溶液加 热至120-140°C，加热过程中搅拌充分，20分钟时迅速加入新配好的柠檬酸三钠溶液25ml， 持续搅拌至溶液冷却至室温、即形成为酒红色溶液；以0. 22 μ m硝酸纤维尼龙膜过滤溶液， 即可得到颗粒均勻的13nm纳米金溶液，4°C保存备用；b)DNA链的设计及合成设计了三条DNA探针，一条是Barcode DNA，用于标记单克隆二抗，起信号放大作用，同 时连接到纳米金颗粒上；第二条是信号DNA，用于标记纳米金，与Barcode DNA 一部分序列 杂交互补反应，起信号放大作用；第三条是芯片DNA，固定于醛基修饰的玻璃片上，并且与 Barcode DNA另一部分序列杂交互补反应；(C)单克隆抗体和DNA的标记a)纳米磁珠标记单克隆一抗-MMP探针将50 μ 1纳米磁珠用等量MES清洗，去上清，依次加入50 μ 1 EDC和NHS，孵育后去上 清、清洗；将活化好的磁珠溶于90 μ 1的MES，与5 μ 1单克隆一抗混合均勻后孵育；然后加 入100 μ 1 Tris孵育，磁分离后用100 μ 1的磷酸盐缓冲液，IOmM清洗，去上清，加入50 μ 1 的IOmM磷酸盐缓冲液重新悬浮磁珠，4°C保存；MMP探针用于捕获待检测的微量抗原，由于抗原抗体反应形成MMP-抗原复合物；其中，①MES为2-(N-吗啉)乙磺酸，25Mm，PH6 ；②EDC为1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；③NHS为N-羟基硫代琥珀酰亚胺；b)单克隆二抗、barcodeDNA标记纳米金-NP探针取200 μ 1的纳米金，用碳酸钾调节PH为8. 2，加入30 μ 1的单克隆二抗，放置1个小时 后，再加入3μ 1 barcode DNA，孵育M小时；加5 μ 1的10% PEG8000孵育30min后，依次 加入4 μ 1的0. IM NaCL,0. OlM ΡΒ，使溶液维持一定盐浓度，4°C保存；PB为磷酸氢二钠的缩 写；NP探针可与MMP-抗原复合物反应，形成三明治结构，信号初次放大；c)信号DNA与纳米金构筑成金-DNA取Iml纳米金溶液4°C、9000rpm离心50min，弃上清，加入97 μ 1灭菌水和3 μ 1信号 DNA到金颗粒中，混合均勻后，4°C静置12小时；然后依次加入3μ 1的0. IM PBUM NaCl，总 体积为18 μ 1，每次1小时，共三次；混合均勻后，4°C静置48小时，再加入PB/NaCL混合液 使总体积为Iml ；离心50min后，弃上清，加入100 μ 1的PB/NaCl混合液，4°C保存；所述PB/ NaCl 混合液为 0. OlM PB,0. IM NaCl ；金-DNA与Barcode DNA杂交反应，信号再次放大；(D)检测与结果判读a)取10μ 1的乙肝表面抗原加入微流体芯片的进样口(1)，与MMP探针室温孵育30分 钟，抗原抗体免疫反应形成了抗原-MMP复合物；磁场作用下，用30 μ 1的IOmM PBS磷酸盐、 ΡΗ7. 4清洗，将未反应的多余抗原冲洗掉，废液从废液池( 流走，阀门B、C处于关闭状态；b)加入20μ 1的NP探针，孵育30分钟，形成了三明治结构NP-抗原-ΜΜΡ，信号通过NP 探针上Barcode DNA初次放大；磁场作用下，用30 μ 1的IOmM磷酸盐缓冲液清洗，将未反应 的NP探针冲洗掉，废液从废液池( 流走，此时阀门B、C处于关闭状态；c)去磁场，加入20μ 1 DTT，变性15min;打开阀门B，使释放的Barcode DNA流入检测 区域，与微流体芯片上DNA杂交；d)同时将20μ 1金DNA加入进样口(；3)，形成金DNA-Barcode DNA-DNA芯片杂交复合 物，信号通过金DNA再次放大，孵育15min后，加入银染试剂，5min后观察结果；e)当银离子遇到DNA-BarcodeDNA-金-DNA复合物时，纳米金将银离子还原为银颗粒， 使银颗粒沉积放大，通过肉眼或显微镜观察可见黑褐色颗粒。
3.按权利要求2所述的方法，其特征在于a)步骤A所述的微流体芯片分为捕获区域和检测区域，芯片尺寸为75mmX25mm；b)步骤A步骤a)中阀门的宽度是管道宽度的1.5倍；c)步骤B中步骤b)中涉及的三条DNA探针的序列分别为Barcode DNA :5’ -GTGCCTTGGGTGGCTTTG-PEG9mer_AGCTACGAATAA-(CH2)3-SH-3’信号 DNA:5，-HS-(CH2)3-PoIy (A) 10-TTA TTC GTA GCT-3，芯片 DNA :5，-NH2-poly(A) 16-CAAAGCCACCCAAGGCAC-3d)步骤(C)步骤a)中磁珠的用量为500μg，抗体的用量为5μ g ；e)步骤(C)步骤b)中纳米金颗粒大小为13nm，纳米金溶液浓度为12.2nM，单克隆二抗 的浓度为0. lmg/ml.；f)所述步骤(C)步骤c)中信号DNA的浓度为300PM。
4.按权利要求2所述的方法，其特征在于对于乙肝表面抗原检测步骤是(A)微流体芯 片的制备1、硅片为基底材料，甩SU-8光刻胶，曝光、显影制作管道模具和阀门模具；2、将PDMS、固化剂以质量比为20 1比例混合、除气泡后浇注在管道模具上，90°C加热 固化1小时，制作管道微结构；3、将PDMS、固化剂以质量比为10 1比例混合、除气泡后浇注在阀门模具上，90°C加热 固化1小时，制作阀门微结构；4、剥离阀门模具上的PDMS，用打孔针打A、B、C三个进气孔；然后与管道微结构贴合在 一起；5、然后剥离管道-阀门粘合体，打2个进样孔和2个废液池孔，并与点有DNA的玻璃片 健合，完成微芯片的制作；(B)检测试剂及DNA的准备a)纳米金溶液的制备配置浓度为ImM四氯金酸溶液及浓度为38. SmM的柠檬酸三钠溶液；将四氯金酸溶液加 热至130°C，且加热过程中搅拌充分，20分钟时迅速加入新配好的柠檬酸三钠溶液25ml，持 续搅拌至溶液冷却至室温，即形成为酒红色溶液；以0. 22 μ m硝酸纤维尼龙膜过滤溶液，即 可得到颗粒均勻的13nm纳米金溶液，4°C保存备用；b)DNA链的设计及合成设计了三条DNA探针，一条是Barcode DNA，用于标记单克隆二抗，起信号放大作用；第 二条是信号DNA，用于标记纳米金，与Barcode DNA 一部分序列杂交互补反应，起信号放大 作用；第三条是芯片DNA，固定于醛基修饰的玻璃片上，与Barcode DNA另一部分序列杂交 互补反应，并进行DNA探针的合成；(C)单克隆抗体和DNA的标记a)纳米磁珠标记单克隆一抗-MMP探针将50 μ 1纳米磁珠用等量MES清洗，去上清，依次加入50 μ 1 EDC和NHS，孵育后去上 清、清洗；将活化好的磁珠溶于90 μ 1的MES，与5 μ 1单克隆一抗混合均勻后孵育；然后加 入100 μ 1 Tris孵育，磁分离后用100 μ 1的PBS清洗，去上清，加入50 μ 1的PBS重新悬浮 纳米磁珠，4°C保存；MMP探针用于捕获待检测的微量抗原，由于抗原抗体反应形成MMP-抗 原复合物；b)单克隆二抗、barcodeDNA标记纳米金-NP探针取200 μ 1的纳米金，用碳酸钾调节PH为8. 2附近，加入30 μ 1的单克隆二抗，放置1个 小时后，再加入3 μ 1 barcode DNA，孵育24小时；加5μ 1的10% PEG8000孵育30min后， 依次加入4μ 1的0. IM NaCL,0. OlM ΡΒ，加三次，使溶液维持一定盐浓度，4°C保存；NP探针 可以与MMP-抗原复合物反应，形成三明治结构，信号初次放大；c)信号DNA与纳米金，即金-DNA探针取Iml纳米金溶液4°C、9000rpm离心50min，弃上清，加入97 μ 1灭菌水和3 μ 1信号 DNA到金颗粒中，混合均勻后，4°C静置12小时；然后依次加入3μ 1的0. IM PBUM NaCl，总 体积为18 μ 1，每次1小时，共三次；混合均勻后，4°C静置48小时，再加入PB/NaCl混合液 使总体积为Iml ；离心50min后，弃上清，加入100 μ 1的PB/NaCl混合液，4°C保存；金DNA可与Barcode DNA杂交反应，信号再次放大；(D)检测与结果a)取10μ1的乙肝表面抗原加入微芯片的进样口(1)，与MMP探针室温孵育30分钟， 抗原抗体免疫反应形成了抗原-MMP复合物；在磁场作用下，用30 μ 1的IOmM PBS磷酸盐、 ΡΗ7. 4清洗，将未反应的多余抗原冲洗掉，废液从废液池(2)流走，此时阀门B、C处于关闭 状态；b)加入20μ 1的NP探针，孵育30分钟，形成了三明治结构NP-抗原-ΜΜΡ，信号通过NP 探针上Barcode DNA初次放大；在磁场作用下，用30 μ 1的IOmMPBS磷酸盐，ΡΗ7. 4清洗，将 未反应的NP探针冲洗掉，废液从废液池2流走，此时阀门B、C处于关闭状态；c)去磁场，加入20μ 1 DTT，变性15min ；打开阀门B，使释放的Barcode DNA流入检测 区域，与微芯片上DNA杂交；d)同时将20μ 1金-DNA加入进样口(；3)，形成金DNA-Barcode DNA-DNA芯片杂交复合 物，信号通过金DNA再次放大，孵育15min后，加入银染试剂，5min后观察结果；结果是抗原 与磁珠上抗体结合，然后与NP探针形成三明治结构，通过Barcode DNA释放到检测区域，与 互补芯片DNA、金-DNA杂交，银染显色。
5.按权利要求2或4所述的方法，其特征在于临床乙肝血清标本检测步骤与权利要求 2或4中A、B、C步骤相同，只是样品处理时将临床血清样品用小牛血清稀释，取浓度为Ipg/ ml、10pg/ml、100pg/ml，各取 10 μ 1 加入进样 口 中。
6.按权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于所述方法的灵敏度可达pg/ml，比 临床中普通的ELISA法高了 1000倍。
全文摘要
本发明涉及一种基于纳米探针的微流体芯片检测微量蛋白的方法，其特征在于采用标准的光刻工艺实现微结构的制作，用玻璃片(点有DNA探针)与微结构封接制备了所需的微流体芯片；在纳米金颗粒上同时标记单克隆二抗及信号放大作用的Barcode DNA，并在磁珠上标记单克隆一抗；在微流体芯片管道内，通过抗原抗体免疫反应以及信号的逐级放大、银染显色，从而达到对微量目标蛋白的检测。所述的方法将生物样品的富集、分离和检测连接为一体，具有特异、快速和高灵敏的特点，可望应用于临床检验医学中微量蛋白(抗原或抗体)的诊断和检测。灵敏度可达pg/ml，比临床中普通的LEISA法提高了1000倍。
文档编号G01N33/68GK102147414SQ201010617918
公开日2011年8月10日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者张宏莲, 毛红菊, 赵建龙, 郭慧, 金庆辉, 陈强 申请人:中国科学院上海微系统与信息技术研究所