专利名称：快速检测ttx的磁性免疫层析方法及检测试纸条的制备的制作方法
技术领域：
本发明属于食品检验领域，特别是涉及一种快速检测TTX的磁性免疫层析方法及检测试纸条的制备，属于检测技术类。
背景技术：
河豚鱼肉味鲜美，营养丰富，中国、日本等亚洲居民素有食用的习惯，但河豚鱼的卵巢、肝脏、肠道等内脏却富含河豚毒素(Tetrodotoxin，简称TTX)，由于该毒素性质稳定， 加之中毒后缺乏有效的解救措施，所以每年均有因误食有毒河豚鱼而中毒的报道，严重威胁消费者的生命安全。TTX是毒性最强的天然神经毒素之一，在自然界分布非常广泛。除存在于飩形目鱼种中外，在某些蝾螈、蟾蜍、章鱼、海螺、海星等海水、淡水动物中，以及诸如扁形虫等微生物体内也曾检测出该毒素。TTX理化性质稳定，能溶于水，不溶于无水乙醇和普通有机溶剂。 对热、日光、酶类、盐类及酸稳定，易溶于稀醋酸中。TTX的化学结构式如下图所示
OH该毒素毒性比氰化钠强1000倍，毒素除直接作用于胃肠道引起局部刺激症状外， 并被机体吸收进入血液中，可迅速使神经末梢及神经中枢发生麻痹。首先受害的是感觉神经麻痹，其次为各随机的运动神经末梢麻痹，使机体物理运动不能运动。毒量增大时则导致迷走神经麻痹，呼吸减少，脉搏迟缓，严重时体温及血压下降，最后发生血管运动神经中枢或横隔肌及呼吸神经中枢麻痹，引起呼吸停止，迅速死亡。TTX的检测技术研究始自20世纪60年代，传统的检测技术主要包括以小鼠检测法(mouse bioassay, MBA)为代表的生物检测技术；以荧光分光光度法(fluorescence spectrophotometry)、液才目色i普检 贝|J (high pressure liquid chromatography, HPLC)法为代表的仪器检测技术；以及以酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和免疫层析法(lateral flow immunoassay, LFIA)为代表的免疫分析技术等。(I)TTX的生物检测技术中，小鼠生物法是国际公认的检测方法，而且在日本被定为TTX的官方检测方法并广泛应用。小鼠生物法检测河豚毒素具有直观、快速、症状典型易于判断、易于操作、费用低等优点，且不需要特殊设备，其检测精度能满足水产品安全监测要求等特点，是一种广泛应用于检测河豚毒素的常规方法。该方法基于一定重量的小鼠经腹腔注射毒素后，其死亡时间的倒数与毒素剂量之间存在线性关系，可通过小鼠的死亡时间推断毒素毒力，用小鼠单位(mouse unit, MU)表示。目前IMU的定义是指在30min内杀死一只20g左右的雄性ddy小鼠的毒素量，即IMU相当于0. 22 UgTTX0但由于其费时费力， 重复性差且易受到共存氨基酸和无机离子的影响而导致结果偏低等缺点，在国内并未广泛普及。(2)TTX的仪器分析检测技术包括了荧光、紫外分光光度分析和色谱分析等。荧光分光光度法是最早建立起来的定量检测TTX的仪器方法，其原理是通过检测荧光化合物C9 碱来测定TTX的量。检出限为0. 3mg/ml。TTX在碱性条件下生成C9碱的同时，也定量生成草酸钠，后者在230nm处有明显的吸收峰，根据此建立的紫外分光光度法检出限为0. 02 0. lmg/ml。荧光法和紫外分光光度法操作简便，但灵敏度低，专一性差。在色谱法中，目前国内多用液相色谱法(HPLC)检测TTX，该方法灵敏度较高 (0. 2 9. 6 μ g/ml)。我国已制定了相应的国标《GB/T 23217-2008水产品中河豚毒素的测定——液相色谱-荧光检测法》。但该方法的样品前处理比较麻烦，需要进行柱后碱水解然后用荧光检测器测定，且所用仪器昂贵、检测费用相对较高。此外，日本学者曾采用液相-串联质谱(LC/MS/MS)分析法和液相-飞行时间质谱 (LC/T0F-MS)分析法检测TTX,检测限分别达到10ng/m L和0. 02 μ g/g。气相色谱-质谱 (GC/MS)联用分析法也曾被用于检测TTX，检测限与LC/MS/MS —致，为lOng/ml。由于色谱分析法检测过程简单、快速，同时配有高灵敏度的检测器，比较灵敏，是常用的检测方法之一，但对样品纯度要求较高。其缺点在于样品处理比较麻烦，所用仪器设备昂贵，检测成本尚ο(3)免疫分析方法由于其快速、灵敏，操作相对简单且专一性好等优点，在现代检测领域得到了快速发展。多数免疫分析法是基于TTX特异性单克隆抗体，也有基于抗血清开发的。目前应用最广泛的是ELISA法，该方法是以固-液抗原抗体反应体系为基础的检测方法，以国标《GB/T 5009. 206-2007鲜河豚鱼中河豚毒素的测定》为代表，目前国内已有市售的TTX ELISA检测试剂盒。该方法不仅保证了抗原、抗体反应的特异性及定量关系，且检测灵敏度高(检测限为lOng/ml)，但其操作过程需要专用设备和专业人员进行检测，操作步骤较为繁琐，检测时间一般需 3小时。LFIA技术是ELISA技术原理的扩展应用，一般使用乳胶颗粒、胶体硒、胶体金、脂质体及上转磷等作为着色标记物。在层析时，标记物与待测物之间形成的复合物可被相应的配体所捕获而聚集于硝化纤维膜上的检测线并呈现出标记物所带有的颜色，因此可以通过纤维膜上显色条的有无、颜色深浅和反射光线等从而实现检测目的，由于一般不需要特殊大型设备，从而具有操作简便、快速灵敏的优点。是一种适用于现场的快速检测方法，在目前公开的报道中，大都以胶体金颗粒作为标记物，因此又被称为胶体金免疫层析法。2010年，Yu ^iou等人报道了一种“基于胶体金免疫层析的河豚鱼组织中河豚毒素的检测方法”，但目前国内外尚未见河豚毒素免疫层析检测试纸条的专利报道。磁性免疫层析技术以超顺磁性颗粒代替传统的标记物来进行免疫层析，通过检测结合在超顺磁性纳米颗粒上的目标物来提供对生物样本的定量检测数据，再利用被磁颗粒标记抗体所捕获的免疫复合物与磁信号之间的线性关系即可实现对生物样本的快速定量检测目的，磁性免疫层析技术具有灵敏度高、稳定性强、线性范围宽、操作简便、快速等优
点ο
发明内容
本发明的目的针对现有检测技术不能快速、简便地检测TTX的不足和缺陷，提供一种以免疫磁珠为标记物的快速检测TTX的磁性免疫层析方法及磁珠标记层析试纸条的制备。从而实现快速、简便且可定量检测TTX目的。本发明提出的这种快速检测TTX的磁性免疫层析方法，其特征在于将样品垫、经抗TTX特异性鼠系单克隆抗体修饰的磁珠标记的结合垫、预包被有 TTX-BSA检测抗原的检测线T和山羊抗小鼠IgG的控制线C的层析膜、吸水垫依次相互交错约Imm粘贴在底板上，然后在上层覆盖透明塑料密封膜，组建成一种可快速检测TTX的磁性免疫层析试纸条；通过层析作用捕获免疫磁珠，依据样品层析后形成肉眼可见的1 2条显色条带，实现TTX的快速定性检测；或者将所构建的磁性免疫试纸条通过磁性分析仪进行检测，依据样品层析后形成的检测线和控制线的磁信号检测值可实现TTX的定量检测。所述的抗TTX特异性单抗是采用杂交瘤技术制备筛选所得、对TTX有特异性反应的特异性单抗体。所述的层析试纸条的制备方法如下A.检测抗原TTX-BSA偶联物的制备将TTX与牛血清白蛋白(BSA)按1 5重量比(W/W)混合，加入4%甲醛溶液作为偶联剂，于30°C下旋转反应3d，反应完成后，将混合物取出后用商业化的PD-10脱盐柱，脱盐介质为PH 7. 4的IOmM PBS ；脱盐处理时按照所附产品操作说明书对TTX-BSA偶联物进行脱盐。B.抗体的制备与纯化以TTX-KLH作为免疫原，免疫BALB/C小鼠，按常规的杂交瘤技术和极限稀释法制备和筛选单抗细胞株，然后将抗TTX的特异性抗体细胞株增殖培养，注射到BALB/C小鼠中制备腹水，制备所得腹水经50% (w/v)硫铵浓缩后，采用商业化的ftOtein-G亲和层析柱进行抗体的纯化；具体进行亲和层析纯化处理时，按照所附产品操作说明书进行。C.免疫磁珠的制备选用直径为50-200nm的磁珠，使用碳二甲胺(EDC)和琥珀酰亚胺(NHS)共价交联的方式将抗TTX单抗标记在磁珠上形成免疫磁珠；D.结合垫的处理将制备好的免疫磁珠悬浮液喷点在结合垫上以形成免疫磁珠标记结合垫；喷点时也可以采用人工手动喷液或定量喷液装置来进行。E.层析膜的包被用自动喷膜仪，以0. 8μ L/cm的速度，将选定浓度的TTX-BSA、山羊抗小鼠IgG分别喷点在层析膜的T线和C线处，喷点时线与线间的间隔距离为0. 5-1. Ocm ；包被后的层析膜于37°C的干燥箱中烘干4-6小时，置于干燥器中保存备用；F.试纸条的组装与制备将样品垫、结合了抗TTX免疫磁珠的结合垫、包被膜、吸水垫依次相互交错约Imm 粘贴在底板上，然后在上层覆盖透明塑料密封膜；根据要求宽度切割即可得到磁性免疫层析试纸条。免疫磁珠的制备方法如下
1)吸取 2mg 羧基磁珠于离心管中，用 500 μ L 0. OlM 含 0. 5% (v/v) Tween-20，ρΗ 为5. 0的MES溶液作为活化缓冲溶液清洗磁珠，将离心管置于磁分离架上使得磁珠与活化溶液分离，重复清洗几次，最后重悬磁珠；2)将新鲜配制的EDC和NHS加入磁珠悬液中活化羧基30min，反应结束后先用 MEST缓冲液洗涤磁珠，再用0. 005M硼酸盐吐温溶液(简称BST)作为偶联缓冲液洗涤磁珠 2遍；3)加入150 μ g抗TTX单克隆抗体，在旋转混合器上反应3小时；4)加入1 % (w/v) BSA溶液室温下反应30min ；5)用BST溶液洗涤免疫磁珠4次，将磁珠重悬，4°C保存备用。本发明与现有技术相比具有如下优点将超顺磁性纳米材料、免疫层析技术和磁性检测仪相结合，通过构建以免疫磁珠为标记物的免疫层析试纸条，既可满足定性检测需求，又能实现快速定量检测，具有灵敏度高、耗时短、方便易用等特点。
图1为以免疫磁珠为标记物的磁性免疫层析试纸条的结构示意图。图1所示的磁性免疫层析试纸条由依序排列的吸水垫1、层析膜2(硝酸纤维素膜)、结合垫3、样品垫4及PVC底板7组成。层析膜2上包被有两条线，其中5为检测线T， 喷点有TTX-BSA ；6为控制线C，喷点有山羊抗小鼠IgG。图2 5为应用所构建磁性免疫层析试纸条进行TTX检测的结果设定示意图。其中图2为采用所述磁性免疫层析试纸条对TTX阴性样品的检测结果即检测线T和控制线C均有显色条带。图3为采用所述磁性免疫层析试纸条对TTX的强阳性检测结果即检测线T处无显色条带，控制线C处有显色条带。图4为采用所述磁性免疫层析试纸条对TTX检测无效的结果即检测线T处有显色条带，而控制线C处无显色条带。图5为采用所述磁性免疫层析试纸条对TTX检测无效的结果即检测线T和控制线C均无显色条带。图6为采用所述磁性免疫层析试纸条对河豚鱼肌肉组织中加标TTX的定量检测曲线。图7为采用所述磁性免疫层析试纸条对河豚鱼肝脏组织中加标TTX的定量检测曲线。图8为采用所述磁性免疫层析试纸条对TTX检测河豚鱼样品的定性检测结果。其中①号为阴性肌肉对照；②号为阴性肝脏对照；③号为野生暗纹东方豚肌肉样品；④号为野生菊黄东方豚肌肉样品；
⑤号为野生黄鳍东方豚肌肉样品；⑥号为野生菊黄东方豚肝脏样品；⑦号为野生菊黄东方豚卵巢样品。为进一步说明本发明的快速检测TTX的磁性免疫层析试纸条及其制备方法，特举以下的实施例进行说明，该实施例是为了解释而不是以任何方式限制本发明。
具体实施例方式本发明所述的快速检测TTX的磁性免疫层析试纸条如图1所示，该试纸条是在底板7上依次交错Imm地粘贴上层析膜2、免疫磁珠标记结合垫3、样品垫4、吸水垫1，并在上层覆盖透明塑料密封膜组装而成的试纸条，层析膜上预包被有TTX-BSA检测线T和控制性 C0在具体实施例中所采用的TTX-BSA检测抗原及抗TTX特异性单抗都是非商业化产品。利用所述的磁性免疫层析试纸条进行TTX检测时采用的是竞争法检测原理，当待测样本中含有TTX分子时，TTX分子先与结合垫上的免疫磁珠结合。随着层析作用的进行，当经过检测线T时，未结合TTX分子的免疫磁珠与T线处的TTX-BSA检测抗原结合从而停留在T 线处，未被检测抗原捕获的免疫磁珠则继续前行；当经过控制线C时，C线处的二抗与免疫磁珠结合从而同样使磁珠停留在该处。整个层析反应在30分钟内完成，一般反应15分钟后，在检测线T和控制线C上出现肉眼清晰可见的显色条带。将试纸条放入磁性分析仪的读卡槽中，即可在T线处获得相应的磁信号检测值。阳性样品的T处磁信号值一般弱于阴性样品，差别越大就表示阳性反应越强。实施例1 磁性免疫层析法检测肌肉提取液中的TTX(1)检测抗原(TTX-BSA偶联物)的制备将TTX与牛血清白蛋白(BSA)按1 5 (w/ w)混合，加入4%甲醛溶液作为偶联剂，于30°C下旋转反应3d。反应完成后，将混合物取出后用商业化的PD-10脱盐柱，按照所附产品操作说明书对TTX-BSA偶联物进行脱盐，脱盐介质为 IOmMPBS (pH 7. 4)。(2)抗体的制备与纯化以TTX-KLH作为免疫原，免疫BALB/C小鼠，按常规的杂交瘤技术和极限稀释法制备和筛选单抗细胞株。然后将抗TTX的特异性抗体细胞株增殖培养，注射到BALB/C小鼠中制备腹水。制备所得腹水经50% (w/v)硫铵浓缩后，采用商业化的Protein-G亲和层析柱，按照所附产品操作说明书进行抗体的纯化。(3)免疫磁珠的制备选用直径为200nm的磁珠，吸取2mg羧基磁珠于离心管中， 用500 μ L0. OlM MEST作为活化缓冲溶液清洗磁珠，将离心管置于磁分离架上使得磁珠与活化溶液分离，重复清洗几次后重悬磁珠。随后将EDC和NHS加入磁珠悬液中活化羧基30min， 反应结束后先用MEST缓冲液洗涤磁珠，再用0. 005M BST作为偶联缓冲液洗涤磁珠2遍。 接着加入150 μ g抗TTX单克隆抗体，在旋转混合器上反应3小时。然后加入(w/v)BSA 溶液室温下封闭反应30min。反应结束后用BST溶液洗涤封闭后的免疫磁珠4次，弃去洗涤液，将磁珠重悬，4°C保存备用。(4)将制备好的免疫磁珠人工手动喷点在结合垫上制备成免疫磁珠标记结合垫。(5)层析膜的包被用IOmM PBS, pH7. 4的包被缓冲液将TTX-BSA检测抗原、山羊抗小鼠IgG分别稀释到0. 4mg/mlUmg/mL·然后用自动喷膜仪，以0. 8 μ L/cm的速度均勻喷
8点在层析膜上，进行层析膜的包被，形成TTX-BSA检测线T，和山羊抗小鼠IgG控制线C ；包被时线与线间的间隔距离为0. 5-1. Ocm ；包被后的层析膜(简称包被膜)于37°C的干燥箱中烘干4-6小时，置于干燥器中保存备用。(6)试纸条的制备将样品垫、免疫磁珠标记结合垫、包被膜、吸水垫依次相互交错约Imm粘贴在底板上，然后在上层覆盖透明塑料密封膜；切割成0. 5cm宽的试纸条备用。(7)样品的检测用经确认无毒的河豚鱼肌肉提取液梯度稀释TTX标准品作为样品。在试纸条的样品垫上加IOOyL样品，层析20min后观察结果。阴性结果为T线和C线均出现明显的条带；阳性结果为T线颜色较浅或不出现条带，而C线出现明显条带。也可将滴有待测样品液的磁性免疫层析试纸条装入专用的试纸条卡槽，插入磁信号阅读器MAR仪中阅读磁信号进行定量分析，绘制标准曲线。实施例2 磁性免疫层析法检测河豚鱼内脏组织中的TTX除了样品检测步骤中，检测样品为用经确认无毒的肝脏提取液梯度稀释TTX标准品。其它步骤同实例1。实施例3 磁性免疫层析法检测野生河豚鱼组织中的TTX(1)河豚鱼组织的样品制备以河豚鱼肌肉组织为例。取5g河豚鱼肌肉组织，剪碎，加入25ml 0. 1 %的乙酸， 煮沸搅拌lOmin。冷却至室温后4000rpm离心lOmin，上清转移入新的50ml离心管。沉淀再加入20ml 0. 乙酸，再煮沸;3min。冷却至室温后，所有的液体及煮沸的样品都加到离心管中，4000rpm离心lOmin。取上清，量体积，置分液漏斗中，加入等体积乙醚，脱脂2次。 将水层放入50ml容量瓶中。用IM氢氧化钠调节提取液中的pH值至6. 5 7. 4，然后加入 PBS至50ml，提取液4°C保存备用。(2)样品检测在构成免疫层析检测试纸条的样品垫上加100 μ L样品，层析20min后观察结果。 阴性结果为T线和C线均出现明显的条带；阳性结果为T线颜色较浅或不出现条带，而C线出现明显条带。也可将滴有待测样品液的磁性免疫层析试纸条装入专用的试纸条卡槽，插入磁信号阅读器MAR仪中阅读磁信号进行定量检测，结合标准曲线，计算出待测样品中TTX 的浓度。所构建的磁性免疫层析试纸条用磁性分析仪(Magnetic Assay Reader，简称MAR 仪)进行检测，依据样品层析后形成的检测线和控制线的磁信号检测值，可实现TTX的定量检测。(3) ELISA试剂盒法检测采用市售的ELISA试剂盒(中国疾病预防控制中心)，按照产品说明书处理样品、 制备标线，依据标线计算TTX的含量。两种方法的检测结果如下表所示
权利要求
1.一种快速检测TTX的磁性免疫层析方法，其特征在于将样品垫、经抗TTX特异性鼠系单克隆抗体修饰的磁珠标记的结合垫、预包被有TTX-BSA检测抗原的检测线T和山羊抗小鼠IgG的控制线C的层析膜、吸水垫依次相互交错约Imm粘贴在底板上，然后在上层覆盖透明塑料密封膜，组建成一种可快速检测TTX的磁性免疫层析试纸条；通过层析作用捕获免疫磁珠，依据样品层析后形成肉眼可见的1 2条显色条带，实现TTX的快速定性检测； 将所构建的磁性免疫试纸条通过磁性分析仪进行检测，依据样品层析后形成的检测线和控制线的磁信号检测值可实现TTX的定量检测。
2.如权利要求1所述的快速检测河豚毒素TTX的磁性免疫层析方法，试纸条，其特征在于所述的抗TTX特异性单抗是采用杂交瘤技术制备筛选所得、对TTX有特异性反应的特异性单抗体。
3.如权利要求1所述的快速检测河豚毒素TTX的磁性免疫层析方法，其特征在于所述的层析试纸条的制备方法如下A.检测抗原TTX-BSA偶联物的制备将TTX与牛血清白蛋白(BSA)按1 5(w/w)混合，加入4%甲醛溶液作为偶联剂，于 30°C下旋转反应3d，反应完成后，将混合物取出后用商业化的PD-10脱盐柱，脱盐介质为pH 7. 4 的 IOmM PBS (pH 7. 4)；B.抗体的制备与纯化以TTX-KLH作为免疫原，免疫BALB/C小鼠，按常规的杂交瘤技术和极限稀释法制备和筛选单抗细胞株，然后将抗TTX的特异性抗体细胞株增殖培养，注射到BALB/C小鼠中制备腹水，制备所得腹水经50% (w/v)硫铵浓缩后，采用商业化的ftOtein-G亲和层析柱进行抗体的纯化；C.免疫磁珠的制备选用直径为50-200nm的磁珠，使用碳二甲胺和琥珀酰亚胺共价交联的方式将抗TTX单抗标记在磁珠上形成免疫磁珠；D.结合垫的处理将制备好的免疫磁珠悬浮液喷点在结合垫上以形成免疫磁珠标记结合垫；E.层析膜的包被用自动喷膜仪，以0. 8 μ L/cm的速度，将选定浓度的TTX-BSA、山羊抗小鼠IgG分别喷点在层析膜的T线和C线处，喷点时线与线间的间隔距离为0. 5-1. Ocm ；包被后的层析膜于 37°C的干燥箱中烘干4-6小时，置于干燥器中保存备用；F.试纸条的组装与制备将样品垫、结合了抗TTX免疫磁珠的结合垫、包被膜、吸水垫依次相互交错约Imm粘贴在底板上，然后在上层覆盖透明塑料密封膜；根据要求宽度切割即可得到磁性免疫层析试纸条。
4.如权利要求1所述的快速检测TTX的磁性免疫层析方法，其特征在于，免疫磁珠的制备方法如下1)吸取2mg羧基磁珠于离心管中，用500 μ L 0.0IM含0.5% (v/v) Tween-20，pH为5. 0 的MES溶液作为活化缓冲溶液清洗磁珠，将离心管置于磁分离架上使得磁珠与活化溶液分离，重复清洗几次，最后重悬磁珠；2)将新鲜配制的EDC和NHS加入磁珠悬液中活化羧基30min，反应结束后先用MEST缓冲液洗涤磁珠，再用0. 005M硼酸盐吐温溶液(简称BST)作为偶联缓冲液洗涤磁珠2遍；3)加入150μ g抗TTX单克隆抗体，在旋转混合器上反应3小时；4)加入(w/v)BSA溶液室温下反应30min；5)用BST溶液洗涤免疫磁珠4次，将磁珠重悬，4°C保存备用。
全文摘要
本发明涉及一种快速检测TTX的磁性免疫层析方法及检测试纸条的制备，属于河豚毒素检测技术领域。将样品垫、经抗TTX特异性鼠系单克隆抗体修饰的磁珠标记的结合垫、预包被有TTX-BSA检测抗原的检测线T和山羊抗小鼠IgG的控制线C的层析膜、吸水垫依次相互交错约1mm粘贴在底板上，然后在上层覆盖透明塑料密封膜，组建成一种可快速检测TTX的磁性免疫层析试纸条；通过层析作用捕获免疫磁珠，依据样品层析后形成肉眼可见的1～2条显色条带，实现TTX的快速定性检测；将所构建的磁性免疫试纸条通过磁性分析仪进行检测，依据样品层析后形成的检测线和控制线的磁信号检测值可实现TTX的定量检测。
文档编号G01N33/531GK102426222SQ201110259579
公开日2012年4月25日 申请日期2011年9月5日 优先权日2011年9月5日
发明者刘源, 卢瑛, 王锡昌, 郑诚 申请人:上海海洋大学