专利名称：有机磷农药生物标志物的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种有机磷农药生物标志物的电化学检测方法。利用肟类复活剂对抑制后乙酰胆碱酯酶(AChE)的复活作用，通过酶活性的变化测定有机磷农药生物标志物的含量，用于评估生物体内有机磷农药暴露的情况。
背景技术：
大多数有机磷农药(organophosphorous pesticides, OPs)显示出低的环境持久性，但长时间、大面积使用或接触这类农药已经给生态环境和人类健康带来了巨大威胁，对其所产生的生物效应和环境风险进行评价已成为分析化学和农药化学领域最重要的研究内容之一。OPs的毒作用机制是它能与机体内的胆碱酯酶(cholinesterase，ChE)的活性位点的丝氨酸羟基共价结合，形成磷酰化胆碱酯酶复合物(OP-ChE)，导致酶的活性降低而不能催化水解作为神经递质的乙酰胆碱，使神经传导受阻。目前的检测方法都是通过测定酶活性的降低并于标准值进行比较，来判断有机磷农药的中毒状况。但是，由于个体间胆碱酯酶的含量差异，导致标准值的波动很大，从而对于低剂量有机磷农药暴露无法准确定量。 OP-ChE作为有机磷农药生物标志物，为早期监测有机磷农药的接触水平和预测可能的毒性作用提供了新途径。因此，发展快速、灵敏、高效、安全的OP-ChE的检测方法对监测机磷农药暴露十分必要。肟类化合物，如解磷定(Pralidoxime，PAM-C1/I)、双复磷(Obidoxime,DM04)、双解磷(Trimedoxime，TMB4)，HI-6等，是一类胆碱酯酶复活剂，它们能使乙磷酰化胆碱酯酶加合物(OP-AChE)中被抑制的酶脱离出来，完全恢复酶的活性，即复活过程。因此，复活后的乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)含量可作为个体的标准值，避免了个体之间正常AChE的水平差异。基于此思想，申请人提出了一种新的有机磷农药生物标志物的检测方法，分别测量复活前、后AChE的活性，根据两者之间的活性差异，得到对应乙磷酰化胆碱酯酶加合物(OP-AChE)含量，从而判断农药的接触水平。该方法无需标准AChE含量作为基线，克服了个体差异的影响，为监测低剂量有机磷农药暴露提供了新途径。
发明内容
本发明提出了一种新的有机磷农药生物标志物的检测方法。该方法分别测量复活前、后乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性，根据两者之间的活性差异，得到对应乙磷酰化胆碱酯酶加合物(OP-AChE)含量，从而判断农药的接触水平。该方法以复活后AChE含量作为个体自身的基准，消除了个体间正常水平AChE的变异性。本发明的技术方案有机磷农药的电化学检测方法第一步四氧化三铁与金纳米(Fe304/AuNPs)磁性纳米粒子制备1)将0. Olwt %的四氯化金IOOmL溶液在搅拌的条件下加热煮沸，随后一次性加入 1. 0衬％柠檬酸三钠溶液2. 5mL，待溶液颜色变成酒红色金胶溶液后，使金胶溶液继续搅拌lOmin，再停止加热使其冷却至室温，保存于4°C冰箱中备用；2)取IOmg羧基化磁性纳米粒子(Fe3O4-COOH)加入到IOmL含O. 20wt%聚二甲基二烯丙基氯化铵(Poly(diallyldimethylammonium chloride, PDDA)的 2OmM Tris/NaCl 溶液中，超声振荡30min，用磁铁进行磁分离、蒸馏水洗涤，弃去多余的PDDA，得到洁净的 PDDA-Fe3O4磁性纳米粒子；再把PDDA-Fe3O4和50mL步骤1)制备的金胶溶液进行混合搅拌 30min，带负电的金纳米粒子自组装到带正电的PDDA-Fe3O4纳米粒子表面，磁铁磁分离，蒸馏水洗涤，配成lmg/mL核壳式Fe304/AuNPs磁性纳米粒子。第二步磷酰化乙酰胆碱酯酶加合物OP-AChE的制备对氧磷(paraoxon，OP)作为有机磷农药的模型分子，制备乙酰胆碱酯酶加合物 (OP-AChE)。将对氧磷溶解在乙醇溶液中，用pH 7.0磷酸缓冲溶液(PBS)稀释成不同浓度的溶液；取1. OmL含有3nM AChE的PBS溶液与一系列不同浓度的对氧磷(对氧磷的最终浓度分别为0. Ing/mL, 0. 2ng/mL, 0. 5ng/mL, Ing/mL, 2ng/mL, 5ng/mL, lOng/mL, 15ng/mL)混合， 在37°C下温浴反应30min，得到不同抑制程度的乙酰胆碱酯酶(AChE)，即生成了不同浓度的 OP-AChE。第三步=OP-AChE的复活及吸附取制备好的不同浓度的1. OmLOP-AChE与等体积的5mM碘解磷定(Pralidoxime iodide, 2-PAM)混合反应15min，让抑制的AChE完全恢复活性，然后加入50 μ L氯化乙酰硫代胆碱(Acetylthiocholine chloride, ATC1)，ATCl 最终浓度为 3mM，温浴反应 5min，使其充分反应，产生硫代胆碱(thiochline)，再加入制备好的250 μ L浓度为lmg/mLFe304/AuNPS 磁性纳米粒子，震荡摇勻30min，磁铁磁分离，蒸馏水洗涤，形成待检测的Fe304/AuNPS-硫代胆碱纳米复合物；作为对照，未受对氧磷抑制的3nM乙酰胆碱酯酶(AChE)与同样浓度的氯化乙酰硫代胆碱混合后加入同样的Fe3O4AuNPs磁性纳米粒子；第四步线性扫描法测定取20 μ L上述自组装好的Fe304/AuNPs-硫代胆碱悬液滴于工作电极表面，印刷电极下放置一块磁铁，在外加磁场的作用下，Fe304/AuNPS-硫代胆碱紧附于工作电极表面，再滴加50 μ L磷酸缓冲溶液(PBS)，用线性扫描法进行电化学检测，在扫速为50mV/s，电位扫描范围0. 2 1. 2V条件下电化学检测；作为对照，未受对氧磷抑制的3nM乙酰胆碱酯酶与同样浓度的氯代乙酰硫代胆碱混合后反应，用上述同样的方式进行检测，抑制率和复活率按如下公式计算1%= (io-it)/ioX100%I1V0= (ir-it)/irX100%R%= (ir-it)/(i0-it) X100%其中i。和it分别来自未经过农药抑制和经过农药抑制后的乙酰胆碱酯酶和氯代乙酰硫代胆碱溶液反应的峰电流，i,为乙酰胆碱酯酶复活后测得的峰电流。本发明有益效果1、核壳式Fe3O4AuNPs磁性纳米粒子。一方面，由于其磁性核的存在，可以通过磁分离进行分离、纯化。另一方面，AuNPs附着于Fe3O4表面有较大的比表面积，对硫代胆碱有更强的富集能力，并加速了电子的传递。2、被抑制的AChE被肟类完全复活，样品复活后的ChE含量减去复活前活性ChE含量，即可得到OP-AChE的含量。3、以样品自身复活后的AChE为基准，无需基线对照，避免了个体间正常AChE水平的差异，使得检测更加可靠和精准。
图1核壳式Fe304/AuNPs磁性纳米粒子组装和硫代胆碱检测的原理示意2四氧化三铁(Fe3O4)和Fe304/AuNPs磁性纳米粒子的透射/扫描电镜图中图a与图c是Fe3O4和Fe304/AuNPs磁性纳米粒子的透射电镜图，说明诸多颗粒状金纳米AuNPs存在；图b与图d是Fe3O4和Fe304/AuNPs的扫描射电镜图，显示了金纳米(AuNPs)均勻的包裹在四氧化三铁(Fe3O4)的表面。图30P_AChE加合物的检测原理有机磷农药和AChE结合形成加合物OP-AChE，抑制了酶的活性。使用碘解磷定 (Pralidoxime iodide, 2-PAM)后，被抑制的AChE的活性得以恢复。通过反应途径①，测定被有机磷抑制的AChE样品经2-PAM复活后酶的活性，得到AChE的总量；通过反应途径②， 测定被农药抑制后样品中酶的活性。那么，被抑制的AChE的量，即形成加合物OP-AChE的含量，就等于总酶量减去活性酶量的差值。这种检测机制是建立在复活剂对酶活恢复效率很高且可以把复活后的酶活作为基准的基础上的。表IOP-AChE 的检测通过AChE酶活的标准曲线计算得到的受不同浓度对氧磷抑制和复活后的样品中 AChE的浓度，从而计算得到OP-AChE加合物的含量。测得结果如表1。表 权利要求
1.有机磷农药生物标志物的检测方法，其特征是电化学检测方法，测定分两个步骤 第一步乙酰胆碱酯酶加合物的复活及吸附分别取1. OmL浓度为0. lng/mL,0. 2ng/mL、0. 5ng/mL、lng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL 和 15ng/mL 的对氧磷抑制的乙酰胆碱酯酶混合液，与等体积的5mM碘解磷定混合反应15mi n，让抑制的乙酰胆碱酯酶完全恢复活性， 然后加入50 μ L氯化乙酰硫代胆碱，氯化乙酰硫代胆碱的最终浓度为3mM，温浴反应5min， 使其充分反应，产生硫代胆碱，再加入制备好的250 μ L浓度为lmg/mL Fe3O4AuNPs磁性纳米粒子，震荡摇勻30min，磁铁磁分离，蒸馏水洗涤，形成待检测的Fe304/AuNPS-硫代胆碱纳米复合物；作为对照，未受对氧磷抑制的3nM乙酰胆碱酯酶与同样浓度的氯化乙酰硫代胆碱混合后加入同样的Fe304/AuNPs磁性纳米粒子；第二步线性扫描法测定取20 μ L上述自组装好的Fe304/AuNPS-硫代胆碱悬液滴于工作电极表面，印刷电极下放置一块磁铁，在外加磁场的作用下，Fe304/AuNPS-硫代胆碱紧附于工作电极表面，再滴加50 μ L磷酸缓冲溶液，用线性扫描法进行电化学检测，在扫速为 50mV/s,电位扫描范围0. 2 1. 2V条件下电化学进行检测；作为对照，未受对氧磷抑制的 3nM乙酰胆碱酯酶与同样浓度的氯代乙酰硫代胆碱混合后反应，用上述同样的方式进行检测，抑制率和复活率按如下公式计算 1%= (io-it)/ioX100% I1V0= (ir-it)/irX100% R%= (ir-it)/(i0-it) X100%其中i。和it分别来自未经过农药抑制和经过农药抑制后的乙酰胆碱酯酶和氯代乙酰硫代胆碱溶液反应的峰电流，k为乙酰胆碱酯酶复活后测得的峰电流。
2.权利要求1中所用Fe304/AuNPS磁性纳米粒子制备方法，其特征在于，制备步骤如下1)将0.Olwt %的四氯化金IOOmL溶液在搅拌的条件下加热煮沸，随后一次性加入 1. Owt %柠檬酸三钠溶液2. 5mL，待溶液颜色变成酒红色金胶溶液后，使金胶溶液继续搅拌 lOmin，再停止加热使其冷却至室温，保存于4°C冰箱中备用；2)取IOmg羧基化磁性纳米粒子加入到IOmL含0.20wt %聚二甲基二烯丙基氯化铵溶液的20mM Tris/NaCl溶液中，超声振荡30min，磁铁磁分离、蒸馏水洗涤，弃去多余的PDDA， 得到洁净的PDDA-Fe3O4磁性纳米粒子；再把PDDA-Fe3O4和50mL步骤1)制备的金胶溶液进行混合搅拌30min，带负电的金纳米粒子自组装到带正电的PDDA-Fe3O4纳米粒子表面，磁铁磁分离，蒸馏水洗涤重悬浮，配成lmg/mLFe304/AuNPS核壳式磁性纳米粒子。
全文摘要
本发明公开了有机磷农药生物标志物的检测方法。该方法利用肟类复活剂对抑制后乙酰胆碱酯酶(AChE)的复活作用，用线性扫描法分别测量复活前、后AChE的活性，根据两者之间的活性差异，得到对应乙酰胆碱酯酶加合物OP-AChE含量，从而判断农药的接触水平。该方法以复活后AChE含量作为个体自身的基准，消除了个体间正常水平AChE的变异性。
文档编号G01N27/48GK102507714SQ20111034957
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月7日 优先权日2011年11月7日
发明者张爱东, 杜丹, 陶媛 申请人:华中师范大学