专利名称：一种新型水溶性巯基荧光探针及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种新型水溶性巯基荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术：
巯基(-SH)是细胞中化学活性最高的基团之一。在蛋白质中，巯基部分是与酶活性相关的反应活性最高的官能团。细胞中的巯基化合物，尤其是谷胱甘肽，做为生物体内一种重要的抗氧化剂，它能够清除掉人体内的自由基，清洁和净化人体内环境污染，从而增进了人的身心健康。特别是还原型谷胱甘肽(GSH)本身易受某些物质氧化，所以它在体内能够保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基不被如自由基等有害物质氧化，从而让蛋白质和酶等分子发挥其生理功能。随着巯基官能团在生物体内的重要生理作用逐渐被认识，鉴别和定量测定生物巯基化合物的方法日益受到关注。传统的检测方法有硝普盐法、碘量法、电流分析法、分光光度法、比色法等，但这些方法存在灵敏度低(毫摩尔级以上才能检测)、操作复杂、选择性差等缺点，不能适应有些生物样品中巯基化合物的测定，因此需要合成一些高灵敏度的分析检测试剂。荧光测定法由于其成本低，可重复性好，测定灵敏，选择性高，并且能够实现可视化观测，是一种非常好的测定手段。因此，新型的巯基荧光检测试剂成为研究的焦点。巯基荧光探针由于检测灵敏度高，并可作为生物结构研究指示系统，因而被广泛应用到研究蛋白质结构和微环境性质、微量检测胆碱酶或谷胱甘肽S-转移酶、组织化学染色、抗原-抗体反映的监测和定位、疾病的诊断、HPLC分析巯基化合物等领域。已报道的巯基荧光探针有芳基卤化物、丹磺酰氮丙啶类等，它们具有较好的灵敏度，对巯基的检测限一般在纳摩尔(nmol)左右，但这些探针自身都有较强的荧光，用于活细胞成像时会造成较低的信噪比；还有一类如苯并呋喃磺酰卤，虽然自身荧光较弱，但需要在碱性条件及高于室温下与巯基衍生，也无法应用于活细胞成像。最常用来衍生巯基的试剂是乙酰卤衍生物，主要是碘乙酰胺衍生物，它和巯基反应快，在室温和生理pH下即可进行，但产物容易失去荧光团，并且自身对光不稳定。这些现存的巯基荧光探针均不能很好的满足生物荧光检测和荧光成像的要求。我们通过研究发现含2_(2'-羟基苯基)苯并咪唑(HPBI)结构的小分子荧光化合物是一类具有激发态质子转移(ESIPT)特性的荧光化合物，具有斯托克斯(Stokes)位移大，荧光量子收率高，能与过渡金属形成比较稳定的配合物等优点，可作为新型功能荧光分子探针的特色荧光团。我们以2-(2'-羟基苯基)苯并咪唑(HPBI)类化合物作为配体，设计合成了新的二价铜离子配合物，开展了过渡金属配合物类巯基荧光探针的初步研究。实验结果表明，HPBI类荧光化合物与顺磁性的二价铜配合之后，发生了消光作用。这是由于激发态质子转移(ESIPT)机理，基于HPBI结构的功能荧光探针分子可以在光激发条件下形成烯醇式和酮式互变异构体产生较强的荧光。随着铜离子的加入，形成了新的复合物使得 ESIPT过程受阻，探针分子荧光消失。还原型谷胱甘肽(GSH)加入后与二价铜离子形成了新的复合物，使探针化合物游离出来，ESIPT过程得以恢复，并产生荧光。基于此原理我们可以发展一种快速、简便的用于检测GSH的方法。
发明内容
本发明的目的是针对上述存在问题，提供一种新型水溶性巯基荧光探针及其制备方法，该荧光探针生物相容性好，可用于活细胞中GSH成像测定，植入生物体内测定真实的巯基化合物浓度变化，有利于相关疾病的诊断，并提供一种快速、简便的用于检测还原型谷胱甘肽(GSH)的方法。本发明的技术方案一种新型水溶性巯基荧光探针，化合物名称为2_[5' _(三甲基季铵盐基)_乙酰胺基-2'-羟基苯基]苯并咪唑(TMACA-HPBI)，其化学分子式为C18H21N4O2Cl,该化合物以 2-(2'-羟基苯基)苯并咪唑(HPBI)结构作为荧光发色团，以三甲基氯化铵作为亲水性基团提高分子的水溶性，熔点高于300°C，溶于水后在波长为365nm的紫外灯照射下发出蓝色
荧光，该荧光探针的分子结构式为
权利要求
1.一种新型水溶性巯基荧光探针，其特征在于化合物名称为2-[5' _(三甲基季铵盐基)-乙酰胺基-2'-羟基苯基]苯并咪唑(TMACA-HPBI)，其化学分子式为C18H21N4O2Cl,该化合物以2-(2'-羟基苯基)苯并咪唑(HPBI)结构作为荧光发色团，以三甲基氯化铵作为亲水性基团提高分子的水溶性，熔点高于300°C，溶于水后在波长为365nm的紫外灯照射下发出蓝色荧光，该荧光探针的分子结构式为
2.一种如权利要求I所述新型水溶性巯基荧光探针的制备方法，其特征在于步骤如下1)将苯胺溶于水中得到苯胺水溶液，加入浓盐酸使苯胺完全溶解，冰浴冷却到0-4°C， 得到苯胺盐酸盐溶液，将亚硝酸钠溶于水中得到亚硝酸钠水溶液，冰浴冷却到0-4°C后以每秒钟1-2滴的速度滴加到上述苯胺盐酸盐溶液中，制得苯胺重氮盐溶液；2)将NaOH水溶液加入水杨醛中得到水杨醛溶液，在0°C温度下将苯胺重氮盐溶液以每秒钟3-4滴的速度滴加到水杨醛碱水溶液中，同时滴加质量百分比浓度为20%的Na2CO3 溶液保持PH为7-8，待苯胺重氮盐溶液滴加完毕后，将沉淀物用无水乙醇重结晶，即可制得 2-轻基-5-偶氮苯基水杨醒；3)将2-羟基-5-偶氮苯基水杨醛、亚硫酸氢钠溶解于无水乙醇中，在20-25°C温度下搅拌得到混合溶液，将邻苯二胺溶解在N，N- 二甲基甲酰胺中得到邻苯二胺溶液，然后将邻苯二胺溶液滴加到上述混合溶液中，在78-80°C温度下反应1-3小时，将反应物倒入冷水， 析出黄色沉淀，抽滤、真空干燥后，再用丙酮重结晶两次，制得2-(5'-偶氮苯基-2'-羟基苯基)苯并咪唑；4)将2-(5'-偶氮苯基-2'-羟基苯基)苯并咪唑、质量百分比含量为80%的水合肼、质量百分比含量为5% Pd/C催化剂与无水乙醇混合，在78-80°C温度下反应30-60分钟，然后趁热过滤，将滤液浓缩至有晶体析出，抽滤后滤饼用乙醇重结晶，制得2- (5'-氨基-2 ^ -羟基苯基)苯并咪唑；5)将2-(5'-氨基-2'-羟基苯基)苯并咪唑加入到丙酮中得到丙酮溶液，在60°C条件下搅拌至溶解，冷却至室温后加入氯乙酰氯和三乙胺，在20-25°C温度下搅拌3-5小时， 将该溶液倒入水中，出现淡黄色沉淀，静置1-2小时，抽滤后用水冲洗滤饼2-3次，干燥后制得2-(5'-氯乙酰氨基-2'-羟基苯基)苯并咪唑；6)将2-(5'-氯乙酰氨基-2'-羟基苯基)苯并咪唑和质量百分比浓度为33%的三甲胺乙醇溶液加入到无水乙醇中，在70-80°C温度下搅拌24-48小时，减压蒸出乙醇体积的 95%,冷却到20-25°C后加入剩余溶液体积50倍的乙醚，得到白色沉淀，抽滤、干燥，得到白色粉末即为目标产物-2-[5' _(三甲基季铵盐基)_乙酰胺基-2'-羟基苯基]苯并咪唑 (TMACA-HPBI)。
3.根据权利要求2所述新型水溶性巯基荧光探针的制备方法，其特征在于所述苯胺水溶液的质量百分比浓度为12-14%，浓盐酸的质量百分比浓度为37%，苯胺水溶液与浓盐酸体积比为8 : 3 ;所述亚硝酸钠水溶液的质量百分比浓度为30 %，亚硝酸钠水溶液与苯胺盐酸盐溶液的体积比为I : 4。
4.根据权利要求2所述新型水溶性巯基荧光探针的制备方法，其特征在于所述NaOH 水溶液的质量百分比浓度为1%，氢氧化钠水溶液与水杨醛质量比为50 I,水杨醛溶液与苯胺重氮盐溶液体积比为6 I。
5.根据权利要求2所述新型水溶性巯基荧光探针的制备方法，其特征在于所述2-羟基-5-偶氮苯基水杨醛、亚硫酸氢钠与无水乙醇的质量比为2 I 150，邻苯二胺溶解与 N，N-二甲基甲酰胺的质量比为I : 10，邻苯二胺溶液与混合溶液体积比为I : 12。
6.根据权利要求2所述新型水溶性巯基荧光探针的制备方法，其特征在于所述 2~ (5'-偶氮苯基-2'-羟基苯基)苯并咪唑、质量百分比含量为80%的水合肼、质量百分比含量为5% Pd/C催化剂与无水乙醇的质量比为13 30 I 320。
7.根据权利要求2所述新型水溶性巯基荧光探针的制备方法，其特征在于所述 2~ (5'-氨基-2'-羟基苯基)苯并咪唑与丙酮的的质量比为I : 4，丙酮溶液与氯乙酰氯和三乙胺的体积比为20 : 2 : 3。
8.根据权利要求2所述新型水溶性巯基荧光探针的制备方法，其特征在于所述 2~& -氯乙酰氨基-2'-羟基苯基)苯并咪唑、质量百分比浓度为33%的三甲胺乙醇水溶液与无水乙醇的质量比为I : 2 : 90。
9.一种如权利要求I所述新型水溶性巯基荧光探针的的应用，其特征在于用于水溶液中生物巯基化合物及活体肿瘤细胞的检测，方法如下1)将所述荧光探针配制成 ομ M的水溶液，然后与Cu2+反应形成配合物型荧光探针， 再加入含有不同巯基化合物的待测样品水溶液，测定样品中还原型谷胱甘肽(GSH)浓度， 用于GSH浓度体外快速诊断；2)将上述配合物探针与活体细胞共同培养，与正常细胞L929作用前后无变化，与肿瘤细胞Hela作用后，可以在荧光电子显微镜下观测到细胞内和细胞膜发出蓝绿色荧光，可用于检测活体肿瘤细胞。
全文摘要
一种新型水溶性巯基荧光探针，是以季铵盐修饰的2-(2′-羟基苯基)苯并咪唑(HPBI)类化合物，化合物的结构是2-[5′-(三甲基季铵盐基)-乙酰胺基-2′-羟基苯基]苯并咪唑。该荧光探针可用于水溶液中生物巯基化合物及活体肿瘤细胞的检测，即选择性的与二价铜离子配位，所得配合物可以进入活细胞中，与巯基化合物作用，使荧光化合物重新变为游离态分子并恢复荧光。本发明的优点是具有良好的水溶性和生物相容性，较高的巯基测定灵敏度，GSH反应前后荧光变化迅速且荧光稳定，能够长期保存使用，该荧光探针为研究生物巯基相关的生物信号通路，以及巯基在一些疾病或生物体内过程中的意义及诊断提供了较好的研究方法。
文档编号G01N21/64GK102585802SQ20121002238
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月31日 优先权日2012年1月31日
发明者梁文睿, 欧阳杰, 王秋生 申请人:天津理工大学