专利名称：一种海胆多糖的提取、纯化及鉴定方法
技术领域：
本发明属于海洋生物医药领域，特别涉及海胆多糖的提取、纯化及鉴定方法。
背景技术：
现代医学和临床药理学研究表明，海胆多糖是一种硫酸多糖，具有抗凝血、降血月旨、抗慢性肾衰、抗肿瘤、抗病毒、促进组织再生、抑制胃溃疡、增强机体免疫机能等多种生理活性，尤其是其确切的抗癌特性给肿瘤医学的发展带来了新的希望。目前多糖类物质的提取多采用水提法、酸提法、碱提取法等来获取粗多糖，这些方法比较耗时、提取率低、且容易污染环境；而且常规方法提取的海胆多糖在提纯后，提取纯度越高，生物活性越差。再者，目前动物多糖的鉴定一直是一个行业难题。薄层色谱鉴定虽然简单、快速，但必须事先进行降解，导致实验误差较大，不适用于较严格的质量控制体系；而应用传统大型仪器，如高效液相色谱法、质谱、核磁共振等进行鉴定，前处理周期长、费用高、处理量有限，不适用于工业化大生产。
发明内容
本发明旨在提供一套海胆多糖的提取、纯化及鉴定方法，通过设计筛选成熟的工艺步骤和工艺参数，以得到纯度高、生物活性好、质量稳定的海胆多糖产品。为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案
一种海胆多糖的提取方法，其特征在于，包括如下依次进行的步骤
a、海胆洗净、晾干，采用气流粉碎机进行超微粉碎至500-3000目；
b、将步骤a所得的产物采用丙酮浸溃0.5h，之后挥干丙酮；
C、加入适量蒸馏水，采用微波法提取海胆多糖，所述微波法设置微波功率为400W、温度为70°C、固液比为I :20、提取时间为30 min、提取次数为I次；
d、加入壳聚糖固定化木瓜蛋白酶和a-淀粉酶，在55°C下恒温搅拌10 h ；
e、离心，取上清液加入两倍量乙醇，静置5h，离心，干燥沉淀物，即得海胆多糖粗品。所述的提取方法制得的海胆粗多糖的纯化方法，其特征在于，包括如下依次进行的步骤
f、将已纯化的海胆多糖单克隆抗体置于Affi-gelHz偶联液中，调整pH至5. 5、温度为4°C，透析8-12小时；之后加入高碘酸钠，常温密闭条件下混匀I h，再加入甘油混合10min,之后置于Affi-gel Hz偶联液中透析；
g、室温下，将f步骤所得产物与Affi-GelHz hydrazide gel搅拌反应24 h,制成海胆多糖单克隆抗体-Gel悬浮液；
h、将海胆多糖单克隆抗体-Gel悬浮液加入到300mmX28mmi.d.的纯化柱中，用PB和PBS缓冲液分别洗涤后，4°C贮藏备用；所述PB缓冲液的制备方法为取0. 8 g NaH2PO4,4. 4g Na2HPO4*7H20、29. 2 g NaCl，加800 ml水溶解，调节pH至7. 0，加水定容到1000ml即得；所、述PBS 缓冲液的制备方法为:取8.0 g NaCUO. 2 g KH2PO4'0. 2 g KC1、2.9 g Na2HPO4* 12H20加蒸馏水至900 mL，调节pH至7. 4，加入0. 02%的叠氮化钠定容到IOOOml即得；
i、将海胆多糖粗品溶于上样缓冲液中，过柱，洗涤液洗涤除去杂质，4°C静置2 h，再用洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥，获得海胆多糖纯品；所述上样缓冲液的制备方法为:取0.2 g NaH2PO4U. I g Na2HPO4.7H20、2. 92 g NaCl，加800 ml水溶解，并加入50 ml 甲醇，调节PH至7. 0，加水定容到IOOOml即得；所述洗涤液的制备方法为取0. 2 g NaH2PO4,LI g Na2HP04*7H20、2. 92 g NaCl，加 800 ml 水溶解，调节 pH 至 7. 0，加水定容到 1000ml 即得；所述洗脱液的制备方法为取 0. 8 g NaH2PO4,4. 4 g Na2HP04.7H20、29. 2 g NaCl 加 500ml水溶解，并加入300 ml甲醇，调节pH至7. 0，加水定容到IOOOml即得；j、洗脱完成后，免疫亲和层析柱再用PBS缓冲液洗涤，4°C保存再利用。
所述的纯化方法制得的海胆多糖的鉴定方法，其特征在于，包括如下依次进行的步骤
k、采用还原胺法，以海胆多糖与牛血清白蛋白或者人血清白蛋白为原料合成海胆多糖人工抗原；
I、将海胆多糖人工抗原与待测样品分别点于硝酸纤维素膜上，37°C静置2 h ；m、将膜浸入10%的小牛血清溶液中，在37°C条件下封闭2 h，采用PBS-T以10 min/次的速度洗膜2次；所述PBS-T的制备方法为取8.0 g NaCUO. 2 g KH2PO4'0. 2 g KCl,2. 9 gNa2HPO4.12H20，加入 0. 5 mL Tween-20，加水定容到 1000 ml 即得；
n、将膜浸入海胆多糖单克隆抗体溶液中孵育2 h，采用PBS-T洗膜I h ;
0、将膜浸入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗溶液中孵育I h，PBS-T洗膜30
min ；
P、对膜进行ECL显影。本方明的有益效果
1、本发明采用超微粉碎机将海胆进行预处理，大大缩短了微波提取和壳聚糖固定化酶提取时间，提升了提取率，其特点是节能、节省溶剂、污染小、且可避免高温引起的分解。同时，采用超微粉碎与微波提取结合使用的方法，增加了海胆多糖溶解性，改变了常规方法提取的海胆多糖提纯后，不溶于冷水，不溶于一般有机溶剂的特性，易于海胆多糖药物生产过程的质量控制。2、针对目前海胆多糖提取纯度越高生物活性越差的不足，我们以单克隆抗体技术为基础，采用免疫亲和层析法纯化多糖。利用抗原与抗体的特异性结合反应，获得了满意的纯化效果，所得产品选择性强、纯化效率高并保持高生物活性。3、采用斑点免疫印迹法鉴定海胆多糖，实验误差小，处理周期短，较符合工业化大生产的需要。下面结合药理实验说明本方明方法所得产品的生物活性
本发明方法所得海胆多糖产品对肿瘤细胞的抑制作用研究实验
I、选用复苏的人肺腺癌细胞系A549、人乳腺癌细胞系MCF7、宫颈癌细胞系Hela、鼠肉瘤细胞株S-180、人结肠癌细胞HT-29，以MTT法测定。结果见表I。表I MTT法测定海胆多糖对肿瘤细胞的体外抑制作用
权利要求
1.ー种海胆多糖的提取方法，其特征在于，包括如下依次进行的步骤 a、海胆洗浄、晾干，采用气流粉碎机进行超微粉碎至500-3000目； b、将步骤a所得的产物采用丙酮浸溃O.5 h，之后挥干丙酮； C、加入适量蒸馏水，采用微波法提取海胆多糖，所述微波法设置微波功率为400W、温度为70°C、固液比为I :20、提取时间为30 min、提取次数为I次； d、加入壳聚糖固定化木瓜蛋白酶和α-淀粉酶，在55°C下恒温搅拌10 h ； e、离心，取上清液加入两倍量こ醇，静置5h，离心，干燥沉淀物，即得海胆多糖粗品。
2.按照权利要求I所述的提取方法制得的海胆粗多糖的纯化方法，其特征在于，包括如下依次进行的步骤 f、将已纯化的海胆多糖单克隆抗体置于Affi-gelHz偶联液中，调整pH至5. 5、温度为4°C，透析8-12小吋；之后加入高碘酸钠，常温密闭条件下混匀I h，再加入甘油混合10min,之后置于Affi-gel Hz偶联液中透析； g、室温下，将f步骤所得产物与Affi-GelHz hydrazide gel搅拌反应24 h,制成海胆多糖单克隆抗体-Gel悬浮液； h、将海胆多糖单克隆抗体-Gel悬浮液加入到300mmX28mmi·d.的纯化柱中，用PB和PBS缓冲液分别洗涤后，4°C贮藏备用；所述PB缓冲液的制备方法为取0.8 g NaH2PO4,4. 4g Na2HPO4* 7H20、29. 2 g NaCl，加800 ml水溶解，调节pH至7. 0，加水定容到1000ml即得；所述PBS 缓冲液的制备方法为:取8.0 g NaCUO. 2 g KH2PO4、O. 2 g KC1、2.9 g Na2HPO4* 12H20加蒸馏水至900 mL，调节pH至7. 4，加入O. 02%的叠氮化钠定容到IOOOml即得； i、将海胆多糖粗品溶于上样缓冲液中，过柱，洗涤液洗涤除去杂质，4°C静置2h，再用洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥，获得海胆多糖纯品；所述上样缓冲液的制备方法为:取0.2 g NaH2PO4U. I g Na2HPO4.7H20、2. 92 g NaCl，加 800 ml 水溶解，并加入 50 ml 甲醇，调节PH至7. 0，加水定容到IOOOml即得；所述洗涤液的制备方法为取O. 2 g NaH2PO4,LI g Na2HP04*7H20、2. 92 g NaCl，加 800 ml 水溶解，调节 pH 至 7. 0，加水定容到 1000ml 即得；所述洗脱液的制备方法为取 O. 8 g NaH2PO4,4. 4 g Na2HP04.7H20、29· 2 g NaCl 加 500ml水溶解，并加入300 ml甲醇，调节pH至7. 0，加水定容到IOOOml即得； j、洗脱完成后，免疫亲和层析柱再用PBS缓冲液洗涤，4°C保存再利用。
3.按照权利要求2所述的纯化方法制得的海胆多糖的鉴定方法，其特征在于，包括如下依次进行的步骤 k、采用还原胺法，以海胆多糖与牛血清白蛋白或者人血清白蛋白为原料合成海胆多糖人工抗原； I、将海胆多糖人工抗原与待测样品分别点于硝酸纤维素膜上，37°C静置2 h ； m、将膜浸入10%的小牛血清溶液中，在37°C条件下封闭2 h，采用PBS-T以10 min/次的速度洗膜2次；所述PBS-T的制备方法为取8. O g NaCl、O. 2 g KH2P04、0. 2 g KC1、2. 9 gNa2HP04.12H20，加入 O. 5 mL Tween-20，加水定容到 1000 ml 即得； η、将膜浸入海胆多糖单克隆抗体溶液中孵育2 h，采用PBS-T洗膜I h ; O、将膜浸入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG ニ抗溶液中孵育I h，PBS-T洗膜30min ； P、对膜进行ECL显影。
全文摘要
本发明属于海洋生物医药领域，特别涉及一种海胆多糖的提取、纯化及鉴定方法，本发明采用超微粉碎机将海胆进行预处理，采用超微粉碎与微波提取结合使用的方法提取粗多糖，以单克隆抗体技术为基础，采用免疫亲和层析法纯化多糖，采用斑点免疫印迹法鉴定海胆多糖。整套工艺成熟、稳定，适于工业化大生产，能够得到纯度高、生物活性好、质量稳定的海胆多糖产品。
文档编号G01N1/34GK102680272SQ20121017059
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月29日 优先权日2012年5月29日
发明者刘建伟, 刘永俊, 孙胜荣, 车晓青, 阮建 申请人:烟台渤海制药集团有限公司