专利名称：一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物疫病检测，具体涉及一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫试剂盒，同时还涉及一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫试剂盒的用途，适用于检测猪血清中的猪链球菌2型的荚膜多糖的抗体水平。
背景技术：
猪链球菌(streptococcus suis)是一种能引起人、猪和其他动物感染、发病的重要致病菌。根据荚膜多糖分型，猪链球菌有35个血清型，即1/2型和1-34型(后来研究认为32和34型属于Streptococcus orisratti)。其中猪链球菌2型(SS2)是毒力最强、流行最广的血清型。国外自1968年荷兰首次报道人感染脑膜炎病例以来已有200多人因感 染猪链球菌死亡。在我国，自七十年代以来该病在全国二十多个省市已发生或流行，造成了不同程度的经济损失。2005年6 8月间，四川省资阳市、内江市等地区暴发流行猪链球菌2型病，并导致204人感染，38人死亡。在其它省市也有零星发生。由此可见，该病在我国广泛存在并严重流行，已成为当前严重危害养猪业发展的一种主要疾病，不仅给养猪业造成巨大经济损失，而且给人类也造成了严重的危害。为了有效地预防和控制猪链球菌2型病，在加强免疫预防的同时，使用特异、敏感、快速、便于操作的诊断和检测方法，为有效预防和控制猪链球菌2型的发生提供有力的手段和重要的工具。本发明应用提取的猪链球菌2型的荚膜多糖及ELISA检测技术，使试剂盒具有很好的敏感性和特异性，能大通量的检测猪血清中的猪链球菌2型荚膜多糖的抗体。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫试剂盒，该试剂盒的优点是使用了猪链球菌2型的荚膜多糖作为抗原，使试剂盒的检测具有良好的灵敏性和特异性。本发明的另一个目的是在于提供了一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫试剂盒在检测猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫中的应用，将提取的猪链球菌2型荚膜多糖作为抗原包被于聚苯乙烯微孔板上，然后加待检血清孵育，再加入羊抗猪酶标抗体(购自Southern biotechnology associates (SBA)),显色时应出现两种情况,如果待检血清是阳性，那么此时加入的羊抗猪酶标抗体就会继续与阳性血清中的抗体反应，酶标仪检测数值就会越高。如果是待检血清阴性，那么羊抗猪酶标抗体就不会与ELISA板上猪链球菌2型荚膜多糖抗原反应，得到的数值就会低。该试剂盒特异性好、敏感性高。目前国内还无同类商业化的产品。有着良好的应用前景。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫的试剂盒，包括猪链球菌2型荚膜多糖包被的抗原酶标板。
所述的试剂盒还包括抗原酶标板、稀释液A、脱脂奶粉(市售伊利奶粉)、阳性对照、阴性对照、洗涤液、羊抗猪酶标二抗、显色液A、显色液B、终止液。所述的抗原酶标板是以猪链球菌2型荚膜多糖作为抗原，在包被聚苯乙烯微孔板时用O. lmol/L, pH9. 6的碳酸氢钠溶液作为包被缓冲液。所述的猪链球菌荚膜多糖是从猪链球菌2-LT株(CCTCC NO M2011282)中提取所得，所述的猪链球菌2-LT株已于2011年8月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，CCTCC NO :M2011282。(专利申请号:201110234192. 9)所述的阳性对照为猪链球菌2型菌免疫过的猪阳性对照血清，所述的阴性对照为未感染过和未免疫过猪链球菌的健康猪阴性血清。所述的洗涤液为含有O. 05% (体积比)Tween-20的PBS缓冲液；所述的终止液为含O. 25%体积比氢氟酸溶液。
所述的显色液A为含有50mg/mL过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液，显色液B液为含有O. 2mg/mL TMB pH5. O的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液。所述的稀释液A为含有O. 05%体积比Tween-20的PBS缓冲液。一种猪链球菌2型荚膜多糖的制备方法，其制备过程是溶菌酶处理与冷酚提取相结合。具体分为两步一、使用改良的溶菌酶处理法(林树乾等，金黄色葡萄球菌荚膜多糖的制备及生物学特性，家畜生态学报，第27卷第6期)，将灭活的猪链球菌2型菌液使用灭菌生理盐水洗三遍，再用原菌液1/10体积的O. 01mol/L PBS将其重悬，加入终浓度O. lmol/L的甘氨酸，并加入终浓度3mg/L溶菌酶(购自北京普博欣生物科技有限公司)，置37°C下过夜(8 10小时)，室温14000r/min离心45分钟，收集上清，再加入终浓度为25%的无水乙醇和终浓度为O. lg/L的CaCl2，置2 8°C下作用2小时，12000r/min离心10分钟，收集上清，然后加入终浓度为80%的无水乙醇，置2 8°C下作用12小时，12000r/min离心10分钟，得到的沉淀即为粗制荚膜多糖。二、用冷酚处理法(林树乾等，金黄色葡萄球菌荚膜多糖的制备及生物学特性，家畜生态学报，第27卷第6期)，将粗制多糖进行纯化。将得到的粗制多糖用IOml饱和醋酸钠重悬，加入预冷的苯酚，快速振摇30分钟，8°C 4000r/min离心，收集上清液，重复三次，再将所得的的上清液装入透析袋用lmol/L的NaCl溶液透析48小时，收集透析内液，然后加入终浓度为55%的无水乙醇，置2 8°C下作用24小时，12000r/min离心10分钟，取沉淀干燥后用IOmlPBS溶解，即为精制荚膜多糖。一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫的试剂盒在检测猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫中的应用，其步骤是I)将脱脂奶粉溶于稀释液A中，使其脱脂奶粉的终浓度为5%，作为待检血清和对照血清的稀释液。2)取抗原包被板(包被有猪链球菌2型荚膜多糖抗原的检测板)，先用稀释好的洗涤液洗板2次，再将稀释好的待检血清、阴性对照血清和阳性对照血清各取100 μ I加入到抗原包被板孔中。待检血清设I孔，阴性对照和阳性对照各设2孔。轻轻振匀孔中样品(勿溢出)，置37°C下温育30分钟。3)弃去孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200 μ 1，静置3分钟后，弃去洗涤液，并在吸水纸上拍干，重复洗板5次，最后一次在吸水纸上拍干。4)每孔加羊抗猪酶标二抗100 μ 1，置37°C下温育30分钟后洗板5次(方法同步骤3)。5)每孔加显色液A、显色液B各一滴(约50 μ L)，混匀，室温(18 25°C，以下相同)避光显色10分钟。每孔加终止液一滴(约50 μ L)，10分钟内用酶标仪测定每孔0D630nm读值。本发明试剂盒判定标准为在酶标仪上测各孔0D630nm值，试验成立的条件是；阳性对照孔0D630nm值均应彡O. 8，且< 2. O ;阴性对照孔0D630nm值均应< O. 3。如果样品0D630nm值彡O. 35，判为阳性；如果样品00630_值< O. 35，则判为阴性。本发明具有以下优点和效果 I.目前国内还无同类商业化的产品2.由于猪链球菌2型荚膜多糖的使用，特异性好，灵敏度高。3.操作简单，检测时间短，一般2个小时内即可出结果；
图I为一种用苯酚硫酸法测定荚膜多糖时绘制的标准曲线示意图。图中横坐标为糖浓度，纵坐标为OD值。图2为一种使用分光光度计对荚膜多糖进行质量检测示意图。图中横坐标为波长，纵坐标为吸光值。
具体实施例方式为了使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的实施例。结合实施对本发明做进一步的描述和论证。但是本实施例不是对本发明的限制。实施例I :抗原的制备I抗原的提取I. I细菌培养采用TSA固体培养基传代增菌，第3代菌种以一定的接种量接种于优化的TSB优化液体培养基中，37°C下培养12 14小时，标准细菌比浊管测菌浓度至I. 5 X 109/ml时终止培养，加入千分之五的甲醛，搅拌灭活。I. 2荚膜多糖的提取纯化I. 2. I荚膜多糖的提取使用改良的溶菌酶处理法，将灭活的猪链球菌2型菌使用灭菌生理盐水洗三遍，再用原菌液1/10体积的O. Olmol/LPBS将其重悬，加入终浓度O. lmol/L的甘氨酸，并加入终浓度3mg/L溶菌酶，置37°C下过夜(8 10小时)，室温14000r/min离心45分钟，收集上清，再加入终浓度为25%的无水乙醇和终浓度为O. lg/L的CaC12，置2 8°C下作用2小时，12000r/min离心10分钟，收集上清，然后加入终浓度为80%的无水乙醇，置2 8°C下作用12小时，12000r/min离心10分钟，得到的沉淀即为粗制荚膜多糖。I. 2. 2荚膜多糖的纯化用冷酚处理法，将粗制多糖进行纯化。将得到的粗制多糖用IOml饱和醋酸钠重悬，加入预冷的苯酚，快速振摇30分钟，8°C 4000r/min离心，收集上清液，重复三次，再将所得的的上清液装入透析袋用lmol/L的NaCl溶液透析48小时，收集透析内液，然后加入终浓度为55%的无水乙醇，置2 8°C下作用24小时，12000r/min离心10分钟，取沉淀干燥后用IOmlPBS溶解，即为精制荚膜多糖。2.抗原的测定2. I采用苯酚-硫酸法测荚膜多糖浓度，精密称取105°C干燥至恒重的葡萄糖lg，加入水溶解并定容至IOOml容量瓶中，即得到葡萄糖贮备液，精密吸取贮备液0，2，4，6，8，10，12，14，16ml分别置IOOml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即为葡萄糖应用液，分别吸取上述应用液Iml于试管中，加入8%苯酹溶液Iml,混勻后迅速加入浓硫酸5ml,摇勻，40°C 50°C水浴30min，以I号管为对照管在490nm处测定，绘制出标准回归方程。2. 2利用分光光度计对提取并纯化的荚膜多糖抗原进行全波长扫描，以测定抗原 里多糖的含量和纯度。3.结果3. I用EXcel2003统计软件分析处理，根据结果得回归方程，并要求相关系数R2 彡 O. 985。y=0. 4163x+0. 0024(R2=0. 9987)(见图 I)。3. 2荚膜多糖抗原质量检测结果见图2所示，图谱中260和280nm处没有蛋白质和核酸的吸收峰，200nm左右吸收值很高(荚膜多糖样品稀释100倍)，这是多糖的特征吸收波峰，证明获得的CPS抗原中杂蛋白质和残留的核酸含量比较低，荚膜多糖抗原纯度较高。实施例2 :抗原包被板的制备将荚膜多糖抗原用pH9. 6的碳酸盐缓冲液稀释为I. 25 μ g/ml，按100 μ L/孔加于聚苯乙烯微孔板中，置2 8°C下包被过夜(14 18小时)，次日取出，弃去孔中的抗原包被液，每孔加入120 μ I封闭液(见附注I)封闭，置37°C下作用I小时，弃去孔中封闭液后，再每孔加入120 μ I保护剂(见附注1)37°C作用I小时，弃去孔中保护剂后，拍干，再置37°C干燥2小时，用锡箔封口膜将抗原包被板密封，置2 8°C下保存。实施例3 :对照血清的制备I.猪链球菌阳性对照血清的制备选用4周龄健康仔猪。将猪链球菌2型(LT-1株)菌液灭活后浓缩至30亿/ml，第一次加入等量完全弗氏佐剂乳化后作为免疫原；第二次和第三次加入等量不完全弗氏佐剂乳化后作为免疫原；第四次免疫不加佐剂，直接用浓缩的灭活菌液作为免疫原，颈部肌肉注射三次，第一次2ml，第二次4ml，第三次6ml，第四次静脉注射3ml，每次免疫间隔2周。第四次免疫后10日采血，用琼脂扩散试验检测抗体效价，达到1:16以上，从颈动脉采集血液，分离血清，在血清中加入O. 04%硫柳汞钠防腐，O. 22 μ m滤膜过滤除菌，无菌分装，每管lml，置-70°C下保存。2.猪链球菌阴性对照血清的制备选用4周龄健康仔猪，经猪链球菌2型琼脂扩散试验和猪链球菌2型PCR试验检测均为阴性。颈动脉采集血液,分离血清,在血清中加入O. 04% (体积比)硫柳汞钠防腐，O. 22 μ m滤膜过滤除菌。无菌分装，每管1ml，置-70°C下保存。实施例4 :试剂盒组装
一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫的试剂盒，包括猪链球菌2型荚膜多糖抗原包被板。所述的试剂盒还包括酶标板、稀释液A、脱脂奶粉、阳性对照、阴性对照、洗涤液、羊抗猪酶标二抗、显色液A、显色液B、终止液。所述的抗原包被板是以猪链球菌2型荚膜多糖作为抗原，在包被聚苯乙烯微孔板时用O. lmol/L, pH9. 6的碳酸氢钠溶液作为包被缓冲液。所述的猪链球菌荚膜多糖是从猪链球菌2-LT株(CCTCC NO M2011282)中提取所得，所述的猪链球菌2-LT株已于2011年8月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，CCTCC NO :M2011282。所述的阳性对照为猪链球菌2型菌免疫过的猪阳性对照血清，所述的阴性对照为未感染过猪链球菌的健康猪阴性血清。所述的洗涤液为含有O. 05%体积比Tween-20的PBS缓冲液；所述的终止液为含O. 25%体积比氢氟酸溶液。 所述的显色液A为含有50mg/mL过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液，显色液B液为含有O. 2mg/mL TMB pH5. O的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液。所述的稀释液A为含有O. 05%体积比Tween-20的PBS缓冲液。试剂盒的组装含(I)抗原包被板 2块(96孔/块)(2)阴性对照血清 I管(lml/管)(3)阳性对照血清 I管(lml/管)(4)羊抗猪酶标二抗I瓶(20ml/瓶)(5)脱脂奶粉I管(2. 5g/管)(6)稀释液 AI 瓶(50ml/瓶)(7)底物液 AI 瓶(IOml/ 瓶)(8)底物液 BI 瓶(IOml/ 瓶)(9)终止液I 瓶(IOml/ 瓶)(10) 20倍浓缩洗涤液I瓶(30ml/瓶)(11)血清稀释板 2块(12)说明书I份阳性、阴性对照的制备将筛选获得的猪链球菌阳性血清加入O. 04% (体积比)柳硫汞防腐，O. 22 μ m滤膜过滤除菌，。无菌分装，每管1ml，作为阳性对照；将筛选获得的猪标准阴性血清，加入O. 04% (体积比)柳硫汞防腐，O. 22 μ m滤膜过滤除菌，。无菌分装，每管1ml，作为阴性对照。实施例5 :试剂盒的应用一种荚膜多糖抗体的酶联免疫的试剂盒在检测猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫中的应用，其步骤是I)将脱脂奶粉溶于稀释液A中，使其脱脂奶粉的终浓度为5%，作为待检血清和对照血清的稀释液。2)取抗原包被板(包被有猪链球菌2型荚膜多糖抗原的检测板)，先用稀释好的洗涤液洗板2次，再将稀释好的待检血清、阴性对照血清和阳性对照血清各取100 μ I加入到抗原包被板孔中。待检血清设I孔，阴性对照和阳性对照各设2孔。轻轻振匀孔中样品(勿溢出)，置37°C下温育30分钟。3)弃去孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200 μ 1，静置3分钟后，弃去洗涤液，并在吸水纸上拍干，重复洗板5次，最后一次在吸水纸上拍干。4)每孔加羊抗猪酶标二抗100 μ 1，置37°C下温育30分钟后洗板5次(方法同步骤3)。5)每孔加显色液A、显色液B各一滴(约50 μ L)，混匀，室温(18 25°C，以下相同)避光显色10分钟。每孔加终止液一滴(约50 μ L)，10分钟内用酶标仪测定每孔0D630nm读值。应用中所使用效果实验的情况如下 I特异性试验将我国猪主要病毒病(PRV、PPV、HCV、PRRSV、FMDV)阳性血清用猪链球菌2型荚膜多糖抗体检测试剂盒检测，检测结果全部为阴性(表I)。表I我国猪主要病毒病抗血清的检测结果
权利要求
1.一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫试剂盒，包括猪链球菌2型荚膜多糖包被的抗原酶标板，其特征在于所述的试剂盒还包括抗原酶标板、稀释液A、脱脂奶粉、阳性对照、阴性对照、洗涤液、羊抗猪酶标二抗、显色液A、显色液B、终止液； 所述的抗原酶标板是以猪链球菌2型荚膜多糖作为抗原，在包被聚苯乙烯微孔板时用0.lmol/L, pH9. 6的碳酸氢钠溶液作为包被缓冲液； 所述的阳性对照为猪链球菌2型菌免疫过的猪阳性对照血清； 所述的阴性对照为未感染过和未免疫过猪链球菌的健康猪阴性血清； 所述的洗涤液为含有0. 05%体积比Tween-20的PBS缓冲液； 所述的终止液为含0. 25%体积比氢氟酸溶液； 所述的显色液A为含有50mg/mL过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液，显色液B液为含有0. 2mg/mL TMB pH5. 0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液； 所述的稀释液A为含有0. 05%体积比Tween-20的PBS缓冲液。
2.根据权利要求I所述的一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的猪链球菌2型荚膜多糖的制备方法，其步骤是 A、使用改良的溶菌酶处理法，将灭活的猪链球菌2型菌使用灭菌生理盐水洗三遍，再用原菌液1/10体积的0. 01mol/L PBS将其重悬，加入终浓度0. lmol/L的甘氨酸，并加入终浓度3mg/L溶菌酶，置37°C下过夜8 10小时，室温14000r/min离心45分钟，收集上清，再加入终浓度为25%的无水乙醇和终浓度为0. lg/L的CaCl2，置2 8°C下作用2小时，12000r/min离心10分钟,收集上清,然后加入终浓度为80%的无水乙醇,置2 8°C下作用12小时，12000r/min离心10分钟，得到的沉淀即为粗制荚膜多糖； B、用冷酚处理法，将粗制多糖进行纯化，将得到的粗制多糖用IOml饱和醋酸钠重悬，加入预冷的苯酚，振摇30分钟，8°C 4000r/min离心，收集上清液，重复三次，再将所得的的上清液装入透析袋用lmol/L的NaCl溶液透析48小时，收集透析内液，然后加入终浓度为55%的无水乙醇,置2 8°C下作用24小时，12000r/min离心10分钟,取沉淀干燥后用IOmlPBS溶解，为荚膜多糖。
3.权利要求I所述的一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫的试剂盒在检测猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫试剂盒及应用，所述的试剂盒还包括抗原酶标板、稀释液A、脱脂奶粉、阳性对照、阴性对照、洗涤液、羊抗猪酶标二抗、显色液A、显色液B、终止液；抗原酶标板是以猪链球菌2型荚膜多糖作为抗原；阳性对照为猪链球菌2型菌免疫过的猪阳性对照血清；洗涤液含有Tween-20的PBS缓冲液；终止液含有氢氟酸溶液；显色液A含有过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液，显色液B液含TMBpH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液；稀释液A含有Tween-20的PBS缓冲液。试剂盒在检测猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫中的应用。猪链球菌2型荚膜多糖的使用，特异性好，灵敏度高。检测时间短，一般2个小时内即可出结果。
文档编号G01N33/545GK102759619SQ201210245250
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月16日 优先权日2012年7月16日
发明者康超, 徐高原, 肖圣建, 董晓晖, 郭学波, 金梅林 申请人:华中农业大学, 武汉科前动物生物制品有限责任公司