专利名称：一种tmem16a钙激活氯离子通道激活剂的筛选方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种TMEM16A钙激活氯离子通道激活剂的筛选方法。
背景技术：
I丐激活氯离子通道(Calcium-activated Chloride Channels, CaCCs)由于被细胞内部钙离子所激活而得名，最早发现于非洲爪蟾卵母细胞中，随后相继有报道表明上皮细胞、血管内皮细胞、神经元、平滑肌与心肌细胞中都存在。钙离子介导的信号转导途径是真核生物信号转导的重要组成部分，因此CaCCs执行多种功能，包括卵细胞的受精、跨上皮离
子/液体转运、心肌细胞复极化和动作电位发生、嗅觉传导及平滑肌伸缩的调节等。由于技术的原因，CaCCs的分子基础问题一直未能解决，导致相关药理学研究进程极为缓慢。直到2008年底，有三个研究小组独立报道CaCCs的分子基础是跨膜蛋白16A(transmembrane 16A,简称 TMEM16A)(Schroeder BC 等，Cell, 2008，134:1019-1029;CaputoA 等，Science, 2008，322:590-594; Yang YD 等，Nature, 2008，455:1210-1215)。这一发现为在特定细胞和组织中研究CaCCs的生理学和药理学等方面的问题提供了新的研究平台。最近发现TMEM16A通道与多种重大疾病密切相关。文献报道，TMEM16A离子通道可能是肺囊性纤维化(CF)疾病的药物靶点，激活TMEM16A通道可起到补偿上皮组织上氯离子通道囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(cystic fibrosis transmembrane conductanceregulator，简称CFTR)基因突变所致的离子/液体转运不平衡(Rock JR等，J. Biol.Chem.，2009，284:14875-14880)。 另外，2012 年，Wang 等(Wang M 等，Circulation,2012，125:697-707)证明TMEM16A是脑血管平滑肌细胞CaCCs的分子基础，并且发现TMEM16A离子通道的活性与血压呈负相关。另一方面，CaCCs的抑制剂被报道可用于治疗哮喘、胃肠动力学障碍疾病和某些类型的肿瘤等。由此可见，筛选TMEM16A离子通道特异性调节剂可为CaCCs相关疾病的治疗提供新的药物靶点。美国生命科学技术公司Invitrogen 的试剂盒Premo 卤化物传感器运用黄色突光蛋白(Yellow Fluorescence Protein, YFP)的三突变体蛋白质YFP-F46L/H148Q/I152L的荧光作为指标，筛选CaCCs/TMEM16A离子通道的调节剂。运用此方法，2010年，Namkung等(Namkung W 等，The FASEBJ.，2010, 24:4178-4186)应用 Premo 卤化物传感器试剂盒筛选得到单宁酸(tannic acid)及相关的没食子单宁(gallotannin)为TMEM16A/CaCCs的抑制剂。遗憾的是，目前缺乏简便易行的TMEM16A钙激活氯离子通道激活剂作为以上筛选实验的阳性对照物，来为研究TMEM16A/CaCCs在高血压、CF病、哮喘、胃肠动力学障碍疾病和某些类型的肿瘤等疾病中的应用提供基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种TMEM16A钙激活氯离子通道激活剂的筛选方法，通过该筛选方法筛选出简便易行的TMEM16A钙激活氯离子通道激活剂作为TMEM16A钙激活氯离子通道筛选实验的阳性对照物，来为研究TMEM16A/CaCCs在高血压、CF病、哮喘、胃肠动力学障碍疾病和某些类型的肿瘤等疾病中的应用提供基础。本发明提供了一种TMEM16A钙激活氯离子通道激活剂的筛选方法，包括如下步骤(a)将TMEM16A质粒稳定转染入哺乳动物细胞HEK293细胞；(b)将黄色荧光蛋白YFP三突变体YFP-F46L/H148Q/I152L导入步骤(a)中的稳定转染TMEM16A钙激活氯离子通道的HEK293细胞；(C)将候选药物与步骤(b)所述的导入后的细胞进行孵育，再加入含有碘离子的溶液观察，其中若荧光强度减弱，表明所述候选药物可能为TMEM16A钙激活氯离子通道的激活剂，并采用步骤(d)进行进一步验证；
(d)使用电生理学方法测定所述候选药物对步骤(a)中电流的影响，其中若加入所述候选药物后电流比对照增大，则确定该候选药物是TMEM16A钙激活氯离子通道的激活齐U，若电流比对照没有增大，则确定该候选药物不是TMEM16A钙激活氯离子通道的激活剂。进一步优选，所述的步骤(b)中，YFP三突变体YFP-F46L/H148Q/I152L由杆状病毒载体导入细胞。进一步优选，步骤(C)中所述的电生理学测定方法为膜片钳技术。进一步优选，步骤(d)中所述的荧光强度由激光显微镜检测，其中激发光波长为470-540nm，检测波长为 540_590nm。进一步优选，所述候选药物为壳寡糖或其他TMEM16A钙激活氯离子通道激活剂。采用本发明所述的筛选方法能够简便易行地筛选出的TMEM16A钙激活氯离子通道激活剂，作为TMEM16A钙激活氯离子通道筛选实验的阳性对照物，来筛选对TMEM16A钙激活氯离子通道有激活作用的药物分子，可开发成为治疗TMEM16A/CaCCs在高血压、CF病、哮喘、胃肠动力学障碍疾病和某些类型的肿瘤等疾病的药物。
图I :根据本发明所述内面向外模式下转染有TMEM16A钙激活氯离子通道的HEK293细胞在不同浓度壳寡糖作用下电流增大的趋势图。图2 :根据本发明所述内面向外模式下未经TMEM16A钙激活氯离子通道转染的HEK293细胞在不同浓度游离钙离子及壳寡糖的作用下电流无明显变化的趋势图。图3 :根据本发明所述不同浓度壳寡糖作用下转染有TMEM16A钙激活氯离子通道的HEK293细胞以及未转染外源基因的HEK293细胞的电流-电压曲线图。图4 :根据本发明所述TMEM16A离子通道激活剂壳寡糖对黄色荧光蛋白的荧光强度的增强作用趋势图。
具体实施例方式本发明提供了一种TMEM16A钙激活氯离子通道激活剂的筛选方法，包括如下步骤(a)将TMEM16A质粒稳定转染入哺乳动物细胞HEK293细胞；
(b)将黄色荧光蛋白YFP三突变体YFP-F46L/H148Q/I152L导入步骤(a)中的稳定转染TMEM16A钙激活氯离子通道的HEK293细胞；(C)将候选药物与步骤(b)所述的导入后的细胞进行孵育，再加入含有碘离子的溶液观察，其中若荧光强度减弱，表明所述候选药物可能为TMEM16A钙激活氯离子通道的激活剂，并采用步骤(d)进行进一步验证；(d)使用电生理学方法测定所述候选药物对步骤(a)中电流的影响，其中若加入所述候选药物后电流比对照增大，则确定该候选药物是TMEM16A钙激活氯离子通道的激活齐U，若电流比对照没有增大，则确定该候选药物不是TMEM16A钙激活氯离子通道的激活剂。可用于本发明筛选方法的细胞没有特别限制，代表性的例子包括哺乳动物细胞，如HEK293细胞，CHO细胞或脊椎动物非洲爪蟾(Xenopus Iaevis)卵母细胞。可用于本发明筛选方法的电生理学测定方法没有特别限制。代表性的例子包括 膜片钳法(用于哺乳动物细胞)、或双电极电压钳法(用于非洲爪蟾卵母细胞)。可用于本发明筛选方法的荧光强度检测技术没有特别限制。代表性的例子包括激光共聚焦显微镜(用于荧光实时成像)、或多功能酶标仪(用于荧光强度实时记录)等。黄色荧光蛋白(YFP)是一种来源于绿色荧光蛋白(GFP)的荧光蛋白，可在波长515nm下被激发发出黄色荧光。碘离子可以与YFP结合使荧光淬灭，而突变其两个位点H148Q和I152L可以使YFP对碘离子的敏感性增强。CaCCs通道不仅是一种氯通道，其对包括碘离子在内的大部分阴离子都有通透作用。本药物筛选试验用病毒感染的方法将外源的YFP基因导入HEK293细胞中，使YFP在胞内大量表达；再将备选药物与细胞孵育使其与通道充分作用；最后观察加入含有碘离子的溶液以后YFP荧光的淬灭程度。用此方法可以使YFP明显淬灭的药物可以被认为是CaCCs通道的激活剂，可以进一步对膜片钳实验结果进行印证。壳寡糖(chitosan oligosaccharide, COS)是由几丁质失水形成的线性均一多糖。COS是天然存在的碱性氨基寡糖，具有水溶性好、安全无毒、易被动物体吸收等优点，因此其生物学活性备受关注，包括抗菌(Choi BK等，International Journalof Antimicrobial Agents, 2001:18 :553 - 557),抗病毒(Bacon A 等，Infection andImmunity, 2000, 68 :5764 - 5770),抗肿瘤(Xiong C等，Carbohydrate Research, 2009, 344 1975 - 1983)，降低血液中胆固醇(Se-Kwon K, Carbohydr. Polym. ,2005,62 :357 - 368)、免疫调节(Okamoto Y 等,Macromol. Biosci. 2003, 3:587-590),并且对哮喘(Chung MJ 等，Int. ImmunopharmacoI. ,2012,12 : 43-459)、糖尿病(Lee HW 等,Biol. Pharm. Bull. , 2003，26:1100-1103)等治疗作用，但其作用位点与药理学特性尚不不清楚。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook 等，分子克隆实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例I :一、先通过荧光实验方法进行激活剂的粗筛，具体步骤如下第一天将表达质粒PEGFP-N1-TMEM16A转染入哺乳动物细胞HEK293中，在共聚焦专用皿中培养稳定转染YFP的HEK293细胞；第二天将转染YFP并培养过夜的HEK293细胞用D-PBS冲洗3次，最后留下800 μ I D-PBS ;加入壳寡糖或其他激活剂孵育lOmin，记录荧光强度为基线荧光强度；用激光共聚焦显微镜实时记录荧光强度，此时加入含有150mMI的溶液800 μ 1，使I浓度达到75mM，记录YFP荧光强度的变化。实验结果如图4所示，先加入壳寡糖时YFP的荧光强度很高(图4a)，在加入I以后，YFP荧光明显淬灭，2min以后荧光几乎完全消失(图4b);在另一组只加入含有碘离子的溶液而不加壳寡糖的对照组中，YFP的荧光强度始终没有变化，表明壳寡糖可能是TMEM16A通道的激活剂。二、使用电生理学测定方法进行激活剂的确定，具体步骤如下将表达质粒pEGFP-Nl-TMEM16A转入哺乳动物细胞HEK293中。在细胞转染后24-72h之内，进行电生理学检测(利用膜片钳技术)。具体方法如下HEK293细胞用含有10%胎牛血清的DMEM (高糖)培养液传代培养(加入100UI/ml的青霉素和100 μ g/ml链霉素)。稳定转染过程用Lipofectamine2000 (Invitrogen公司)脂质体进行。细胞于37°C , 5%C02
饱和湿度培养箱中培养至对数生长期用于实验。电生理检测在室温下进行(约22°C)，采用内面向外(Inside-0ut)记录模式(EPC-1OAmplifier, HEKA公司，德国)，内液和基础外液的成分为(单位mM):NaC1140，MgCl2 ·6Η20, HEPES10, EGTA5,用 NaOH 调至 ρΗ7· 4。加入药物的外液中壳寡糖的浓度设为1，10, 50, 100,500μ g/ml,用500nM游离钙离子测试TMEM16A通道表达与否，用IOmM EGTA无钙溶液做阴性对照，最后加200 μ M单宁酸与500 μ g/ml壳寡糖的混合溶液抑制钙通道，并与I μ M游离钙条件下的电流作比较。通过电压去极化激活膜电流(膜去极化电压从_80mV至+80mV，步阶为20mV，维持电压为OmV)。结果如图I所示，激活电流随着浴液中壳寡糖的浓度增加而增大。其电流-电压曲线如图3 (a)所示。高浓度(500 μ g/ml)的壳寡糖对TMEM16A通道的激活程度与高浓度游离钙离子(I μ M或10 μ M)相当，说明壳寡糖对转染有ΤΜΕΜ16Α质粒的ΗΕΚ293细胞有明显的激活作用。为检验壳寡糖对ΤΜΕΜ16Α通道是否存在特异性激活作用，使用完全相同的条件对未转染ΤΜΕΜ16Α质粒的ΗΕΚ293细胞进行电生理实验，结果如图2所示，0、500ηΜ自由钙对ΗΕΚ293细胞膜片没有产生激活电流，各浓度的壳寡糖对ΗΕΚ293细胞膜片也没有明显激活作用。其电流-电压曲线如图3 (b)所示，显示壳寡糖对ΤΜΕΜ16Α通道有特异性激活作用，确定壳寡糖是TMEM16A通道特异性的激活剂。
权利要求
1.ー种TMEM16A钙激活氯离子通道激活剂的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤 (a)将TMEM16A质粒稳定转染入哺乳动物细胞HEK293细胞； (b)将黄色荧光蛋白YFP三突变体YFP-F46L/H148Q/I152L导入步骤(a)中的稳定转染TMEM16A钙激活氯离子通道的HEK293细胞； (c)将候选药物与步骤(b)所述的导入后的细胞进行孵育，再加入含有碘离子的溶液观察，其中若荧光强度减弱，表明所述候选药物可能为TMEM16A钙激活氯离子通道的激活剂，并采用步骤(d)进行进一步验证； (d)使用电生理学方法測定所述候选药物对步骤(a)中电流的影响，其中若加入所述候选药物后电流比对照増大，则表明所述候选药物确定为TMEM16A钙激活氯离子通道的激活剂，若电流比对照没有増大，则确定该候选药物不是TMEM16A钙激活氯离子通道的激活剂。
2.根据权利要求I所述的筛选方法，其特征在于，所述的步骤(b)中，YFP三突变体YFP-F46L/H148Q/I152L由杆状病毒载体导入细胞。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤(c)中所述的荧光強度由激光显微镜检测，其中激发光波长为470-540nm，检测波长为540_590nm。
4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤(d)中所述的电生理学測定方法为膜片钳技木。
5.根据权利要求1-4任一所述的筛选方法，其特征在于，所述候选药物为壳寡糖及其他TMEM16A钙激活氯离子通道激活剂。
全文摘要
本发明涉及一种TMEM16A钙激活氯离子通道激活剂的筛选方法,通过该筛选方法筛选出简便易行的TMEM16A钙激活氯离子通道激活剂壳寡糖作为TMEM16A钙激活氯离子通道筛选实验的阳性对照物，壳寡糖可以筛选其他可作为TMEM16A钙激活氯离子通道激活剂的药物，为研究TMEM16A/CaCCs激活剂在治疗高血压、CF病、哮喘、胃肠动力学障碍疾病和某些类型的肿瘤等疾病中的应用提供基础。
文档编号G01N27/60GK102854236SQ20121024528
公开日2013年1月2日 申请日期2012年7月16日 优先权日2012年7月16日
发明者展永, 陈娅斐, 郭鹏, 安海龙, 耿金鹏, 王晖, 袁宏博, 赵小明, 杜昱光 申请人:河北工业大学