专利名称：检测调钙素水平的elisa试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及医学检测试剂，特别是一种检测肝损伤患者血清中调钙素水平的ELISA试剂盒及方法。
背景技术：
肝炎是严重威胁我国广大人民群众健康的最主要传染病之一。肝炎是各种原因损伤肝脏的共同后果，尤以各种病毒性感染、药物性损伤、酒精性损伤等因素多见。在我国，肝脏炎症又以HBV感染所致炎症为主。HBV和HCV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌，是重要的疾病死亡原因之一。目前，临床上广泛应用的肝脏炎症血清学指标主要是谷丙转氨酶(ALT)和谷草转 氨酶(AST)。然而，在长期的临床实践中，医生发现血清转氨酶水平与肝脏炎症程度常常不一致，具有很大的局限性。临床医生常需要对患者进行肝活检病理组织学检查，来确定肝脏炎症的真实情况。肝活检是确诊肝脏炎性损伤性质和程度的金标准，但其为创伤性检查，价格昂贵，患者不愿接受，并且由于难以重复进行，不适合作为诊断和疗效判断的常规手段。因此，临床上迫切需要其他更灵敏准确的血清学指标来进行辅助诊断，弥补转氨酶的不足。1978年，Yamaguchi等人发现在肝脏组织中存在一种钙离子结合蛋白，通过调节细胞内的Ca2+信号传导物来调节肝细胞的功能，命名为调钙素(regucalcin)。1992年，Fujita等人用二维电泳的方法检测大鼠肝可溶性蛋白与年龄的关系时发现了一种新的蛋白，其表达可以独立减少衰老细胞中雄激素的合成，其分子量在30KD左右，故命名为衰老标志蛋白 30(Senescence Marker Protein-30, SMP30)。1993 年，Shimokawa N和 Yamaguchi报道了一种编码蛋白质的cDNA，证实调钙素与SMP30为同一种蛋白。在生理情况下，调钙素mRNA主要在肝脏细胞和肾皮质细胞中大量表达，在心脏、脑、骨骼和一些其他组织细胞中也有少量表达。在肝脏，调钙素大量存在于肝细胞胞浆，占肝脏可溶性蛋白总量的2%。调钙素可以在多种组织细胞的胞浆和胞核发挥重要生理作用。除了调节细胞内钙稳态，还具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酶、蛋白丝氨酸和(或)苏氨酸磷酸酶的作用，从而影响蛋白质磷酸化、去磷酸化这一重要的修饰过程。此外，调钙素还具有抑制细胞增殖的作用。2010年，Chakraborti首次测定了调钙素的晶体结构，证实人类调钙素蛋白的一级晶体结构上只有一个金属离子结合位点，可以结合二价离子包括Zn2+、Ca2+、Mn2+或Mg2+，该晶体结构本身更倾向于结合Zn2+，增强酶活性；在外界作用条件下，调钙素蛋白可能会结合更多Ca2+从而促进钙聚集。调钙素基因及其蛋白质表达异常参与了多种疾病的发病过程，如高血压病、肾脏病等。由于调钙素能够释放入血，其血清学水平可能在一定程度上反映肝组织的损伤。但具体如何反映尚不清楚，血清中调钙素水平的变化与肝组织学表达的关系还需要进一步研究。临床上广泛应用的肝脏炎症血清学指标主要是谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)，它们也是判断疗效的主要指标。此外，对于HBV感染者，ALT和AST同时也是最常用的抗病毒治疗的指征。然而，在长期的临床实践中，医生发现血清转氨酶水平与肝脏炎症程度常常不一致。在转氨酶正常的慢性无症状HBV感染者中，肝组织完全正常的仅占极少数，大约90%左右的感染者有不同程度的肝组织炎症及纤维化。在重型肝炎患者中，常常出现“酶胆分离”现象，即总胆红素越来越高，而ALT和AST则趋于下降，因此转氨酶更不能准确反映重型肝炎肝损伤的程度。综上所述，ALT和AST作为目前主要的肝脏炎症指标，其意义具有很大的局限性。基于这一点共识，临床医生常常需要对患者进行肝活检病理组织学检查，来确定肝脏炎症的真实情况。肝活检是确诊肝脏炎性损伤性质和程度的金标准，但其为创伤性检查，价格昂贵，患者不愿接受，并且由于难以重复进行，不适合作为诊断和疗效判断的常规手段。因此，临床上迫切需要其他更灵敏准确的血清学指标来进行辅助诊断，弥补转氨酶的不足。调钙素在反应肝细胞损伤方面具有一定的临床意义，但是由于国内外尚没有检测血清调钙素的试剂盒，极大地限制了对其临床意义的研究。目前有关该标志物与肝细胞损伤之间的关系仍然缺乏系统的对照研究，其表达水平与肝脏组织学的炎症程度相关性研究也极少，对重型肝炎的一项研究仅进行了 4例血清学WB检测。显然，评价调钙素的临床意 义急需标准规范的试剂盒。为此，我们初步设计此实验试图寻找到一种ELISA检测方法，并通过此法检测血清中调钙素水平，探索调钙素对于肝损伤的临床意义，以及调钙素与肝损伤其他各血清学指标之间的相关性，以期能够更好地帮助我们明确肝脏炎症损伤的程度，从而对肝病患者的炎症损伤作出明确诊断。
发明内容
本发明基于上述领域的需求，提供一种用于检测血清中调钙素水平的方法及试剂盒，该方法及试剂盒检测调钙素灵敏且特异，为本领域研究人员对调钙素与肝损伤之间关系的研究提供了便利的工具和方法。分泌抗调钙素蛋白18号单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞DC091，保藏号为CGMCCNo. 6509。抗调钙素蛋白的18号单克隆抗体，其特征在于由小鼠杂交瘤细胞DC091分泌。一种检测调钙素水平的ELISA试剂盒，包括酶标板，其特征在于所述酶标板微孔内包被有含上述18号单克隆抗体的包被液。包被液中所述18号单克隆抗体的浓度为5ug/ml。所述ELISA试剂盒还包括封闭液、酶标二抗、底物显色液、终止液。一种检测调钙素水平的ELISA方法，其特征在于，酶联免疫反应中的第一抗体为上述18号单克隆抗体。所述ELISA方法中，酶标二抗的工作稀释倍数为I :20000。所述第一抗体制备成为包被液包被于酶标板的微孔中，所述包被液中18号单克隆抗体的浓度为5ug/ml。本发明中，发明人获得了分泌抗抗调钙素蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。基于该单克隆抗体以及双夹心酶联免疫反应原理，发明人进一步提供了一种检测肝损伤患者血清的调钙素水平的方法和试剂盒。试验数据表明，该单克隆抗体用于检测调钙素，灵敏度可达到Pg / ml的水平，与其它蛋白无交叉反应，可用于特异性检测调钙素。
本发明基于同样的原理和获得的单克隆抗体，还提供了检测调钙素水平的试剂盒，试剂盒的主要组成组件为酶标板，酶标板上包被有本发明获得的18号单克隆抗体。生物保藏信息保藏号CGMCCNo. 6509 生物材料名称小鼠杂交瘤细胞DC091保藏日期2012年9月6日保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号
图I.不同调钙素浓度与OD值相关性。纵坐标为OD值，横坐标为调钙素浓度，单位pg/ml。
具体实施例方式下面通过具体试验数据说明本发明的技术方案。实施例I调钙素抗体的制备和验证I. I单克隆抗体的制备小鼠杂交瘤细胞DC091是经过选择性培养、筛选以及鉴定后的能够分泌特异性抗体对抗天然调钙素蛋白的杂交瘤细胞株。选用小鼠腹腔接种法，即将杂交瘤细胞接种至小鼠腹腔，在杂交瘤细胞生长的同时渗出大量腹水，腹水中便含有抗体。具体操作过程如下选取BALb-C小鼠进行腹腔注射石蜡油诱导，O. 5ml/只；10_14天后，将杂交瘤细胞培养至5X IO5 IO6个细胞/毫升，在小鼠腹腔进行杂交瘤接种，O. 5ml/只；10-14天后小鼠腹腔有腹水渗出，根据鼠的健康状况可一次杀鼠取腹水，或间隔数日抽取腹水几次。采水量的多少及采水时间应根据鼠的大小及健康状况决定。将抽取的腹水离心去除沉淀，留取上清，所得上清液中含有大量单克隆抗体。I. 2多克隆抗体的制备调钙素蛋白本所按照《分子克隆实验指南(第三版)》中公开的原核蛋白表达方法制备而得。将调钙素蛋白(北京市肝病研究所)经过弗氏抗原佐剂乳化后注入新西兰大耳白兔进行免疫，从而获得多抗。具体操作如下将调钙素蛋白(北京市肝病研究所)经过弗氏抗原佐剂乳化后注入新西兰大耳白兔，Img/只，4周后再次注射，并在注射后的7-10天收集血液，将血液转移至塑料离心管中，4° C离心，收集上清液即为抗血清，获得兔抗人多克隆抗体。通过ELISA方法检测抗体效价。I. 3调I丐素单克隆抗体和多克隆抗体的Western Blot验证本发明通过对肝组织或者肝癌细胞系提取蛋白后，再用本发明的抗体与市售抗体(Rabbit-anti-Rat Regucalcin antibody,产自 Cosmo Bio 公司)分别作为一抗进行Western Blot 实验。
观察结果是否能够分别检测出同一蛋白来进行验证；同时制备肝组织石蜡切片进行免疫组织化学染色，以及利用肝癌细胞HepG2细胞制作细胞爬片进行免疫细胞化学染色来进一步对单抗及多抗进行验证。结果显示通过选取2份肝组织标本 (I份组织标本为重型肝炎患者肝组织，另I份为肝硬化患者肝组织)及人肝癌细胞系HepG2细胞系提取的蛋白进行Westernblot实验,证实自制单抗及多抗与市售多抗均在34KD附近检测到阳性条带。采用免疫细胞化学染色检测调钙素蛋白在人肝癌细胞系HepG2细胞中的表达，结果表明，调钙素在肝细胞胞浆和胞核内均有表达，特别是处于分裂期的细胞核，表达量最闻。实施例2血清调钙素双抗体夹心ELISA检测方法的建立2. I自制调钙素单克隆抗体、多克隆抗体和酶标二抗的ELISA鉴定2. I. I测定调钙素蛋白浓度将存置-20°C冰箱的调钙素蛋白取出并待其融解，混匀，用PBS稀释液进行稀释，取比色杯分别编号标记0，I (O为对照，I为所测蛋白)，编号O杯加入PBS稀释液3ml，编号I杯加入所测蛋白O. 5ml及2. 5ml PBS稀释液，分光光度仪调至波长280nm处进行检测，测得0D,计算浓度公式浓度=0. 625 X ODX稀释倍数,单位mg/ml。按照前述实验方法,用分光光度仪，在波长280nm条件下检测，分别将调钙素蛋白、单克隆抗体及多克隆抗体稀释50倍、6倍及6倍，通过公式计算得出调钙素蛋白浓度为2. 0625mg/ml ;18号单克隆抗体(为杂交瘤细胞DC091所分泌)浓度为26mg/ml ;多克隆抗体的浓度为15. 446mg/ml。2. I. 296孔板包被调钙素(I)包被用调钙素蛋白包被酶标板，包被浓度为I μ g/ml, 100 μ I/孔，4°C过夜或37 °C 2小时后，洗涤液洗板3次。(2)封闭加150 μ I/孔或加满/孔封闭液，4°C过夜或37°C 2小时后，洗涤液洗板3次，拍干。置4°C冰箱保存备用。2. I. 3单抗的ELISA鉴定及效价测定(I)加待测样品倍比稀释后的单抗，100μ I/孔，加样到抗原包被好的酶标板中，同时，37°C孵育lh，洗板6次，拍干。(2)加二抗加入稀释的羊抗兔HRP酶标二抗(购自鼎国昌盛生物技术有限责任公司)，其原液浓度为I. Omg/ml, 100 μ I/孔，37°C孵育30min，洗涤液洗板6次，拍干。(3)显色加入底物显色液A、B液(购自鼎国昌盛生物技术有限责任公司)各80μ I/孔，37°C显色15分钟。(4)终止加入终止液(购自鼎国昌盛生物技术有限责任公司)80 μ I/孔，用酶标仪450nm波长测定OD值。(5)读数以450nm单波长测定各孔OD值。以与阴性对照孔OD值的比值(P/N)大于2. I为限作为阳性或确定效价的临界点。调钙素的18号单克隆抗体的ELISA效价可达为I :409. 6万，结果如表I所示表IELISA方法测定18号单抗效价
权利要求
1.分泌抗调钙素蛋白18号单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞DC091，保藏号为CGMCCNo. 6509。
2.抗调钙素蛋白的18号单克隆抗体，其特征在于由权利要求I所述杂交瘤细胞分泌。
3.含有权利要求2所述的18号单克隆抗体的溶液。
4.一种检测调钙素水平的ELISA试剂盒，包括酶标板，其特征在于所述酶标板微孔内包被有权利要求2所述的18号单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的ELISA试剂盒，其特征在于包被的所述18号单克隆抗体溶于包被液中，浓度为5ug/ml。
6.根据权利要求4 5任一所述的ELISA试剂盒，其特征在于还包括封闭液、酶标二抗、底物显色液、终止液。
7.一种检测调钙素水平的ELISA方法，其特征在于酶联免疫反应中的第一抗体为权利要求2所述的18号单克隆抗体。
8.根据权利要求7所述的ELISA方法，其特征在于羊抗兔HRP酶标二抗的工作稀释倍数为I : 20000。
9.根据权利要求7所述的ELISA方法，其特征在于所述第一抗体制备成为包被液包被于酶标板的微孔中，所述包被液中所述18号单克隆抗体的浓度为5ug/ml。
全文摘要
本发明“检测调钙素水平的ELISA试剂盒及方法”，涉及医学检测试剂。特别涉及抗调钙素蛋白的单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞CGMCC No.6509。基于该单克隆抗体与酶联免疫反应原理建立起来的检测调钙素水平的ELISA试剂盒及方法。利用本发明的试剂盒可以检测血清中调钙素水平，探索调钙素对于肝损伤的临床意义，以及调钙素与肝损伤其他各血清学指标之间的相关性，以期能够更好地帮助我们明确肝脏炎症损伤的程度，从而对肝病患者的炎症损伤作出明确诊断。
文档编号G01N33/68GK102901829SQ201210339650
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月13日 优先权日2012年9月13日
发明者张晶, 李莉, 谢立, 赵鹏, 韦新焕 申请人:首都医科大学附属北京佑安医院