专利名称：一种脂微球/脂质乳剂微观结构的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种脂微球/脂质乳剂微观结构的测定方法，具体涉及一种采用负离子发生装置处理待测样品及其扫描电镜中的载样金属网，来测定具有软质外壳结构的脂微球/脂质乳剂的微观形态的方法。
背景技术：
扫描电子显微镜是1965年发明的较现代的细胞生物学研究工具，主要是利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态，即用极狭窄的电子束去扫描样品，通过电子束与 样品的相互作用产生各种效应，其中主要是样品的二次电子发射。二次电子能够产生样品表面放大的形貌像，这个像是在样品被扫描时按时序建立起来的，即使用逐点成像的方法获得放大像。扫描电镜是一种用途广泛的多功能仪器，具有很多优越的性能，它可以进行三维形貌的观摩和分析，在观察形貌的同时进行微区的成分分析。其应用主要表现在两个方面材料形貌观察分析和成分分析。扫描电子显微镜由三大部分组成真空系统，电子束系统以及成像系统。扫描电镜观察样品要求在高真空中进行，无论是水或脱水溶液，在高真空中都会产生剧烈地汽化，不仅影响真空度、污染样品，还会破坏样品的微细结构。因此，样品在用电镜观察之前必须进行干燥。脂微球/脂质乳剂是将药物溶于脂肪油中经磷脂乳化分散于水相后制成的脂质乳剂，是一种以脂肪油为软基质并被磷脂膜包封的微粒体分散系，其平均粒径200nm，称为脂微球。脂微球/脂质乳剂作为药物载体，靶向聚集于病变部位实现了药物的“靶向治疗”。通过扫描电镜(TEM)，可以观察脂微球/脂质乳剂的微观结构，扫描电镜主要通过高能电子束穿过非常薄的固体样品表面，通过电子束能量的变化来扫描出样品表面的微观结构。使用TEM进行试验时，为了防止空气中离子及水对于电子束的干扰，因此需要在真空室中进行扫描，这样就必需使用完全干燥的固体样品，而脂微球/脂质乳剂中微粒的形态比较不稳定，干燥后如果浓度过大，则会发生脂微球变形或聚合的作用，这样就无法观测到脂微球的真实结构。而如果使用浓度较低的脂微球/脂质乳剂溶液样品，因为脂微球是由磷脂包裹油脂构成的，因此表面为磷脂的亲水基团，主要为胆碱(-N (CH4)3)或氨基(-NH2),这些基团在水溶液中溶解后带有正电荷，会吸附电子束的高能电子，因此在电镜图谱中为黑色球体，白色背景，这与大家对于电镜图谱的普遍认知不同。为了解决这个问题，需要使用染色剂对样品进行染色。染色剂主要是带有正电荷的基团，在水溶液中电离后与微球表面的磷脂负电荷基团结合，使干燥后的样品带有正电荷，这样就会出现黑色的背景及白色的球体。但是由于TEM试验使用的聚合物或者金属制细网作为样品载体，聚合物或者金属均带有正电荷，对于样品微粒带有一定的电排斥而样品溶液本身的浓度又比较稀，因此试验的成功率非常低，重现性很差，经常多个样品中均无法观察到任何脂微球。本发明人通过潜心研究发现，通过采用在天平称量中使用避免造成天平称量漂移现象的负离子发生装置可以解决目前现有技术中采用扫描电镜测定脂微球/脂质乳剂微观结构中存在的缺陷，采用电解空气产生臭氧离子的原理产生负离子气流，从而中和样品或容器中的正电荷。同时采用负离子发生装置对样品金属制或聚酯制的载样容器进行处理后再利用扫描电镜进行观察，可以稳定的获得清晰的脂微球/脂质乳剂微观结构的TEM谱图
发明内容
本发明的目的是提供一种通过对检测样品和载样容器用负离子发生装置处理后，采用扫描电镜测定具有软质结构的脂微球/脂质乳剂微观结构的方法。该方法克服了现有技术中对脂微球/脂质乳剂微观结构中存在的成功率低、重现性差、对样品破坏严重、样品用量大、不能真实反映样品微观结构的缺陷。本发明提供的脂微球/脂质乳剂微观结构的测定方法包括将待测样品用稀释液稀释成一定的浓度，干燥后用染色剂染色，采用负离子发生装置处理染色后的样品和扫描电镜的载样容器后通过扫描电镜测定。其中，待测样品的稀释液为水。其中，样品的稀释浓度为500 5000倍。其中，染色剂为磷钥酸或磷钨酸或醋酸铀。其中，负离子发生装置为日本岛津公司Stablo除电器或德国梅特勒公司ANTIST-KIT-UN去静电装置或德国赛多利斯公司YSTPOl去静电笔。其中，样品的干燥方式为真空减压干燥或红外灯干燥或自然风干。
图I为比较例I的电镜照片。图2为比较例2的电镜照片。图3为比较例3的电镜照片。图4为比较例4的电镜照片。图5为实施例I的电竞照片。图6为实施例2的电镜照片。图7为实施例3的电镜照片。
具体实施例方式以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明的范围仅限于以下实施例。凡基于本发明的内容所实现的技术均属于本发明的范围。显然，根据本发明的内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明的基本技术思想的前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。比较例I
样品未经过复染法处理的前列地尔脂微球制剂电镜照片，稀释倍数约500倍，结果如图I所示。由图I可知在未经负染处理的情况下，样品中的微球呈黑色，且聚合在一起，视野中可以观察到的微球数量也比较少。比较例2样品复染法处理后较小稀释倍数下前列地尔脂微球制剂电镜照片，稀释倍数约500倍，结果如图2所不。由图2可以观察到脂微球的聚合现象比较明显，无法辨认其微观结构。比较例3
样品复染法处理后较大稀释倍数下前列地尔脂微球制剂电镜照片，稀释倍数约1000倍，结果如图3所不。由图3可以观察到脂微球聚合较少，但有部分变形，与载网的结合较差，重复测定后，重现性差。
比较例4
样品复染法处理后较大稀释倍数通过负离子发生装置得到的前列地尔脂微球制剂电镜照片，稀释倍数约2500倍，结果如图4所示。由图4可以观察到脂微球聚合较少，形变较小，并可以观察到部分微观结构，重复测定后，图片一致，重现性好。实施例I
样品前列地尔注射液(商品名凯时)，负染剂磷钥酸，稀释倍数约2500倍，负离子发生装置为日本岛津公司Stablo除电器，干燥方式为真空减压干燥，测试结果如图5所示。实施例2
样品氟比洛芬酯注射液(商品名凯纷)，负染剂磷钨酸，稀释倍数约1000倍，负离子发生装置为德国梅特勒公司ANTIST-KIT-UN去静电装置，干燥方式为真空减压干燥，测试结果如图6所不。实施例3
样品脂肪乳注射液(商品名英脱利匹特)，负染剂醋酸铀，稀释倍数约4000倍，负离子发生装置为YSTPOl去静电笔，干燥方式为红外灯干燥，测试结果如图7所示。由图5、6、7可知，在采用本发明方法测定的3份市售样品中，脂微球/脂质乳剂的微粒圆整、清晰、分离性好，微观形态清楚、不聚合粘连，多次测定的重复性好。
权利要求
1.一种脂微球/脂质乳剂微观结构的测定方法，其特征在于将待测样品用稀释液稀释成一定的浓度，干燥后用染色剂染色，采用负离子发生装置处理染色后的样品和扫描电镜的载样容器后通过扫描电镜测定。
2.根据权利要求I所述的脂微球/脂质乳剂微观结构的测定方法，其特征在于待测样品的稀释液为水。
3.根据权利要求I所述的脂微球/脂质乳剂微观结构的测定方法，其特征在于样品的稀释浓度为500-5000倍。
4.根据权利要求I所述的脂微球/脂质乳剂微观结构的测定方法，其特征在于染色剂为磷钥酸，磷钨酸，醋酸铀。
5.根据权利要求I所述的脂微球/脂质乳剂微观结构的测定方法，其特征在于负离子发生装置为日本岛津公司Stablo除电器或德国梅特勒公司ANTIST-KIT-UN去静电装置或德国赛多利斯公司YSTPOl去静电笔。
6.根据权利要求I所述的脂微球/脂质乳剂微观结构的测定方法，其特征在于样品的干燥方式为真空减压干燥或红外灯干燥或自然风干。
全文摘要
一种采用扫描电镜测定具有软质外壳结构的脂微球/脂质乳剂微观形态的方法，包括将待测样品稀释分散、用负离子装置进行处理，使待测样品或承载待测样品的载样容器带正电荷，通过电子束能量的变化来扫描出样品表面的微观结构，从而获得重现性好、稳定、清晰的脂微球/脂质乳剂微观结构的扫描电镜(TEM)谱图的测定方法。
文档编号G01N23/22GK102944569SQ20121051970
公开日2013年2月27日 申请日期2012年12月7日 优先权日2012年12月7日
发明者程栎, 王伟, 肖萱, 刘玉静, 张伟强, 杨青松 申请人:北京泰德制药股份有限公司