专利名称：一种乙型肝炎病毒核心抗体IgM检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种试剂盒，属于乙型肝炎病毒核心抗体IgM化学发光免疫分析技术领域。
背景技术：
乙型肝炎核心抗体也叫抗-HBc，英文缩写是HBcAb。包括乙型肝炎核心抗体IgM和乙型肝炎核心抗体IgG，常用竞争法检测。HBV感染后，在多数人血清中能检出此抗体，是一种敏感的血清学标志，也是乙型肝炎急性感染的早期标志，在血清中存在的时间很长，有些人滴度很高。在HBsAg和抗-HBs阴性时，能从血清中检出乙肝核心抗体，高滴度的乙肝核心抗体也是一种传染标志。抗-HBc可分为三型抗-HBcIgM、抗-HBcIgA、抗-HBcIgG，在HBV感染中这几个型依次出现，也会依次消失，只有IgG这一型可长期存在。在化验室报告的化验单中，如果只标明“抗-HBc”，没有分型，那么它应当是这三型的总和，不过大部分医院化验室报告的都分为IgM和IgG 二型。抗-HDc IgM型，叫做“乙型肝炎核心抗体IgM型”，常常提示为急性HBV感染，或者在慢性乙肝急性发作、慢性乙肝进入活动期，随着病程的延长或者病情的好转，IgM逐步消失，而由IgG取代。乙型肝炎病毒核心抗体IgM用于科学研究过程中，对于微量检测要求较高。目前乙型肝炎病毒核心抗体IgM测定方法有胶体金免疫层析(GICA);蛋白印迹(WB);酶联免疫吸附试验(ELISA)，化学发光法免疫分析(CLIA);其中GICA、ELISA、WB的优点是相对成本低廉，缺点是灵敏度低，乙型肝炎病毒核心抗体IgM含量少的情况下检测不出；而化学发光法CLIA试剂盒检测灵敏度比上述方法试剂盒高，但还是不能满足科研上对乙型肝炎病毒核心抗体IgM超微量检测的需要。
实用新型内容本实用新型克服了当前化学发光法试剂盒不能满足对乙型肝炎病毒核心抗体IgM超微量检测的技术问题，提供了一种乙型肝炎病毒核心抗体IgM检测试剂盒，解决目前乙型肝炎病毒核心抗体IgM蛋白超微量检测的问题。本实用新型采用了以下技术方案来解决技术问题一种乙型肝炎病毒核心抗体IgM检测试剂盒，包括盒体和盒盖，盒体(I)上方连接盒盖(2)，盒体(I)的底部放置有2cm厚与盒的尺寸大小相同的海绵托(3)，所述海绵托(3)的左半部设有11个第一凹槽、中间区域设有4个第二凹槽、右半部设有2个第三凹槽，第一凹槽内分别装有11个对照品瓶(5)，第二凹槽内分别装有磁性颗粒瓶(6)、生物素化合物瓶、标记物瓶(8)和浓缩样本稀释液瓶(9)，第三凹槽分别装有化学发光底物瓶(10)和浓缩洗涤液瓶(11)。作为本实用新型进一步改进，所述的盒体(I)、盒盖(2)均采用塑化防水纸质材料制成。作为本实用新型进一步改进，第一凹槽的截面形状与所述对照品瓶(5)的截面形状匹配。作为本实用新型进一步改进，4个第二凹槽的截面形状分别与磁性颗粒瓶(6)、生物素化合物瓶(7)、标记物瓶(8)以及浓缩样本稀释液瓶(9)的截面形状匹配。作为本实用新型进一步改进，2个第三凹槽的截面形状分别与化学发光底物瓶
(10)和浓缩洗涤液瓶(11)的截面形状匹配。作为本实用新型进一步改进，所述的对照品瓶(5)，磁性颗粒瓶(6)，生物素化合物瓶(7)，标记物瓶(8)，浓缩样本稀释液瓶(9)，化学发光底物瓶(10)和浓缩洗涤液瓶
(11)均采用玻璃瓶。与现有技术相比，本实用新型的有益效果是发光信号明显提高，对超微量的乙型肝炎病毒核心抗体IgM检测效果明显优于现有化学发光免疫分析试剂盒，本实用新型试剂盒具有灵敏度高，稳定的特点。
图1是本实用新型整体结构示意图。图中1盒体；2盒盖；3海绵托；4第三凹槽；5对照品瓶；6磁性颗粒瓶；7生物素化合物瓶；8标记物瓶；9浓缩样本稀释液瓶；10化学发光底物瓶；11浓缩洗涤液瓶。
具体实施方式
如图1所示，为本实用新型乙型肝炎病毒核心抗体IgM检测试剂盒的一种实施例。该乙型肝炎病毒核心抗体IgM检测试剂盒包括盒体I和盒盖2，盒体1、盒盖2均采用塑化防水纸质材料制成。盒体上方连接盒盖，盒体的底部放置有2cm厚与盒的尺寸大小相同的海绵托3。所述海绵托3的左半部设有11个第一凹槽、中间区域设有4个第二凹槽、右半部设有2个第
三凹槽4。第一凹槽内分别装有11个对照品瓶5，并且第一凹槽的截面形状与所述对照品瓶5的截面形状匹配。第二凹槽内分别装有磁性颗粒瓶6、生物素化合物瓶7、标记物瓶8和浓缩样本稀释液瓶9，并且4个第二凹槽的截面形状分别与磁性颗粒瓶6、生物素化合物瓶7、标记物瓶8以及浓缩样本稀释液瓶9的截面形状匹配。第三凹槽4分别装有化学发光底物瓶10和浓缩洗涤液瓶11，并且2个第三凹槽的截面形状分别与化学发光底物瓶10和浓缩洗涤液瓶11的截面形状匹配。在本实施例中，对照品瓶5，磁性颗粒瓶6，生物素化合物瓶7，标记物瓶8，浓缩样本稀释液瓶9，化学发光底物瓶10和浓缩洗涤液瓶11均采用玻璃瓶。制备本实用新型乙型肝炎病毒核心抗体IgM检测试剂盒一、对照品瓶的制备用对照品基质液及乙型肝炎病毒核心抗体IgM纯品配制对照品，浓度分别为O、0. 01,0. 02,0. 05,0. 1,0. 2,0. 5、1、2、5、10ng/mL,(其中 Ong/mL 为对照品基质液，不含乙型肝炎病毒核心抗体IgM)，配制11种系列浓度对照品，各浓度对照品分别用3mL规格的西林玻璃瓶分装ImL/瓶，冻干处理后，_20°C保存，得到本实用新型对照品瓶5。[0025]二、磁性颗粒瓶的制备(I)称取250mg氨基末端磁性颗粒置于烧杯；(2)加入甲醇及丙酮各5mL反复清洗5遍；(3)磁性分离，弃去上清；(4)加入DMF溶解的IOmLO. 2%的1，4 一苯二异硫氰酸酯(PDITC)溶液，置于恒温振荡器，反应10h ；(5)将反应后的磁性颗粒用丙酮及超纯水反复清洗6遍；(6)取新制备经PDITC活化的磁性颗粒置于30mL离心管中；(7)加入PBS 25mL,加入4mg链亲和素，置于恒温振荡器中反应20min ；(8)磁性分离，测定反应前后溶液在280nm的OD值，以PBS清洗3次，收集，加入等量丙三醇，-20°C保存 通过实验检测效价，在根据最近效价稀释比例配制链亲和素化固相磁性颗粒工作液。用5mL规格西林玻璃瓶分装ImL/瓶，冻干处理后，_20°C保存，得到本实用新型磁性颗粒瓶6。三、生物素化合物瓶的制备(I)将生物素-N-羟基磺酸基琥珀酰亚胺酯(Sulf0-NHS-Biotin)冰箱取出平衡至
室温;(2) 0. OlM的PBS稀释抗U链抗体至浓度2mg/mL ；(3)称取Sulfo-NHS-Biotin 2mg于西林瓶中加超纯水300 U L，轻轻摇匀活化。(4)立即将活化的生物素溶液54 ii L缓慢加入2mL抗y链抗体溶液中，室温反应30min ；(5)反应液用0. OlM的PBS透析4°C 8h (换液4次)，收集，加入等量丙三醇，_20°C保存。通过实验检测效价，在根据最近效价稀释比例配制抗U链抗体生物素化工作液。用5mL规格西林玻璃瓶分装ImL/瓶，冻干处理后，_20°C保存，得到本实用新型生物素化合物瓶7。四、标记物瓶的制备(I)将1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)冰柜取出平衡至室温；(2)取IOmg 5，10，15-三(4-吡啶基)-20-对苯乙酸卟啉和20mgEDC分别溶于Iml超纯水中使其溶解；(3)将上述5，10，15-三(4-吡啶基)-20-对苯乙酸卟啉溶液和EDC溶液，在4°C混合搅拌反应30min ；(4)然后向此混合液中缓慢滴加入含30mg/mL乙型肝炎病毒核心重组抗原溶液，室温搅拌反应2h，层析纯化后，-20°C保存。通过实验检测效价，在根据最近效价稀释比例配制5，10，15_三(4-吡啶基)-20-对苯乙酸卟啉偶联标记乙型肝炎病毒核心重组抗原标记物工作液。用5mL规格西林玻璃瓶分装ImL/瓶，冻干处理后，_20°C保存，得到本实用新型标记物瓶8。五、浓缩样本稀释液瓶的制备NaH2PO4 *2H204g
Na2HPO4 *12^058g
牛血清白蛋白20g
Proclin 300ImL
双蒸水定容至IOOOmL用5mL规格西林玻璃瓶分装5mL/瓶，得到本实用新型浓缩样本稀释液瓶9。六、化学发光底物瓶的制备
NaH2PO4*2H200 . 2g
Na2HPO4* 12H202 . 9g
吖啶酯0.1g
KCl1.5g
双蒸水定容至IOOOmL用20mL规格西林玻璃瓶分装20mL/瓶，得到本实用新型化学发光底物瓶10。七、浓缩洗涤液瓶的制备
NaH2PO4^H2O6g
Na2HPCV 12H2087g
NaCl9g
Tween-200. 2mL
双蒸水定容至IOOOmL用30mL规格西林玻璃瓶分装30mL/瓶，得到本实用新型浓缩洗涤液瓶11。八、半成品及成品组成上述步骤所得产品即为半成品。将盒体，盒盖，海绵托，对照品瓶，磁性颗粒瓶，生物素化合物瓶，标记物瓶，浓缩样本稀释液瓶，化学发光底物瓶，浓缩洗涤液瓶组装成品“乙型肝炎病毒核心抗体IgM检测试剂盒”。本实用新型乙型肝炎病毒核心抗体IgM检测试剂盒的使用方法(I)从冰箱取出乙型肝炎病毒核心抗体IgM检测试剂盒平衡至室温；(2)将浓缩洗涤液瓶中得浓缩洗涤液稀释30倍配制洗涤工作液；(3)将浓缩样本稀释液瓶中浓缩液稀释20倍配制样本稀释液；(4)将11个对照品瓶(冻干状态)，每瓶加入ImL纯化水进行溶解；(5)向磁性颗粒瓶(冻干状态)中加入5mL纯化水进行溶解；(6)向生物素化合物瓶(冻干状态)中加入5mL纯化水进行溶解；(7)向标记物瓶(冻干状态)中加入5mL纯化水进行溶解；(8)用样本稀释液将对照品和待测样本按1: 10进行稀释；(9)在反应杯中分别加入对照品和待测样本稀释后液体，各50 ii L ;(10)在反应杯中依次加入磁性颗粒瓶复溶液各50 U L，生物素化合物瓶复溶液各50 u L ；[0070](11) 37°C温育 30 分钟；(12)磁场吸附,吸去上清液,用300 ii L洗漆缓冲液冲洗,再次磁场吸附，吸取上清
液，重复4遍；(13)在每个反应杯中依次加入标记物瓶复溶液各50 y L(14) 37°C温育 30 分钟；(15)磁场吸附，吸去上清液，用300 ii L洗涤缓冲液冲洗，再次磁场吸附，吸取上清
液，重复4遍；(16)在每个反应杯中依次加入化学发光底物瓶溶液200 ii L ;(17)在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)；(18)分别对对照品浓度和对应RLU值，在坐标图上建立四参数标准曲线，以对照品浓度为横坐标，RLU值为纵坐标绘出标准曲线，以待测样本的RLU值在标准曲线上查出该样本的浓度值。
权利要求1.一种乙型肝炎病毒核心抗体IgM检测试剂盒，包括盒体和盒盖，其特征在于盒体(I)上方连接盒盖(2)，盒体(I)的底部放置有2cm厚与盒的尺寸大小相同的海绵托(3)，所述海绵托(3)的左半部设有11个第一凹槽、中间区域设有4个第二凹槽、右半部设有2个第三凹槽，第一凹槽内分别装有11个对照品瓶(5)，第二凹槽内分别装有磁性颗粒瓶(6)、生物素化合物瓶(7)、标记物瓶(8)和浓缩样本稀释液瓶(9)，第三凹槽分别装有化学发光底物瓶(10)和浓缩洗涤液瓶(11)。
2.根据权利要求1所述的一种乙型肝炎病毒核心抗体IgM检测试剂盒，其特征在于所述的盒体(I)、盒盖(2)均采用塑化防水纸质材料制成。
3.根据权利要求1所述的一种乙型肝炎病毒核心抗体IgM检测试剂盒，其特征在于第一凹槽的截面形状与所述对照品瓶(5)的截面形状匹配。
4.根据权利要求1所述的一种乙型肝炎病毒核心抗体IgM检测试剂盒，其特征在于4个第二凹槽的截面形状分别与磁性颗粒瓶￠)、生物素化合物瓶(7)、标记物瓶(8)以及浓缩样本稀释液瓶(9)的截面形状匹配。
5.根据权利要求1所述的一种乙型肝炎病毒核心抗体IgM检测试剂盒，其特征在于2个第三凹槽的截面形状分别与化学发光底物瓶(10)和浓缩洗涤液瓶(11)的截面形状匹配。
6.根据权利要求1所述的一种乙型肝炎病毒核心抗体IgM检测试剂盒，其特征在于所述的对照品瓶(5)，磁性颗粒瓶(6)，生物素化合物瓶(7)，标记物瓶(8)，浓缩样本稀释液瓶(9)，化学发光底物瓶(10)和浓缩洗涤液瓶(11)均采用玻璃瓶。
专利摘要本实用新型公开了一种乙型肝炎病毒核心抗体IgM检测试剂盒，涉及化学发光免疫分析技术领域，解决目前乙型肝炎病毒核心抗体IgM超微量检测的技术问题。本实用新型乙型肝炎病毒核心抗体IgM检测试剂盒，包括盒体和盒盖，盒体上方连接盒盖，盒体的底部放置有2cm厚与盒的尺寸大小相同的海绵托，所述海绵托的左半部设有11个第一凹槽、中间区域设有4个第二凹槽、右半部设有2个第三凹槽，第一凹槽内分别装有11个对照品瓶，第二凹槽内分别装有磁性颗粒瓶、生物素化合物瓶和、记物瓶和浓缩样本稀释液瓶，第三凹槽分别装有化学发光底物瓶和浓缩洗涤液瓶。本实用新型试剂盒主要用途为乙型肝炎病毒核心抗体IgM超微量检测。
文档编号G01N33/576GK202870097SQ20122036604
公开日2013年4月10日 申请日期2012年7月27日 优先权日2012年7月27日
发明者李勇, 胡庆锋, 常立峻, 徐海伟, 陈秀发 申请人:苏州长光华医生物试剂有限公司