专利名称：一种龙血素b酶联免疫检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物分析检测领域，具体是龙血素B酶联免疫检测试剂盒。
背景技术：
龙血竭是传统药物傣药中的一味常用药材，在临床上主要用于活血化瘀、祛腐生肌、止血收敛、消肿止痛等，被誉为“活血圣药”。而龙血素B(化学名为4'-羟基-2，4，6-三甲氧基双氢查耳酮)又是龙血竭的主要活性成分之一，龙血竭国家标准(标准号:WS3-082(Z-016)-99(Z))中规定龙血竭中龙血素B含量不得少于0.40%。有研究表明龙血素B有抗炎止痛活性，并能延长血凝时间，其对大鼠背根神经节细胞上TTX-R和TTX-S钠通道电流有较强的抑制作用。由于龙血竭的药用效果好导致市场需求好，而药物质量却好坏不一，那么药物真假及纯度的鉴定就非常必要。传统的检测方法前处理过程复杂，检测时间长，检测费用高，仪器设备较贵等，本研究研制的试剂盒属于体外诊断试剂产品，为龙血竭提供了灵敏便捷的检测手段。本专利将建立龙血竭的重要成分龙血素B的酶联免疫检测试剂盒，这种方便快捷的新方法，为以龙血竭或龙血素B为原料的中药开发和剂型改进及质控研究提供参考。
实用新型内容本实用新型提供一种小巧轻便的龙血素B酶联免疫检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确，灵敏度高，成本低，稳定性好，一次可连续进行多个样品的测定，减少了检测样本所需的时间。本实用新型的技术方案是:一种龙血素B酶联免疫检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、7瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书,其特征在于:酶标板采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被龙血素B偶联抗原制成的检测板，7瓶试剂分别样品稀释液、底物液、终止液、浓缩洗涤液、龙血素B标准品、酶标记抗体溶液、龙血素B多克隆抗体溶液，下凹瓶位共7个。试剂盒包括酶标板，而酶标板上设置有微孔条，微孔条包括微孔、包被层和封闭层。酶标板由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有12个反应孔，放入自封袋中，盒体为硬纸盒，下凹瓶位由塑料泡沫制成，将7瓶试剂用不同颜色的塑料瓶盛装并固定在下凹瓶位中与酶标板、自封袋、说明书一同封装在硬纸盒内，以便于携带和运输。每一个试剂盒中的试剂足够进行96次测定(包括标准分析孔)，既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检测。将剩下的放回自封袋中密封，这样可以保证试剂盒检测结果的准确性。检测时，样本中的龙血素B将和酶标板微孔条上预包被的龙血素B偶联抗原竞争抗龙血素B抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与样本中所含龙血素B含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中龙血素B的含量，其操作简便易行。[0008]经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度:龙血素B样本的最低检测限为5ng/mL ；相对于其他龙血素B的检测方法，本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、离心机、恒温培养箱、涡旋仪和微量加样器等，同类实验室一般均有配备，所需成本较低。本实用新型的有益效果是:能快速、简便、灵敏、准确地用于龙血素B的检测。
图1是本实用新型俯视图；图2是本实用新型侧面纵剖图；图3是本实用新型的包被酶标板俯视图。图4是四参数Logistic方程拟合龙血素B标准曲线。附图标记说明:在图中:1为盒体；2为酶标板；3为塑料泡沫的下凹瓶位；4为样品稀释液；5为底物液；6为终止液；7为浓缩洗漆液；8为龙血素B标准品；9为酶标记抗体溶液；10为龙血素B多克隆抗体溶液；11为试剂瓶。
具体实施方式
一溶液I样品稀释液:含0.15M NaCl和0.005%吐温-20° C的0.1M的磷酸盐缓冲液，PH = 7.4。2底物液:购自郑州博威嘉生物科技有限公司。3终止液:2mol/L的硫酸溶液。4浓缩洗涤液:含0.05%吐温-20° C的0.02M的磷酸盐缓冲液，PH = 7.4。5龙血素B标准品:用样品稀释液稀释的龙血素B溶液。6酶标记抗体溶液:天津三箭生物技术有限公司生产的HRP标记羊抗小鼠IgG，用含0.1% OVA的0.1M的磷酸盐缓冲液(PH = 7.4)稀释4000倍。7龙血素B多克隆抗体溶液7.1化合物I的合成龙血素B9.7mg，溶于0.97mL 二甲亚砜，并加入适量的Κ0Η，使反应保持在碱性条件下进行。5min后加入34mg溴乙酸，在室温25。C条件下，TLC跟踪原料反应消失(乙酸乙酯:甲醇=6: 3)，用G5砂芯漏斗抽虑得到合成的半抗原，用乙醇洗脱，然后蒸干。7.2龙血素B-BSA免疫原的合成取3.2mg的化合物I溶于0.08mL的N，N.二甲基甲酰胺(DMF)，然后将1.8mg的N，N’.二环己基碳二亚胺(DCC)和Img的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)分别溶于0.03mL的DMF中，并并在搅拌条件下依次逐滴滴加到半抗原溶液中，于室温下密闭搅拌4h，4°C冰箱过夜。次日(> 12h)，离心(4000r/minl0min)取上清——活性酯液待用。称取BSA牛血清蛋白(半抗原与BSA偶联的投料比为40: 1)，溶于2mL0.05mol/L PH = 8.0PBS，取活性酯液，冰浴下逐滴滴加到BSA溶液中，室温反应2h，于4°C冰箱缓慢搅拌反应过夜。TLC跟踪观察反应。将反应液装入透析袋，于4°C下，PH7.4，0.01mol/L的PBS中透析3天，紫外扫描透析外液中无半抗原紫外吸收为止或紫外下观察显色。取出透析袋内溶液，分装，于_20°C保存备用。7.3龙血素B-OVA包被原的合成取2.40mg的化合物I溶于0.060mL的N，N.二甲基甲酰胺(DMF)，然后将1.32mg的N，N’.二环己基碳二亚胺(DCC)和0.739mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)分别溶于0.03mL的DMF中，并并在搅拌条件下依次逐滴滴加到半抗原溶液中，于室温下密闭搅拌4h，4° C冰箱过夜。次日(> 12h)，离心(3000r/min)取上清——活性酯液待用。称取鸡卵清白蛋白(OVA)(半抗原与OVA偶联的投料比为40: 1)，溶于2mL0.05mol/L PH = 8.0PBS。取活性酯液，冰浴下逐滴滴加到OVA溶液中，室温反应2h，于4°C冰箱缓慢搅拌反应过夜。TLC跟踪观察反应。将反应液装入透析袋，于4°C下，pH7.4，0.01mol/L的PBS中透析3天，紫外扫描透析外液中无半抗原紫外吸收为止或紫外下观察显色。取出透析袋内溶液，分装，于_20°C保存备用。此溶液为龙血素B偶联抗原即龙血素B-OVA包被原。7.4龙血素B的多克隆抗体(I)取6-7周龄的Balb/C和昆明小白鼠为实验动物。(2)实验免疫剂量基础免疫0.50mg每只，用无菌的生理盐水稀释实例I中得到的龙血素B-BSA免疫抗原，无菌过滤器过滤后加入等体积弗氏完全佐剂，充分乳化，直到滴入水中不扩散。(3)用乳化好的免疫抗原免疫小鼠，采取背部皮下多点注射，共注射0.lmL。(4)基础免疫后，采用不完全弗氏完全佐剂乳化免疫抗原，方法同(2)，每隔2周进行加强免疫，三免后开始，每次免疫后7天从小鼠的尾部采血测效价，待效价大于1: 10000后，采血，分离出抗血清，即得抗体。二包被酶标板制备将4μ g/mL的龙血素B包被原加入空白的酶标板100 μ L/孔，37°C避光环境中水浴2h，然后用洗涤液洗至少4遍，形成包被层；再加1%的酪蛋白120μ L/孔，4°C过夜(10 16h)后再洗涤至少4遍，放在37°C的环境下干燥，形成封闭层，后密封保存。三使用试剂盒的操作步骤1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置室温(20_25°C )平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。2、取出需要数量的微孔及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2 8°C。3、编号:将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。4、加标准品/样本:加标准品/样本50μ L/孔，加龙血素B多克隆抗体溶液50 μ L/孔，37°C避光环境中反应30min后洗涤，再加入酶标记抗体溶液100 μ L/孔，37°C避光环境中反应15min后洗浲。5、洗板注意:将孔内液体甩干，用洗涤液每孔250 μ L充分洗涤4_5次，每次间隔10秒，在吸水纸上拍干。6、显色:每孔加入显色液100 μ L，轻轻振荡混匀，室温中避光显色lOmin。7、测定:每孔加入终止液100 μ L，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据)，测定每孔OD值。8、结果判定:[0046](I)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的OD值除以第一个标准品(Ong/mL)的OD值，再乘以100%，即百分吸光率=Β/^ΧΙΟΟ^ ,Β:标准溶液或样本溶液的平均吸光度值，Bc^O μ g/L标准溶液的平均吸光度值。(2)标准曲线的绘制与计算，以标准品百分吸光率为纵坐标，以龙血素B标准品浓度(ng/mL)的为横坐标，龙血素 B 的浓度为:0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、160ng/mL。用四参数Logi s t ic方程拟合标准曲线。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中龙血素B含量。
权利要求1.一种龙血素B酶联免疫检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、7瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书，其特征在于:酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被龙血素B偶联抗原制成的检测板，7瓶试剂分别为样品稀释液、底物液、终止液、浓缩洗涤液、龙血素B标准品、酶标记抗体溶液、龙血素B多克隆抗体溶液，下凹瓶位共7个。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于包括酶标板，所述的酶标板上设置有微孔条，所述的微孔条包括微孔、包被层和封闭层。
专利摘要本实用新型提供一种龙血素B酶联免疫检测试剂盒，涉及免疫检测领域。其包含盒体、固定有龙血素B的酶标板、盒内支架、样品稀释液、底物液、终止液、浓缩洗涤液、龙血素B标准品、酶标记抗体溶液、龙血素B多克隆抗体溶液。酶标板反应孔内固定有龙血素B与载体蛋白分子偶联物。与仪器分析技术相比较，本实用新型具有操作简便，检测快速、准确，灵敏度高，成本低，稳定性好，一次可连续进行多个样品的测定。
文档编号G01N33/543GK203069590SQ20122055578
公开日2013年7月17日 申请日期2012年10月26日 优先权日2012年10月26日
发明者刘向明, 龙蓉, 沈洲, 陈素, 李羽欣, 雷丽云, 米雪 申请人:中南民族大学