专利名称：一种肿瘤标志物钙网蛋白检测试剂盒的制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程和临床诊断领域，涉及ー种肿瘤标志物钙网蛋白检测试剂盒的制备及应用。
背景技术：
钙网蛋白(Calreticulin，CRT)为46KD大小的具有多种生物学功能的内质网分子伴侶蛋白，除了分布在内质网，细胞核、核膜、细胞膜表面以及细胞外基质中均有表达，能发挥多种生化生理效应。在肿瘤发生时，分泌性的CRT在肝癌病人的血清以及膀胱癌患者的尿液中都有上升趋势，除此之外，对妇科肿瘤如乳腺癌、宫颈癌的研究也显示相比健康对照CRT的表达量有所増加；用免疫组化染色研究胃癌时发现CRT阳性的患者往往伴有远处淋巴结的转移、肿瘤微血管聚集以及五年存活率低下的症状。然而，由于肿瘤发生发展的机制至今尚未阐明，因此肿瘤的早期发现也变得越来越重要。在肿瘤的研究和临床实践中，早期发现、早期诊断、早期治疗是关键。肿瘤标志物(Tumor Marker, TM)在肿瘤普查、诊断、判断预后和转归、评价治疗疗效和高危人群随访观察等方面都具有较大的实用价值。随着单克隆抗体技术的不断成熟，出现了大量的抗肿瘤标志物的单克隆抗体，并与特异敏感的免疫学检测技术(RIA、IRMA、ELISA、CLIA、IFA、TRFIA等)相结合，发展了众多的肿瘤标志物检测项目并不断地应用于临床，已成为肿瘤患者的一个重要检查指标。基于以上研究结果，本发明将选择CRT作为肿瘤标志物进行方法学的建立及临床试验。本发明应用一对特异性的单抗和多抗建立高敏感性的ELISA试剂盒，用于临床肿瘤病人及健康对照血清CRT检测。我们发现，肿瘤病人血清中的CRT水平明显高于正常对照。因此，我们首次报道成功的建立了针对于肿瘤诊断的CRT检测的ELISA试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供一种诊断癌症或评价癌症风险的酶联免疫吸附试剂盒，所述试剂盒包含:钙网蛋白(CRT)的特异性抗体，所述特异性抗体为通过以钙网蛋白为免疫原得到的单克隆抗体和/或多克隆抗体。其中所述单克隆抗体为鼠源单克隆抗体，其制备方法如下:使用纯化的钙网蛋白作为免疫原对Balb/c小鼠进行免疫；经效价检测达标后，进行细胞融合；经筛选克隆获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，经杂交瘤细胞株分泌，得单克隆抗体。其中，优选使用纯化的小鼠重组钙网蛋白(即CRT抗原)作为免疫原，应用构建的重组质粒通过原核表达系统制备小鼠重组CRT蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)。优选的制备单抗的步骤为:免疫Balb/c小鼠前，先获得大约100 ill的血清-20°C保存，后以50 y g纯化的CRT抗原与弗氏完全佐剂混合制成乳剤，经皮内背部多点注射进行免疫。I个月后，用25 y g的抗原加弗氏不完全佐剂经皮内注射进行加强免疫共3次，毎次间隔2周。经效价检测达标后，将免疫获得的小鼠脾细胞与SP2/0骨髄瘤细胞进行细胞融合，饲养层细胞为小鼠腹腔巨噬细胞，融合试剂为50%的PEG4000，脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为5: 1，置于5% 0)2饱和湿度的37°C温箱中培育，第3、6、9、10日换入含HAT的完全1640培养液，用有限稀释法将克隆分别稀释于5块96孔板中，至杂交瘤细胞长成后吸取上清，用ELISA检测上清抗体效价，筛选出阳性杂交瘤细胞(即分泌单克隆抗体多，且细胞生长状态好的杂交瘤细胞)。再经筛选获得的杂交瘤细胞株分泌，纯化后得单克隆抗体。所述试剂盒中的多克隆抗体为兔源多克隆抗体；其制备方法如下:先取得5ml左右注射抗原前免疫新西兰大白兔血清，后以500 yg CRT抗原与弗氏完全佐剂混合制成乳齐U，经皮内背部多点注射进行免疫。I个月后，用250 yg的抗原加弗氏不完全佐剂经皮内注射进行加强免疫共3次，毎次间隔2周。測定效价后，颈动脉取血离心后收集血清经饱和硫酸铵沉淀法纯化后加等体积的甘油-20 V保存。所述试剂盒还包含:酶标抗体，包被有所述单克隆抗体的微孔板，HRP标记的羊抗兔酶标抗体，标准阳性对照钙网蛋白，标准阴性对照大肠杆菌BL-21菌体蛋白，封闭液，样品稀释液，洗涤液，终止液，底物显色液。封闭液由I % BSA液和I %山羊血清液组成，BSA液制备方法如下:氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢ニ钠1.44g，磷酸ニ氢钾0.27g，IOg BSA粉末溶于ddH20中，调pH为7.4，定容至1L，即为1%854，过滤分装保存于-20で。在封闭时加入山羊血清，使之浓度为封闭液的1%即可。样品稀释液为I XPBS，其制备方法为:氯化钠Sg，氯化钾0.2g，磷酸氢ニ钠1.44g，磷酸ニ氢钾0.27g，溶于ddH20中，调pH为7.4，定容至1L，过滤，4°C保存。洗涤液为含浓度为0.05% Tween-20的PBS，制备方法为:在ILl XPBS中加入Tween-20500 U 1，4で保存。终止液为2M的浓硫酸，将178.3ml的蒸馏水逐滴加入21.7ml的浓硫酸(98 % )即
可。 底物显色液包括A液和B液，其中A液的制备过程为:过氧化脲lg，磷酸氢ニ钠35.8g，柠檬酸10.2g，Tween-20100 iil，将前三者加ddH20避光溶解后加入Tween-20定容至1L，4°C避光保存；B液的制备过程为TMB0.7g，柠檬酸10.3g，DMS040ml，先用DMSO避光溶解前两者后加ddH20定容至1L，4°C避光保存；使用前等体积混合A液和B液，避光显色。通过方阵滴定法的測定，当CRT浓度为5ng/ml、OD值为1.0时的单克隆抗体包被浓度及多抗结合浓度、羊抗兔-辣根过氧化物酶ニ抗浓度为最佳浓度。分别为单克隆抗体800倍稀释，多克隆抗体4500倍稀释，羊抗兔-HRP ニ抗(即HRP标记的羊抗兔酶标抗体)3000倍稀释，阴性对照0.108。本发明所述的试剂盒，可用于检测癌症，优选为肺癌。本发明还提供一种钙网蛋白的ELISA检测方法，其步骤包括:I)用碳酸盐缓冲液(0.05M Na2C03/NaHC03,pH9.6))包被1: 800梯度稀释的通过上述制备方法制备获得的CRT单抗，每孔100 u 1，4°C包被16h，PBST洗涤液洗涤ELISA板I次；2)加入200 ill封闭液(1% BSA和1%山羊血清PBS) 37°C封闭lh，洗涤I次；3)加入 1001111%85六稀释的0^抗原(0.51^/1111，100111/孔)37で lh，由 PBST洗涤液洗涤3次；4)加入100 ill CRT多抗(4500 X )，37°C孵育Ih后用PBST洗涤液洗涤3次；
5)加入100 ill HRP标记的羊抗兔酶标抗体(3000 X ) 37°C孵育lh，用PBST洗涤液洗涤3次；6) 100 U I/孔底物显色液A+B液室温避光显色15min ；7)加入50 U I/孔的2mol/L H2SO4 (终止液)终止反应；8)在450nm波长酶标仪上测定吸光度值。
图1所示为pET28a(+)-CRT在BL21 (DE3)菌中的表达及CRT蛋白的纯化，其中:M为 Unstained Protein Molecular Weight Marker (SM0431) ;1 为诱导前 pET28a (+)-CRT 转化的BL21(DE3)菌，2为IPTG诱导后pET28a (+)-CRT转化的BL21 (DE3)菌，3为纯化的CRT蛋白。图2所示为ELISA法测定CRT抗体效价結果，A图所示为:制备的CRT单克隆抗体进行梯度稀释后，与包被的CRT结合，读取吸光度值(0D450) ；B图所示为:制备的CRT多克隆抗体进行梯度稀释后，与包被的CRT结合，读取吸光度值(0D450)。图3所示为Western blot鉴定单抗特异性；上图:应用单克隆抗体对真核细胞Cos-7和A549内源性的CRT进行测定；下图:将重组截短的CRT (rCRT)转染细胞，应用单克隆抗体进行測定CRT的表达。图4所示为Western blot鉴定多抗特异性的结果，其中:1，纯化的CRT蛋白；2，IPTG诱导的CRT蛋白表达；3，诱导前的对照。图5所示为建立的ELISA测定CRT的标准曲线。图6所示为测定临床血清样品中CRT蛋白含量的結果。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次或以上重复实验，结果取平均值。主要材料和试剂1、材料培养瓶、板，ELISA检测板(Costar，美国)；实验仪器:Gel Logic-200凝胶成像系统(美国Kodak公司)，Mini型垂直式蛋白质电泳系统、蛋白质转印系统(美国Bio-Rad公司)，TS100型倒置荧光显微镜(日本尼康公司)，多功能荧光酶标仪(瑞士 Tecan公司)，2MX-988B全自动洗板机(北京市天石医疗用品制作所)，CR21GII系列高速冷冻离心机(日本日立公司)。2、试剂构建的重组质粒pET_28a(+)-CRT为本课题组所有；应用构建的重组质粒通过原核表达系统制备小鼠CRT重组蛋白(其氣基酸序列如SEQ ID NO:1所不)(图1所不);通过本发明所述制备方法，免疫小鼠和免，分别制备了鼠源CRT单克隆抗体和兔源CRT多克隆抗体。
Streptavidin-HRP 和底物 TMB (Sigma, St Louis, MO，美国)；RPMI_1640 培养液(Invitrogen公司)；牛血清蛋白(BSA，北京华美公司)；10XPBS溶液(NaC180.0g，Na2HPO4H.2g,KH2P042.72g，KC12.0g加双蒸水溶解并定容到1000ml，使用时稀释至I X PBS，调pH为7.4);山羊血清(Gibco公司)；脱脂奶粉(内蒙古伊利实业集团股份有限公司)；PEG4000 (Amresco 公司)。试剂配制:封闭液为I % BSA液+1 %山羊血清液；制备方法:氯化钠Sg，氯化钾0.2g，磷酸氢ニ钠1.44g，磷酸ニ氢钾0.27g，IOg BSA粉末溶于ddH20中，调pH值为7.4，定容至1L，即为1% BSA，过滤分装保存于-20°C。在封闭时加入山羊血清，使之在封闭液的1%即可。样品稀释液为1XPBS，制备方法:氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢ニ钠1.44g，磷酸ニ氢钾0.27g，溶于ddH20中，调pH值为7.4，定容至1L，过滤，4°C保存。洗涤液(PBST)为含浓度为0.05%的Tween-20的PBS，制备方法为:在ILl XPBS中加入 Tween-20500 iil，4°C 保存。终止液为2M的浓硫酸，将178.3ml的蒸馏水逐滴加入21.7ml的浓硫酸(98 % )中。底物显色液包括A液和B液，其中A液的制备过程为:过氧化脲lg，磷酸氢ニ钠35.8g，柠檬酸10.2g，Tween-20100 u I，将前三者加ddH20避光溶解后加入Tween-20定容至1L，4°C避光保存；B液的制备过程为TMB0.7g，柠檬酸10.3g，DMS040ml，先用DMSO避光溶解前两者后加ddH20定容至1L，4°C避光保存；使用前等体积混合A液和B液，避光显色。实施例1、CRT单抗的制备与鉴定1、单抗的制备免疫Balb/c小鼠前，先获得大约100 ill的血清-20度保存，后以50 Ug纯化的CRT抗原与弗氏完全佐剂混合制成乳剤，经皮内背部多点注射进行免疫。I个月后，用25y g的抗原加弗氏不完全佐剂经皮内注射进行加强免疫共3次，毎次间隔2周。经效价检测达标后，将免疫获得的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,饲养层细胞为小鼠腹腔巨噬细胞，融合试剂为50%的PEG4000，脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为5: 1，置于5% CO2饱和湿度的37°C温箱中培育，第3、6、9、10日换入含HAT的完全1640培养液，用有限稀释法将克隆分别稀释于5块96孔板中，至杂交瘤细胞长好后吸取上清，，用ELISA检测上清抗体效价，筛选出阳性杂交瘤细胞(即分泌单克隆抗体多，且细胞生长状态好的杂交瘤细胞)。然后，筛选出分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。再经筛选获得的杂交瘤细胞株分泌，纯化后得单克隆抗体。2、ELISA法测定抗体效价使用碳酸盐缓冲液包被CRT抗原(浓度为I U g/ml、每孔100 U I) 4°C包被16h ；使用PBST洗涤液洗涤ELISA板I次，200 yl封闭液(I % BSA和I %山羊血清PBS)37°C 封闭 Ih ；CRT 抗体以 1/100、1/500、1/2500、1/12500、1/62500、1/312500、1/1562500 的五倍梯度稀释抗体作为ー抗，100 U I加入ELISA板，其中以PBST代替CRT抗体作为阴性对照。37°C孵育Ih后，使用PBST洗涤液洗涤ELISA板3次；加入IOOiU HRP标记的羊抗鼠IgG(l: 3000)作为ニ抗，37°C孵育Ih后，同样洗涤3次；100 U I TMB 避光显色 15min ；50 u 12mol/L H2SO4终止反应，在450nm波长酶标仪上测定吸光度值。将纯化的CRT蛋白包被ELISA板，纯化后单克隆抗体进行梯度稀释，经ELISA检测抗体具有很高的效价，单克隆抗体最高可达到1: 31万倍，具有良好的量效关系(图2A)。阴性对照孔A值为0.116。3、单抗特异性鉴定收集生长至80% -90%的Cos-7、A549以及转染了 pcDNA3.1 (+)-CRT」的细胞，用细胞裂解液冰上裂解30分钟，离心后获得上清加入5 X SDS凝胶上样缓冲液，100°C煮沸5min，冰浴 4min,室温下离心(12000Xg) Imin,取 20 y I 进行 SDS-PAGE 电泳。SDS-PAGE 电泳后转移硝酸纤维素膜，用5%脱脂奶粉封闭，分别加入的ー抗为CRT的单抗(I: 3000)和3-Actin抗体(I: 3000)，TBST洗涤3次后，分别加入HRP标记的羊抗鼠IgG(l: 3000)室温反应lh，同上洗涤；ECL显色。收集生长至80% -90%的Cos-7、A549以及转染了 pcDNA3.1 (+)-CRT」的细胞裂解液，SDS-PAGE电泳后转移硝酸纤维素膜，western blot检测内源性CRT及重组CRT的表达，结果显示在P -actin 一致的条件下，可以检测到36KD的CRT及30KD的重组CRT (rCRT)。提示CRT单克隆抗体具有良好的特异性(图3)。实施例2、CRT多抗的制备与鉴定1、多抗制备先取得5ml左右注射抗原前免疫新西兰大白兔血清，后以500 iig CRT抗原与弗氏完全佐剂混合制成乳剤，经皮内背部多点注射进行免疫。I个月后，用250 yg的抗原加弗氏不完全佐剂经皮内注射进行加强免疫共3次，毎次间隔2周。測定效价后，颈动脉取血离心后收集血清经饱和硫酸铵沉淀法纯化后加等体积的甘油_20°C保存。2、ELISA法测定抗体效价使用碳酸盐缓冲液包被CRT抗原(浓度为I ii g/ml、每孔100 U I) 4°C包被16h ；使用PBST洗涤液洗涤ELISA板I次，200 Ul封闭液(I % BSA和I %山羊血清PBS)37°C 封闭 Ih ；CRT 多克隆抗体分别以 1/100、1/500、1/2500、1/12500、1/62500、1/312500、1/1562500的5倍梯度稀释抗体作为ー抗，100 ill加入ELISA板，其中以PBST代替CRT抗体作为阴性对照。37°C孵育Ih后，使用PBST洗涤液洗涤ELISA板3次；加入100 ill HRP标记的羊抗兔IgG(l: 3000)作为ニ抗，37°C孵育Ih后，同样洗涤；100 U I TMB 避光显色 15min ；50 u 12mol/L H2SO4终止反应，在450nm波长的酶标仪上测定吸光度值。将纯化的CRT蛋白包被ELISA板，纯化后多克隆抗体进行梯度稀释，经ELISA检测抗体具有较高的效价，多克隆抗体最高可达到1: 31万倍，具有良好的量效关系(图2B)。阴性对照孔A值为0.116。3、多抗特异性检测从-80度取出已构建好的重组质粒pET28a(+)-CRT转化到宿主菌BL21 (DE3)中，经IPTG(终浓度1.0mmol/L)诱导表达，收集的细菌加入5X SDS凝胶上样缓冲液，100°C煮沸5min，冰浴4min，室温下离心(12000 X g) lmin，取20 进行SDS-PAGE电泳。考马斯亮蓝染色，通过凝胶成像系统测定表达产量。Western blot检测重组pET28a (+)-CRT蛋白，SDS-PAGE电泳后转移硝酸纤维素膜,用5%脱脂奶粉封闭,加入的ー抗为CRT的多抗(I:5000)，TBST洗涤3次后加入HRP标记的羊抗兔IgG(l: 3000)室温反应lh，同上洗涤；ECL显色。将重组质粒pET28a(+)-CRT质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞内，
1.0mmol/L IPTG诱导4 6h后，表达蛋白经10% SDS-PAGE电泳分离蛋白转印到硝基纤维膜条。以CRT多抗为ー杭，HRP标记的羊抗鼠抗体为ニ抗，可以看到诱导后的菌液和纯化的CRT蛋白在约32kD处出现特异性的蛋白，未经诱导的菌液和阴性对照均无相应条带(图4)。实施例3、律立双杭夹心ELISA检测法1、双抗夹心ELISA检测法的基本步骤用碳酸盐缓冲液(0.05MNa2C03/NaHC03, pH9.6))包被 I: 800CRT 单抗，每孔100 u 14°C包被 16h，PBST 洗涤 I 次；加入200 Ul封闭液(I % BSA和I %山羊血清PBS) 37°C封闭Ih，洗涤I次；加入IOOu 11% BSA 稀释的 CRT 抗原(0.g/ml，lOOyl/孔)37°C lh,由 PBST 洗涤3次；加入100 ill CRT 多抗(4500 X )，37°C孵育 Ih 后用 PBST 洗涤 3次；加入100 U I HRP标记的羊抗兔抗体(3000 X ) 37°C孵育lh，用PBST洗涤3次；100 U I/孔A+B显色液室温避光显色15min ；加入50 u I/孔的2mol/LH2S04终止反应，在450nm波长酶标仪上测定吸光度值。2、方阵滴定法测定CRT蛋白含量本实验应用纯化的单克隆抗体作为包被抗体，多克隆抗体作为结合抗体，选择合适的HRP-羊抗兔ニ抗浓度，用于测定CRT蛋白的含量。通过方阵滴定法的測定，当CRT浓度为5ng/ml、OD值为1.0时的单克隆抗体包被浓度及多抗结合浓度、羊抗兔-辣根过氧化物酶ニ抗浓度为最佳浓度。分别为单克隆抗体800倍稀释，多抗4500倍稀释，羊抗兔-HRP ニ抗3000倍稀释，阴性对照0.108 (见表I)。表I方阵滴定法測定CRT蛋白含量
权利要求
1.一种诊断癌症或评价癌症风险的酶联免疫吸附试剂盒，其包含:钙网蛋白(CRT)的特异性抗体，所述特异性抗体为通过以钙网蛋白为免疫原得到的单克隆抗体和/或多克隆抗体。
2.权利要求1所述的试剂盒，其中所述单克隆抗体为鼠源单克隆抗体，其制备方法如下:使用纯化的钙网蛋白作为免疫原对Balb/c小鼠进行免疫；经效价检测达标后，进行细胞融合；经筛选克隆获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，经杂交瘤细胞株分泌，得单克隆抗体。
3.权利要求1所述的试剂盒，其中:所述多克隆抗体为兔源多克隆抗体。
4.权利要求1-3任一所述的试剂盒，其还包含:酶标抗体，包被有所述单克隆抗体的微孔板，HRP标记的羊抗兔酶标抗体，标准阳性对照钙网蛋白，标准阴性对照大肠杆菌BL-21菌体蛋白，封闭液，样品稀释液，洗涤液，终止液，底物显色液。
5.权利要求4所述的试剂盒，其中所述的封闭液，样品稀释液，洗涤液，終止液，底物显色液的组分及配比如下: 1)封闭液由1%BSA液和I %山羊血清液组成，山羊血清在封闭时加入，使之浓度为封闭液的1%即可； 2)样品稀释液为IXPBS; 3)洗涤液为含浓度为0.05% Tween-20的PBS ； 4)终止液为2M的硫酸； 5)底物显色液包括A液和B液，A液的制备过程为:过氧化脲lg，磷酸氢ニ钠35.8g，柠檬酸10.2g，Tween-20100 iil，将前三者加ddH20避光溶解后加入Tween-20定容至1L，4°C避光保存液的制备过程为TMB0.7g，柠檬酸10.3g，DMS040ml，先用DMSO避光溶解前两者后加ddH20定容至1L，4°C避光保存；使用前等体积混合A液和B液，避光显色。
6.权利要求1-5任一所述的试剂盒，其中所述癌症为肺癌。
全文摘要
一种肿瘤标志物钙网蛋白检测试剂盒的制备及应用，属于基因工程和临床诊断领域。本发明应用重组CRT蛋白免疫BALB/c小鼠和新西兰大白兔制备了CRT的单克隆抗体、多克隆抗体，并建立了检测CRT最低量为0.3125ng/ml，检测限为40-0.3125ng/ml的高特异性和敏感性的ELISA试剂盒。通过制备的ELISA试剂盒，对收集的临床样品进行检测，结果发现肺癌病人血清中的CRT明显高于正常对照血清，统计学有显著差异(P<0.01)，为临床肺癌病人的诊断提供实验方法。
文档编号G01N33/68GK103091499SQ201310025418
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月23日 优先权日2013年1月23日
发明者刘朝奇, 吴薇, 杨建林, 汪龚泽 申请人:三峡大学