专利名称：一种检测甲胎蛋白的电化学免疫传感器的制备方法
技术领域：
本发明属于电化学免疫传感器技术领域，具体涉及一种检测甲胎蛋白的电化学免疫传感器的制备方法，尤其是基于ZnSe量子点及PEDOT导电化合物薄膜修饰电极用于甲胎蛋白免疫生物传感器的构建。
背景技术：
甲胎蛋白(a -fet0pix)tein，AFP)是胚胎发育早期的一种主要血清蛋白，在健康的成人体内，其值通常低于25 ng/ml，血清中甲胎蛋白的升高对原发性肝癌诊断具有重要的意义。目前甲胎蛋白的检测方法主要有酶联免疫分析法、放射免疫测定法、间接血酶法和琼脂双扩散法等。虽然这些方法灵敏、可靠，但存在酶不稳定，放射物质设备要求高，危害较大等缺点。
发明内容
本发明目的在于提供一种检测AFP的电化学免疫传感器的制备方法，该方法基于PEDOT及ZnSe量子点作为生物蛋白分子的固定载体，具有较宽的线性范围及较高的灵敏度。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种检测AFP的电化学免疫传感器的制备方法，其包括下述步骤:
1)制备水溶性ZnSe量子点；
2)制备PEDOT/Azure I /ZnSe 修饰电极;
3)构建电化学免疫传感器。所述步骤I)具体可参照文献[Enustun.B.V, Turkevich.J.J.Am.Chem.Soc.1963，85，3317-3328]进行 ZnSe 量子点的制备，并参照[Alexey Shavel, NikolaiGaponik, Alexander Eychmller.J.Phys.Chem.B.2004, 108, 5905-5908]对 ZnSe量子点进行纯化。所述步骤2)具体为:将处理清洁的直径为3mm的钼盘电极浸入含有0.5 mol/L3，4-乙烯二氧噻吩(EDOT)单体的1- 丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体中，在45°C温度条件下，以钼盘电极为工作电极，钼片电极为对电极，银丝作参比的+1.25 V的工作电位恒电位电聚合得到蓝色的PEDOT薄膜修饰电极，聚合电量为1.0 mC ;然后将PEDOT薄膜修饰电极用去离子水洗净，晾干，取5μ I质量百分比为5%的天青I (Azure I )溶液滴涂于PEDOT薄膜修饰电极表面，晾干成膜，用去离子水反复冲洗用以去除非共价键合的天青I，晾干，然后浸入ZnSe量子点溶液中浸泡12h，取出后用去离子水清洗干净，晾干备用，SP为 PEDOT/Azure I /ZnSe 修饰电极。所述步骤3)具体为:将步骤2)所得修饰电极浸入到30 μ I含1.0 mg/mL甲胎蛋白抗体(ant1- AFP)的磷酸缓冲溶液中4°C孵育12h，然后用PBST溶液清洗电极用以去除与修饰电极结合不够稳定的抗体；再将修饰电极浸入到含1.0mg/L辣根过氧化物酶(HRP)的磷酸缓冲溶液中放置4小时，取出，用PBST溶液清洗干净，由此即得到电化学免疫传感器；所述PBST溶液是由0.1 mol/L的磷酸氢二钾、磷酸二氢钾配置的磷酸缓冲溶液和浓度0.05%的Tween-20组成的混合溶液。量子点(quantum Dots,简称QDs)是一种半导体晶体材料的纳米颗粒,直径在10nm以内，较普通细胞的体积小数千倍。这种纳米尺寸的化合物具有水溶性、生物相容性等特点，在免疫生物学和临床检验学等研究中有广阔的应用前景。众所周知，纳米材料的催化性能取决于粒子的大小。小的粒径不仅有助于提高生物蛋白分子的固定能力，而且可以提供较多的活性比表面积，增加蛋白分子固定的个数。本申请合成了水溶性的ZnSe量子点，电镜结果显示其平均粒径为4.4 nm，相对于金胶纳米颗粒(16 nm)的粒径要小的多。因此，其可以代替金胶纳米颗粒作为生物蛋白分子的固定载体，从而改善生物蛋白分子的吸附能力，增加固定量。同时，在离子液体中电聚合得到的PEDOT聚合物薄膜具有疏松多孔的三维结构，便于吸附更多的量子点。因此，基于ZnSe量子点和导电聚合物PEDOT的双纳米粒子的协同作用，可以有效的增加电子传递。本申请采用PEDOT纳米导电材料来作为生物传感器的基体，通过共价键合的方法在复合材料的表面组装导电功能材料-天青I来共同作为电子传输体，这样既保证了抗原-抗体反应中电子的快速传递，又使得生物分子保持了有效的生物活性。更重要的是，硒化锌量子点的组装，使得标记的生物分子数目得到了增加，从而使得利用水溶性的硒化锌量子点作为信号扩增的甲胎蛋白免疫传感器，实现了对AFP的高灵敏度测定。此外，天青I作为一种生物染料，是一种比较活泼的电子转移媒介体，在导电基质上具有良好的电化学行为。本发明方法利用染料分子天青I作为电子媒介体，与聚(3，4_乙烯二氧噻吩)共同构建了抗体分子的固定载体，用ZnSe量子点来吸附在复合物薄膜表面，用于结合抗体分子与辣根过氧化物酶，将ZnSe量子点的化学放大作用与免疫传感器的特异性相结合，融合两者的优点，增强了电化学检测AFP的灵敏度和检测限。
图1是实施例1制备的电化学免疫传感器的构建示意 图2是实施例1制备的PEDOT及PEDOT /Azure I/ ZnSe薄膜的FESEM图；由PEDOT的电镜图片(a)可以看出制备的PEDOT为疏松多孔的三维结构，每层的厚度约10 nm，如此多孔的网状结构便于吸附更多的量子点，从而使得标记的生物分子数目增加，增强了免疫传感器的灵敏度；而由PEDOT /Azure I/ ZnSe的电镜图(b)可观察到网状结构表面覆盖大量的小颗粒，标识着在PEDOT的表面成功地修饰了大量的ZnSe量子点；
图3为按照实施例1制备的电化学免疫传感器的线形曲线。
具体实施例方式以下通过具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围并不局限于此。实施例1
一种检测AFP的电化学免疫传感器的制备方法，其包括下述步骤: I)制备水溶性ZnSe量子点:
制备:参照文献[Enustun.B.V, Turkevich.J.J.Am.Chem.Soc.1963, 85,3317-3328]进行，具体为:量取125ml的二次蒸馏水充氮除氧lh，然后在搅拌条件下向水中加入 0.875g(2.35 mmol) ZnClO4.6H20 与 5.7 mmol 的 3-巯基丙酸(MPA，用作稳定剂)，用 Imol/L的NaOH溶液将反应溶液的pH值调节为6.5，继续向溶液中通氮气除氧。搅拌下，力口Λ 0.134g(0.46mmol)Al2Se3及过量硫酸进行反应(用以产生新鲜的H2Se3),在此状态下，产生了 ZnSe的前驱体。然后加热回流2h，经过成核以及生长阶段，得到荧光发射波长为390nm的ZnSe量子点。纯化:参照文献[AlexeyShavel, Nikolai Gaponik, Alexander Eychmller.J.Phys.Chem.B.2004, 108, 5905-5908]纯化，具体为:将 ZnSe 量子点用 3000 MW 的超滤离心管于4°C离心15 min用以消除未反应完的MPA。然后用50 mmol/L、pH 7.4的PBS缓冲液洗涤三遍，取离心管的上部溶液再溶于PBS缓冲液中，用50 000 MW的超滤离心管进行第二次超滤离心，离心后将离心管下部的溶液在3000 MW的超滤离心管中经过离心浓缩，使得量子点的浓度达到0.1 μ mol/L,高分辨透射电镜结果表明制得的ZnSe量子点平均粒径为 4.4 nm。)制备PEDOT/Azure I /ZnSe 修饰电极:
将直径3 mm的钼盘电极依次用直径1.0,0.3和0.05 μ m的Al2O3粉在麂皮上抛光至镜面，每次抛光后用清水洗去表面污物，再分别用超纯水、乙醇各超声清洗3 min,氮气吹干、待用。以BMMBF4为电解液与支持电解质，于5ml的BMMBF4中加入作为反应单体的EDOT
2.5mmol，搅拌均匀。先通氮气保护30min用以使溶液处于氮气氛围下。在45°C温度条件下采用三电极体系，以清洗干净的直径为3mm钼盘电极为工作电极，钼片为对比电极，银丝作参比电极，搅拌状态下，在上述电解液中于+1.25 V (vs.Ag)的工作电位恒电位电聚合，聚合电量为1.0 mC，得到表面包覆有蓝色PEDOT聚合物薄膜的修饰电极(即PEDOT修饰电极)。将PEDOT修饰电极用去离子水冲洗干净，晾干。取5 μ I质量百分比为5%的天青I水溶液滴涂于PEDOT修饰电极表面，晾干成膜，用去离子水反复冲洗，用以去除非共价键合的天青I，晾干，然后浸入Iml的ZnSe量子点溶液(量子点浓度0.1 μ mol/L)中浸泡12h，取出后用去尚子水清洗干净，晾干备用，即为PEDOT/Azure I /ZnSe修饰电极。)构建电化学免疫传感器:
将PEDOT/Azure I /ZnSe修饰电极浸入到30 μ I含1.0 mg/mL甲胎蛋白抗体的磷酸缓冲溶液中4°C孵育12h以使抗体分子结合在修饰电极表面，然后用PBST溶液清洗修饰电极用以移走电极表面物理吸附的抗体；再将修饰电极浸入到30μ I含1.0mg/L HRP的磷酸缓冲溶液中放置4小时，取出，用PBST溶液清洗干净，由此即得到电化学免疫传感器；所述PBST溶液是由0.1 mol/L的磷酸氢二钾、磷酸二氢钾配置的磷酸缓冲溶液和浓度0.05%的Tween-20组成的混合溶液。一)电化学免疫传感器检测AFP:
将制备好的电化学免疫传感器浸入到30 μ L含有不同浓度AFP的样品溶液中于37°C孵育20 min，用PBST溶液清洗电极表面后，与钼片对电极、甘汞参比电极组成三电极系统，在5ml含有2.0 mmol/L H2O2的pH 7.4磷酸缓冲液中进行循环伏安电化学检测。整个检测过程保持在氮气氛围中，扫描电位区间为-ο.6 0.3V (vs.SCE，Saturated CalomelElectrode)。根据响应电流与AFP浓度的对数之间的线性关系，绘制工作曲线。得到“响应电流一 AFP浓度”的线性曲线为1=2.52861ogC-0.2386，线性相关系数为0.9868 (结果见图
3)。AFP在5X 10_5 ng/ml 250 ng/ml范围内，响应电流与AFP浓度的对数保持良好的线性关系，检测限为10_6 ng/ml。二)电化学免疫传感器的稳定性与重现性:
将电化学免疫传感器浸入到30 μ L含有5 ng/ml AFP的标准溶液中于37 1:免疫反应20 min，然后用PBST溶液清洗电极表面后，与钼片对电极，甘汞参比电极，组成三电极系统，在5ml含有2.0 mmol/L H2O2的pH 7.4磷酸缓冲溶液中进行循环伏安电化学检测。整个检测过程保持在氮气氛围中，扫描电位区间为-0.6 0.3V (vs.SCE)。每隔三天对相同浓度的标准样品进打测试，60天后，传感器的电流响应保持在96.2%。 同时制备6个电化学免疫传感器，浸入到同一份含有5ng/ml AFP的标准品中于37°〇免疫反应20 min,测试响应电流，其相对标准偏差(RSD)在4.7%以内。将电化学免疫 传感器浸泡在piranha溶液(由浓硫酸与30%过氧化氢按体积比3:I混和而得)中5min即可除去电极表面的生物分子和有机物质，实现对免疫修饰电极的再生。重复上述的电极修饰过程即可得到全新的AFP传感器。对于连续再生5次的传感器，其相对标准偏差(RSD)为 5.6%。三)电化学免疫传感器在检测实际血清样品中AFP浓度的应用:
将电化学免疫传感器置于6份实际血清样品中免疫反应20 min后，按上述实验方法测量其电流值。然后通过线性方程求出样品中的AFP浓度，并和医院临床诊断中所使用的化学发光酶联免疫法得到的结果进行比较，结果见表I。由表I可看出，采用本发明方法制备的免疫传感器所得的检测结果和传统临床检测结果基本相一致。因此，表明该免疫传感器可满足临床对AFP检测的需求。
表1:电化学免疫法与化学发光酶免疫祛的AfP检测结果对比
权利要求
1.一种检测甲胎蛋白的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括下述步骤: 1)制备水溶性ZnSe量子点； 2)制备PEDOT/Azure I /ZnSe 修饰电极; 3)构建电化学免疫传感器。
2.如权利要求1所述检测甲胎蛋白的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤2)具体为:将处理清洁的钼盘电极浸入含有0.5 mol/L 3，4-乙烯二氧噻吩单体的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体中，在45°C温度条件下，以钼盘电极为工作电极，银丝为参比的+1.25 V的工作电位恒电位电聚合得到PEDOT薄膜修饰电极，聚合电量为1.0 mC ;然后将PEDOT薄膜修饰电极用去离子水洗净，晾干，取5 μ I浓度5%的天青I溶液滴涂于PEDOT薄膜修饰电极表面，晾干成膜，用去离子水反复冲洗用以去除非共价键合的天青I，晾干，然后浸入ZnSe量子点溶液中浸泡12h，取出后用去离子水清洗干净，晾干备用，即为PEDOT/Azure I /ZnSe修饰电极。
3.如权利要求1所述检测甲胎蛋白的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤3)具体为:将步骤2)所得修饰电极浸入到30 μ I含1.0 mg/mL甲胎蛋白抗体的磷酸缓冲溶液中4°C孵育12h，然后用PBST溶液清洗电极用以去除与修饰电极结合不够稳定的抗体；再将修饰电极浸入到含1.0mg/L辣根过氧化物酶的磷酸缓冲溶液中放置4小时，取出，用PBST溶液清洗干净，由此即得到电化学免疫传感器；所述PBST溶液是由0.1 mol/L的磷酸氢二钾、磷酸二氢钾配置的磷酸缓冲溶液和浓度0.05%的Tween-20组成的混合溶液。
全文摘要
本发明公开了一种检测甲胎蛋白的免疫生物传感器的制备方法，其通过将聚(3，4-乙烯二氧噻吩)、天青Ⅰ、ZnSe量子点及甲胎蛋白抗体自组装修饰到铂盘电极上得到。它利用染料分子天青Ⅰ作为电子媒介体，与聚(3，4-乙烯二氧噻吩)共同构建了抗体分子的固定载体，用ZnSe量子点来吸附在复合物薄膜表面，用于结合抗体分子与辣根过氧化物酶，将ZnSe量子点的化学放大作用与免疫传感器的特异性相结合，融合两者的优点，增强了电化学检测甲胎蛋白灵敏度和检测限。
文档编号G01N33/68GK103105497SQ20131004737
公开日2013年5月15日 申请日期2013年2月6日 优先权日2013年2月6日
发明者刘珂珂, 褚艳红, 刘清, 刘冲 申请人:河南省科学院高新技术研究中心