专利名称：黄芪颗粒指纹图谱的测定方法及其特征指纹图谱的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药指纹图谱分析方法，特别是黄芪颗粒HPLC特征指纹图谱的测定方法以及由此方法所得到的黄芪颗粒的特征指纹图谱。
背景技术：
我国传统的中药及其制剂大多缺乏严密的质量标准和科学的检测手段，难以有效的控制其内在质量，不能保证用药的安全、有效，也不符合国际医药市场的要求，严重制约了我国中药行业的发展。加强中药材质量控制研究是中药规范化、标准化的关键问题。只有对中药材进行科学的质量控制，才能保证中药质量，实现中药的“安全、有效、稳定、可控”。黄芪颗粒收载于《中药部颁标准》，标准编号:WS3-B-2224_96，是黄芪药材全成分提取物，为棕黄色颗粒，该药疗效确切，临床应用广泛，对慢性肾病、心血管系统疾病、糖尿病、肿瘤化疗放疗以及手术后、慢性鼻炎、骨质疏松等疾病具有较好的临床效果。该标准中主要以薄层色谱定性鉴别方法控制制剂质量，目前市场上生产黄芪颗粒的厂家较多，临床需求量巨大，现行的质量控制技术标准已经不能满足黄芪颗粒应用发展之需要。近年来，关于黄芪颗粒质量控制已有一定研究报道，有学者采用分光光度法建立黄芪颗粒中总黄酮的含量测定方法，四川大学华西药学院对黄芪颗粒中黄芪甲苷和总皂苷含量测定进行了研究，这些研究为黄芪颗粒的质量控制提供了一定参考，具有一定价值。目前，也有一些采用HPLC建立黄芪颗粒的特征指纹图谱分析方法，比如:公开号为“CN102353729A”、名称为“一种黄芪药材的质量检测方法”的专利文献中，采用乙腈-水系统作为流动相系统，但得到的指纹图谱中只有7个共有色谱峰；并且其针对的是黄芪药材，而不是黄芪颗粒制剂。公告号为“CN101327246B”、名称为“黄芪药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法和标准指纹图谱”的专利文件中，采用80%-95%的甲醇作为提取溶剂，乙腈-水系统作为流动相系统，其得到的指纹图谱分离度不是很好，只有19个特征色谱峰。
发明内容
本发明的目的在于:提供一种黄芪颗粒指纹图谱的测定方法及其特征指纹图谱。本发明通过对黄芪颗粒HPLC指纹图谱的研究，提供了一种快速评价黄芪颗粒质量的方法，弥补了现有质量控制技术的不足，使黄芪颗粒的质量控制技术更为完善、科学。本发明的技术方案:黄芪颗粒指纹图谱的测定方法包括以下步骤:( I)供试品溶液的制备:取黄芪颗粒粉碎，过筛，称取粉末，加甲醇溶液溶解，超声提取I 2次，每次5 30min，然后冷却，补足损失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；(2)对照品溶液的制备:取减压干燥至恒重的毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素对照品，分别加入甲醇制成对照品溶液；(3)测定:分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图；供试品溶液注入高效液相色谱仪后，以甲醇-0.5%甲酸水为流动相进行梯度洗脱；(4)用指纹图谱软件对所得的图谱进行处理，即得到黄芪颗粒特征指纹图谱。前述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法中，高效液相色谱测定时的色谱条件为:色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱；流动相A为甲醇，流动相B为0.5%甲酸水，A: B=2%-90%: 98%-10% ;流速 ImL.mirT1 ;柱温 30 °C ;检测波长 254nm。前述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法中，供试品溶液的制备过程为:取黄芪颗粒粉碎，过60目筛，精密称取粉末1.0g,加入10%甲醇溶液IOmL溶解，超声提取5min，然后冷却，补足损失重量，摇匀，滤过，取续滤液过0.45 μ m微孔滤膜，即得供试品溶液。前述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法中，对照品溶液的制备为:取减压干燥至恒重的毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素对照品，分别加入甲醇，制成每ImL分别含0.562mg毛蕊异黄酮苷、0.254mg芒柄花苷、0.357mg毛蕊异黄酮、0.274mg芒柄花素的对照品溶液。前述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法中，步骤(3)中分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各5-20 μ L，优选为10 μ L0前述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法中，流动相梯度洗脱过程中，洗脱液的A、B相变化为:0 lOmin，A相 2%-2% ；10 15min，A相 2%-3% ；15 20min，A相 3%-10% ;20_25min，A 相 10%-15% ；25-40min, A 相 15%-20% ；40-45min, A 相 20%-30% ；45-50min, A 相 30%-40% ；50-60min, A 相 40%-56% ；60-72min, A 相 56%-70% ；72-80min, A 相 70%-90% ；80-90min, A 相90%-90%。前述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法中，配制好的对照品溶液储存在4V的冰箱中备用。如前所述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法得到的黄芪颗粒特征指纹图谱；所述图谱中的共有峰为23个。与现有技术相比，本发明具有以下优点:1.本发明采用高效液相色谱法，建立黄芪颗粒的特征指纹图谱分析方法，除了应用常用的相似度分析外，还采用Simca-Pll.5软件进行主成分分析(PCA)，同时结合SPSS聚类分析对多个批次样品进行系统分析，能更加全面、客观、科学评价黄芪颗粒的质量，为黄芪颗粒的合理用药及进一步药效研究提供依据与参考。2.本发明建立了黄芪颗粒HPLC特征指纹图谱共有模式，标定了 23个共有峰，指认了其中4个共有峰，比现有技术指认的色谱峰多，表明其建立的指纹图谱技术含量高。统计结果显示，不同生产时间30批次黄芪颗粒被分为两大类，两类样品的色谱峰共有模式具有一定差异，这与黄芪颗粒原料黄芪药材有两个法定来源相吻合。因而本发明方法简便、快捷、准确、稳定、可靠，可用于黄芪颗粒样品的质量控制。3.由于指纹图谱不是为了测定某个成分的精确含量，而是要充分反映化学成分的信息。因此，本发明选择在254nm波长处进行测定，其出峰较多，反映的信息较完全；各个峰吸收值良好，基线平稳，也避免了近紫外杂质峰较大吸收情况。4.本发明方法所得黄芪颗粒指纹图谱的峰多，峰形好，易于鉴别，相似性高，准确可靠。
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。
图1是30批次黄芪颗粒指纹图谱叠加图；图2是黄芪颗粒样品的共有模式图谱；图3是不同批次黄芪颗粒样品主成分分析结果图；图4是不同批次黄芪颗粒样品聚类分析结果图；图5是黄芪颗粒样品的共有模式差异性比较图；图6是选用不同提取溶剂的黄芪颗粒HPLC指纹图谱；图7是选取不同提取溶剂用量的黄芪颗粒HPLC指纹图谱；图8是选取不同超声提取时间的黄芪颗粒HPLC指纹图谱；图9是以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱的黄芪颗粒HPLC指纹图谱；图10是以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱的黄芪颗粒HPLC指纹图谱；图11是以甲醇-0.5%甲酸水为流动相进行梯度洗脱的黄芪颗粒HPLC指纹图谱；图12是以甲醇-0.1%甲酸水为流动相进行梯度洗脱的黄芪颗粒HPLC指纹图谱；图13是以甲醇-0.1%乙酸水为流动相进行梯度洗脱的黄芪颗粒HPLC指纹图谱；图14是用色谱柱Diamonsil C18 (4.6mm*150mm, 25 μ m)测得的黄苗颗粒HPLC指纹图谱；图15是用色谱柱Hypersil ODS (4.0*250mm，5 μ m)测得的黄芪颗粒HPLC指纹图
-1'Tfe1曰；图16 是用色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18C4.6*250mm, 5 μ m)测得的黄芪颗粒HPLC指纹图谱；图17 是用色谱柱 Agilent ZORBAX SB-C18C4.6*150mm, 5 μ m)测得的黄芪颗粒 HPLC指纹图谱；图18是用色谱柱Phecda C18 (4.6*250mm, 5 μ m)测得的黄芪颗粒HPLC指纹图谱；图 19 是在 210nm、230nm、254nm、270nm、290nm、300nm、330nm 波长处进行测定的黄芪颗粒HPLC指纹图谱；图20是柱温为25°C、30°C、35°C时测得的黄芪颗粒HPLC指纹图谱。
具体实施例方式本发明的实施例1:黄芪颗粒指纹图谱的测定方法包括以下步骤:(I)供试品溶液的制备:取黄芪颗粒粉碎，过60目筛，精密称取粉末l.0g，加入10%甲醇溶液IOmL溶解，超声提取5min，然后冷却，补足损失重量，摇匀，滤过，取续滤液过0.45 μ m微孔滤膜，即得供试品溶液；(2)对照品溶液的制备:取减压干燥至恒重的毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素对照品，分别加入甲醇，制成每ImL分别含0.562mg毛蕊异黄酮苷、0.254mg芒柄花苷、0.357mg毛蕊异黄酮、0.274mg芒柄花素的对照品溶液(储存在4°C的冰箱中备用)；(3)测定:色谱条件:色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(5 μ mX4.6X 250mm);流动相 A 为甲醇，流动相 B 为 0.5% 甲酸水，A: B=2%-90%: 98%-10% ；流速ImL.miiT1 ;柱温30°C ;检测波长254nm ;分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10 μ L，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图；供试品溶液注入高效液相色谱仪后，以甲醇-0.5%甲酸水为流动相进行梯度洗脱；梯度洗脱过程中，洗脱液的Α、B相变化为:
O lOmin，A 相 2%_2% ;10 15min，A 相 2%_3% ;15 20min，A 相 3%_10% ；20-25min, A相 10%-15% ；25-40min, A 相 15%-20% ；40-45min, A 相 20%-30% ；45-50min, A 相 30%-40% ；50-60min, A 相 40%-56% ；60-72min, A 相 56%-70% ；72-80min, A 相 70%-90% ；80-90min, A 相90%-90% ；(4)用指纹图谱软件对所得的图谱进行处理，即得到黄芪颗粒特征指纹图谱。本发明的实施例2:黄芪颗粒指纹图谱的测定方法包括以下步骤:(I)供试品溶液的制备:取黄芪颗粒粉碎，过60目筛，精密称取粉末l.0g，加入10%甲醇溶液IOmL溶解，超声提取lOmin，然后冷却，补足损失重量，摇匀，滤过，取续滤液过
0.45 μ m微孔滤膜，即得供试品溶液；(2)对照品溶液的制备:取减压干燥至恒重的毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素对照品，分别加入甲醇，制成每ImL分别含0.562mg毛蕊异黄酮苷、0.254mg芒柄花苷、0.357mg毛蕊异黄酮、0.274mg芒柄花素的对照品溶液(储存在4°C的冰箱中备用)；(3)测定:色谱条件:色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(5 μ mX4.6X 250mm);流动相 A 为甲醇，流动相 B 为 0.5% 甲酸水，A: B=2%-90%: 98%-10% ；流速ImL.miiT1 ;柱温30°C ;检测波长254nm ;分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各
5μ L，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图；供试品溶液注入高效液相色谱仪后，以甲醇-0.5%甲酸水为流动相进行梯度洗脱；(4)用指纹图谱软件对所得的图谱进行处理，即得到黄芪颗粒特征指纹图谱。本发明的实施例3:黄芪颗粒指纹图谱的测定方法包括以下步骤:(I)供试品溶液的制备:取黄芪颗粒粉碎，过60目筛，精密称取粉末1.0g，加入10%甲醇溶液IOmL溶解，超声提取2次，每次30min，然后冷却，补足损失重量，摇匀，滤过，取续滤液过0.45 μ m微孔滤膜，即得供试品溶液；(2)对照品溶液的制备:取减压干燥至恒重的毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素对照品，分别加入甲醇，制成每ImL分别含0.562mg毛蕊异黄酮苷、0.254mg芒柄花苷、0.357mg毛蕊异黄酮、0.274mg芒柄花素的对照品溶液；(3)测定:色谱条件:色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱；流动相A为甲醇，流动相B为0.5%甲酸水，A: B=2%-90%: 98%-10% ;流速ImL.mirT1 ;柱温30°C ;检测波长254nm ;分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各20 μ L，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图；供试品溶液注入高效液相色谱仪后，以甲醇-0.5%甲酸水为流动相进行梯度洗脱；(4)用指纹图谱软件对所得的图谱进行处理，即得到黄芪颗粒特征指纹图谱。实验例:1.仪器与试药1.1 仪器安捷伦1260高效液相色谱仪(Agilent G1315D-1260DAD检测器);KQ_250B型超声波清洁器(昆山市超声仪器有限公司，功率250w);电子分析天平(A1205型，梅特勒-托利多仪器，上海有限公司)。
1.2 试药甲醇，色谱纯；乙腈，色谱纯；水为蒸馏水；其他试剂为分析纯。毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素，其批号分别为:M-020-110119，M-021-101215, C-018-101228, M-013-101116，成都瑞芬思生物科技有限公司提供；黄芪颗粒，贵州汉方制药有限公司提供的2010-2011年生产的30批次黄芪颗粒，其样品信息见表
1表I不同批次样品信息表
权利要求
1.一种黄芪颗粒指纹图谱的测定方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)供试品溶液的制备:取黄芪颗粒粉碎，过筛，称取粉末，加甲醇溶液溶解，超声提取I 2次，每次5 30min，然后冷却，补足损失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液； (2)对照品溶液的制备:取减压干燥至恒重的毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素对照品，分别加入甲醇制成对照品溶液； (3)测定:分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图；供试品溶液注入高效液相色谱仪后，以甲醇-0.5%甲酸水为流动相进行梯度洗脱； (4)用指纹图谱软件对所得的图谱进行处理，即得到黄芪颗粒特征指纹图谱。
2.根据权利要求1所述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法，其特征在于:高效液相色谱测定时的色谱条件为:色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱；流动相A为甲醇，流动相B为0.5% 甲酸水，A: B=2%-90%: 98%-10% ;流速 ImL.mirT1 ;柱温 30°C ;检测波长 254nm。
3.根据权利要求1所述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法，其特征在于:供试品溶液的制备过程为:取黄芪颗粒粉碎，过60目筛，精密称取粉末1.0g，加入10%甲醇溶液IOmL溶解，超声提取5min，然后冷却，补足损失重量，摇匀，滤过，取续滤液过0.45 μ m微孔滤膜，即得供试品溶液。
4.根据权利要求1所述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法，其特征在于:对照品溶液的制备为:取减压干燥至恒重的毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素对照品，分别加入甲醇，制成每ImL分别含0.562mg毛蕊异黄酮苷、0.254mg芒柄花苷、0.357mg毛蕊异黄酮、0.274mg芒柄花素的对照品溶液。
5.根据权利要求1所述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法，其特征在于:步骤(3)中分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各5-20 μ L0
6.根据权利要求5所述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法，其特征在于:步骤(3)中分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10 μ L0
7.根据权利要求2所述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法，其特征在于:流动相梯度洗脱过程中，洗脱液的Α、B相变化为:0 lOmin，A相2%_2% ;10 15min，A相2%_3% ；15 20min，A 相 3%_10% ；20-25min, A 相 10%_15% ；25-40min, A 相 15%_20% ；40-45min, A相 20%-30% ；45-50min, A 相 30%-40% ；50-60min, A 相 40%-56% ；60-72min, A 相 56%-70% ；72-80min,A 相 70%-90% ；80-90min, A 相 90%_90%。
8.根据权利要求4所述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法，其特征在于:配制好的对照品溶液储存在4°C的冰箱中备用。
9.如权利要求1 8中任一项所述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法得到的黄芪颗粒特征指纹图谱。
10.根据权利要求9所述的黄芪颗粒特征指纹图谱，其特征在于:所述图谱中的共有峰为23个。
全文摘要
本发明公开了一种黄芪颗粒指纹图谱的测定方法，包括以下步骤供试品溶液的制备、对照品溶液的制备、高效液相色谱仪测定及对数据和图谱的处理，以及由该方法得到的黄芪颗粒特征指纹图谱。与现有技术相比，本发明所得黄芪颗粒指纹图谱的峰多，峰形好，峰分离效果好，峰面积较大，易于鉴别，相似性高，准确可靠；本发明方法简便、快捷、准确、稳定、可靠，可用于黄芪颗粒样品的质量控制，能更加全面、客观、科学地评价黄芪颗粒的质量，为黄芪颗粒的合理用药及进一步药效研究提供了依据与参考。
文档编号G01N30/02GK103149300SQ201310068779
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月5日 优先权日2013年3月5日
发明者周欣, 陈华国, 赵超, 龚小见, 赵杨, 邓杰 申请人:贵州师范大学