一种小儿七星茶口服液指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱的制作方法
【专利摘要】本发明涉及中药制剂质量控制领域，公开了一种小儿七星茶口服液HPLC标准指纹图谱及其建立方法。所述的指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：供试品和对照品溶液的制备，色谱条件的确定，指纹图谱的测定，其特征在于，所述的色谱条件为：检测波长为280～340nm；柱温为20～40℃，流速为0.8～1.5ml/min，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以pH值为2.0～4.0的水溶液为流动相B，在50～80min内进行线性梯度洗脱，流动相A的起始体积分数为3～7%，结束时的体积分数为20～40%。该方法可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣，具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。
【专利说明】一种小儿七星茶口服液指纹图谱的建立方法及其标准指纹 图谱
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药制剂质量控制领域，更具体地，涉及一种小儿七星茶口服液指纹 图谱的建立方法及其标准指纹图谱。
【背景技术】
[0002] 小儿七星茶口服液中的主要成分为薏苡仁、稻芽、山楂、淡竹叶、钩藤、蝉蜕、甘草。 主治功能为，定惊消滞，用于小儿消化不良，不思饮食，二便不畅、夜寐不安。中山市恒生药 业有限公司是目前唯一一家获国家食品药品监督管理总局批准生产小儿七星茶口服液的 企业。
[0003] 中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统 研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。 中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴 别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分 的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。中药指纹图谱技术已涉及众多方 法，包括薄层扫描（TLCS)、高效液相色谱法（HPLC)、气相色谱法（GC)和高效毛细管电泳法 (HPCE )等色谱法以及紫外光谱法（UV )、红外光谱法（IR)、质谱法（MS )、核磁共振法（NMR)和 X-射线衍射法等光谱法。其中色谱方法为主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成为公认 的三种常规分析手段。由于HPLC具有分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、 应用范围广等特点。中药成分绝大多数可在高效液相色谱仪上进行分析检测，且积累较丰 富的应用经验。因此高效液相色谱法已成为中药指纹图谱技术的首选方法。
[0004] 对于小儿七星茶口服液，目前缺乏全面反映其质量和真伪的方法，现有技术中更 没有使用HPLC对小儿七星茶口服液进行质量评价。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术的上述不足，提供一种小儿七 星茶口服液指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱。
[0006] 本发明所要解决的上述技术问题通过以下技术方案予以实现：
[0007] -种小儿七星茶口服液指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：供试品和对照品溶 液的制备，色谱条件的确定，指纹图谱的测定，其特征在于，所述的色谱条件为：检测波长为 280?340nm ;柱温为20?40°C，流速为0. 8?1. 5ml/min，以十八烷基硅烷键合硅胶为填 充剂；流动相由流动相A和B组成，以乙腈为流动相A，以PH值为2. 0?4. 0的水溶液为流 动相B，在50?80min内进行线性梯度洗脱，流动相A的起始体积分数为3?7%，结束时的 体积分数为20?40%。
[0008] 该方法可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣，具有方法简便、稳定、精密度高、重现 性好等优点。利用该方法检测到的小儿七星茶口服液指纹图谱化学成分相对较多、各特征 峰高度比例适中，基线较平稳，分离度、峰形和柱效好。
[0009] 作为一种优选方案，所述的线性梯度洗脱的时间为70min ;线性梯度洗脱的的条 件为：
[0010] 〇min时，流动相A的体积分数为3?7%，流动相B的体积分数为97?93% ;
[0011] 25?35min时，流动相A的体积分数为13?17%，流动相B的体积分数为87? 83% ；
[0012] 50?70min时，流动相A的体积分数为20?30%，流动相B的体积分数为80? 70%。
[0013] 作为一种优选方案，所述的线性梯度洗脱的时间为60min ;线性梯度洗脱的的条 件为：
[0014] Omin时，流动相A的体积分数为5%，流动相B的体积分数为95% ;
[0015] 30min时，流动相A的体积分数为15%，流动相B的体积分数为85% ;
[0016] 60min时，流动相A的体积分数为25%，流动相B的体积分数为75%。
[0017] 在指纹图谱的建立方法中，为了使指纹图谱中的各特征峰具有较好的分离度、峰 形及合理的控制指纹图谱的检测时间，对于梯度洗脱条件的选择至关重要，本领域技术人 员在选择梯度洗脱条件的时候都需要付出大量的实验不断对梯度洗脱条件进行优化，因为 对于不同的中药材及制剂，其中的化学成分千差万别，不同的药材及制剂指纹图谱的洗脱 条件并无参考价值，流动相比例的微小变化将会对指纹图谱造成很大的影响，如将会影响 特征峰的分离度和峰形。本申请的发明人通过大量的实验，对梯度洗脱条件进行摸索，最终 确定了上述梯度洗脱条件。
[0018] 作为一种优选方案，所述的流动相B为体积分数为0. 01?0. 1%冰醋酸水溶液。
[0019] 作为一种最优选方案，所述的流动相B为体积分数为0. 1%冰醋酸水溶液。
[0020] 本发明考察了许多不同的流动相对指纹图谱的影响，结果表明，采用上述流动相， 指纹图谱中所得峰的信息较多；基线较平稳，分离度、峰形和柱效最佳。
[0021] 作为一种优选方案，所述的检测波长为290?320nm ;柱温为25?35°C，流速为 0· 8 ?L 2ml/min〇
[0022] 作为一种最优选方案，所述的检测波长为300nm ;柱温为30°C，流速为1. Oml/min。
[0023] 本发明考察了不同的检测波长、柱温对指纹图谱的影响，结果在上述波长和柱温 下得到的指纹图谱，其成分相对较多、各峰高比例适中、基线比较平稳。
[0024] 本发明所述的供试品溶液通过以下方法制备得到：取小儿七星茶口服液过 0. 45 μ m微孔滤膜，即得。本发明考察了利用不同溶剂、不同提取方法制备供试品溶液，结果 表明，在本发明所述方法下制备得到的供试品溶液，经检测，在指纹图谱中化学成分相对较 多、各峰高度比例适中，且基线比较平稳，故采用上述方法作为供试品溶液的制备方法。
[0025] 本发明所述对照品溶液的制备方法为取甘草苷对照品，精密称定，加甲醇制成每 lml含甘草苷0. 1?0. 2mg的溶液。优选地，加甲醇制成每lml含甘草苷0. 14mg的溶液。
[0026] 本发明所述指纹图谱的测定方法为分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各 2?15 μ 1，注入高效液相色谱仪，测定，记录色谱图。优选地，分别精密吸取对照品溶液和 供试品溶液各5 μ 1。
[0027] 所测定的指纹图谱中含有12个共有特征峰，其保留时间分别为：6. 301min; 8. 899min ；11.486min ；16. 165min ；17. 234min ；19. 424min ；24. 071min ；25.433min ； 28. 121min ;3L 558min ;36. 210min ;54. 356min〇
[0028] 所测定的指纹图谱中含有12个共有特征峰，以甘草苷峰为参照，其相对保留时 间分别为：〇· 1740 ;0· 2458 ;0· 3172 ;0· 4464 ;0· 4759 ;0· 5364 ;0· 6648 ;0· 7024 ;0· 7766 ; 0. 8715 ;1 ;1. 5011。
[0029] 所测定的指纹图谱中含有12个共有特征峰，其峰面积为：0. 0596 ;0. 0349 ; 0. 0768 ；0. 0279 ；0. 0642 ；0. 0566 ；0. 0227 ；0. 0191 ；0. 0857 ；0. 1630 ；0. 1732 ；0. 0222〇
[0030] 所测定的指纹图谱中含有12个共有特征峰，以甘草苷峰为参照，其相对峰面积 为：0· 3441 ;0· 2015 ;0· 4434 ;0· 1611 ;0· 3707 ;0· 3268 ;0· 1311 ;0· 1103 ;0· 4948 ;0· 9411 ; 1 ;0·1282。
[0031] 本发明具有如下有益效果：（1)该方法可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣，具有 方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点；（2)用该方法检测到的小儿七星茶口服液指 纹图谱化学成分相对较多、各特征峰高度比例适中，基线较平稳，分离度、峰形和柱效好。
【专利附图】
【附图说明】
[0032] 图1为供试品色谱图。
[0033] 图2为经指认后的色谱图。图1和2中，峰S为甘草苷。
[0034] 图3为方法1下制备得到的供试品的色谱图。
[0035] 图4为方法2下制备得到的供试品的色谱图。
[0036] 图5为方法3下制备得到的供试品的色谱图。
[0037] 图6为方法4下制备得到的供试品的色谱图。
[0038] 图7为方法5下制备得到的供试品的色谱图。
[0039] 图8为方法6下制备得到的供试品的色谱图。
[0040] 图9为检测波长为280nm时的色谱图。
[0041] 图10为检测波长为300nm时的色谱图。
[0042] 图11为检测波长为320nm时的色谱图。
[0043] 图12为检测波长为340nm时的色谱图。
[0044] 图13为流动相1下得到的色谱图。
[0045] 图14为流动相2下得到的色谱图。
[0046] 图15为流动相3下得到的色谱图。
[0047] 图16为流动相4下得到的色谱图。
[0048] 图17为流动相5下得到的色谱图。
[0049] 图18为流动相6下得到的色谱图。
[0050] 图19为流动相7下得到的色谱图。
[0051] 图20为流动相8下得到的色谱图。
[0052] 图21为流动相9下得到的色谱图。
[0053] 图22为流动相10下得到的色谱图。
[0054] 图23为梯度1下得到的色谱图。
[0055] 图24为梯度2下得到的色谱图。
[0056] 图25为梯度3下得到的色谱图。
[0057] 图26为梯度4下得到的色谱图。
[0058] 图27为梯度5下得到的色谱图。
[0059] 图28为梯度6下得到的色谱图。
[0060] 图29为梯度7下得到的色谱图。
[0061] 图30为梯度8下得到的色谱图。
[0062] 图31为梯度9下得到的色谱图。
[0063] 图32为梯度10下得到的色谱图。
[0064] 图33为梯度11下得到的色谱图。
[0065] 图34为梯度12下得到的色谱图。
[0066] 图35为梯度13下得到的色谱图。
[0067] 图36为梯度14下得到的色谱图。
[0068] 图37为梯度15下得到的色谱图。
[0069] 图38为梯度16下得到的色谱图。
[0070] 图39为梯度17下得到的色谱图。
[0071] 图40为梯度18下得到的色谱图。
[0072] 图41为梯度19下得到的色谱图。
[0073] 图42为梯度20下得到的色谱图。
[0074] 图43为梯度21下得到的色谱图。
[0075] 图44为梯度22下得到的色谱图。
[0076] 图45为梯度23下得到的色谱图。
[0077] 图46为梯度24下得到的色谱图。
[0078] 图47为梯度25下得到的色谱图。
[0079] 图48为梯度26下得到的色谱图。
[0080] 图49为梯度27下得到的色谱图。
[0081] 图50为梯度15°C下得到的色谱图。
[0082] 图51为梯度20°C下得到的色谱图。
[0083] 图52为梯度25°C下得到的色谱图。
[0084] 图53为梯度30°C下得到的色谱图。
[0085] 图54为梯度35°C下得到的色谱图。
[0086] 图55为梯度40°C下得到的色谱图。
[0087] 图56为梯度45°C下得到的色谱图。
【具体实施方式】
[0088] 以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限 定。
[0089] 本实施例使用如下仪器试药
[0090] 1.仪器高效液相色谱仪：Waters2695/2487, SHIMADZU(SIL-HTC/SPD-20A/ C70-20AC/LC-20AT);色谱柱 Ultimate AQ-C18 (5ym，150mmX4· 6mm)、资生堂 MG II -C18 (5 μ m, 150mmX4. 6mm)> Sepax Bi〇-C18 (5 μ m, 250mmX4. 6mm)> Agilent Eclipse XDB-C18 (5 4 111，25〇111111\4.6111111);电子天平：331'1:〇1'；[1180?2243、331'1:01'；[1180?22印；真空干燥箱： V0S-201SD ;超声波清洗器：KQ-300DA型。
[0091] 2.试剂乙腈为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。
[0092] 3.对照品甘草苷(批号为111610-2011106)，购于中国药品生物制品检定所。
[0093] 4. 供试品 20120503、20120201、20120202、20120203、20120302、20120501、 20120502、20120504、20120602、20120606、20120608、20120610、20120702、20120703、 20120710、20120802、20120806、20120812、20120905、20100914、20121002,共 21 批样品，均 由中山市中智药业集团有限公司提供。
[0094] 实施例1
[0095] 1.色谱条件的确定以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以 0. 1%冰醋酸溶液为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为300nm ;柱温为 30°C ;流速为 1. Oml/min。
[0096] 表1流动相梯度表
【权利要求】
1. 一种小儿七星茶口服液指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：供试品和对照品溶液 的制备，色谱条件的确定，指纹图谱的测定，其特征在于，所述的色谱条件为：检测波长为 280?340nm ;柱温为20?40°C，流速为0. 8?1. 5ml/min，以十八烷基硅烷键合硅胶为填 充剂；流动相由流动相A和B组成，以乙腈为流动相A，以PH值为2. 0?4. 0的水溶液为流 动相B，在50?80min内进行线性梯度洗脱，流动相A的起始体积分数为3?7%，结束时的 体积分数为20?40%。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的线性梯度洗脱的时间为70min ;线 性梯度洗脱的的条件为： Omin时，流动相A的体积分数为3?7%，流动相B的体积分数为97?93% ; 25?35min时，流动相A的体积分数为13?17%，流动相B的体积分数为87?83% ; 50?70min时，流动相A的体积分数为20?30%，流动相B的体积分数为80?70%。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的线性梯度洗脱的时间为60min ;线 性梯度洗脱的的条件为： Omin时，流动相A的体积分数为5%，流动相B的体积分数为95% ; 30min时，流动相A的体积分数为15%，流动相B的体积分数为85% ; 60min时，流动相A的体积分数为25%，流动相B的体积分数为75%。
4. 根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，所述的流动相B为体积分数为 0.01?0. 1%冰醋酸水溶液。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的流动相B为体积分数为0. 1%冰醋 酸水溶液。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的检测波长为290?320nm ;柱温为 25 ?35°C，流速为 0· 8 ?1. 2ml/min。
7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的检测波长为300nm ;柱温为30°C， 流速为 1· Oml/min。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法为：取小儿七 星茶口服液过0. 45 μ m微孔滤膜，即得；所述对照品溶液的制备方法为取甘草苷对照品，精 密称定，加甲醇制成每lml含甘草苷0. 1?0. 2mg的溶液。
9. 一种小儿七星茶口服液指纹图谱，其特征在于，含有12个共有特征峰，其保留时间 分别为：6. 301min ;8· 899min ;1L 486min ;16· 165min ;17· 234min ;19· 424min ;24· 071min ; 25. 433min ;28· 121min ;3L 558min ;36· 210min ;54· 356min〇
10. -种小儿七星茶口服液指纹图谱，其特征在于，含有12个共有特征峰，以甘草 苷峰为参照，其相对保留时间分别为：〇. 1740 ;0. 2458 ;0. 3172 ;0. 4464 ;0. 4759 ;0. 5364 ; 0. 6648 ；0. 7024 ；0. 7766 ；0. 8715 ；1 ；1, 5011〇
【文档编号】G01N30/88GK104122353SQ201310156489
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2013年4月28日 优先权日:2013年4月28日
【发明者】成金乐, 杨立伟, 彭丽华, 王慧玲, 孙丽丽, 周颖仪, 乔卫林, 唐琳 申请人:中山市恒生药业有限公司