一种γ-氨基丁酸快速检测试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种γ-氨基丁酸快速检测试剂盒及其检测方法，是在NADP+和α-酮戊二酸存在的条件下利用γ-氨基酸转氨酶和琥珀酸半醛脱氢酶的作用，在一系列酶促反应条件下NADPH被定量，从而间接定量GABA含量。应用此法检测γ-氨基丁酸含量，线性范围为5.0×10-4-1.0×10-2之间，回收率达到72.8％，相对标准偏差（RSD）小于4％，最低检出限为0.5mM。本发明方法具有反应体系小，成本低廉，易于推广，适合现场快速检测等优点。
【专利说明】一种Y-氨基丁酸快速检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种Y-氨基丁酸快速检测试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002]GABA为Y-氨基丁酸，又称氨酪酸，是一种非蛋白质天然氨基酸，是中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，具有很重要的生理功能，并广泛应用于食品中。近年来，GABA在食品中的应用研究正在掀起,而食品中GABA快速测定方法的报道尚不多见。关于GABA的测定近年来国内外有氨基酸分析仪测定、酶法、色质联用法、柱层析荧光测定法、纸电泳比色、毛细管气相色谱法、放射性受体法、毛细管电泳法，以及高效液相色谱法等，这些方法大多用于医学领域，价格昂贵，而且费时，不适用于大量的定量分析。在进行高产GABA乳酸菌株的筛选中，以及菌株发酵条件优化中，都要进行大量的GABA定量分析。显然需要一种简便、价廉的定量测定方法，因此本文研究了利用双酶试剂盒快速定量测定GABA的方法。
【发明内容】
[0003]本发明提供了一种Y -氨基丁酸快速检测试剂盒，技术方案如下:
[0004]每200 μ L 反应体系含有:25-40 μ g GABase、2_3mM NADP+、5_15mM 二硫苏糖醇、
l-4mMa -酮戊二酸、500-800mM 硫酸钠、70-100mM Tris-Hcl。
[0005]优选地,每200 μ L反应体系组成如下:Tris_Hcl:80mM> NADP+:1.4mM、二硫苏糖醇:10mM、a -酮戊二酸:2.0mM、硫酸钠:750mM、GABase:30 μ g。
[0006]本发明还提供了一种Y -氨基丁酸快速检测方法，步骤如下:
[0007]I)每 200 μ L 反应体系含有:25-40 μ g GABase、2_3mM NADP+、5_15mM二硫苏糖醇、
l-4mMa -酮戊二酸、500-800mM 硫酸钠、70-100mM Tris-Hcl ；
[0008]2)将预处理后的样品加入上述反应体系反应，在波长340nm检测吸光度；
[0009]3)将配置好的不同浓度梯度的GABA标准样品添加到反应体系中，建立标准曲线，未知样品中GABA含量的根据标准曲线计算得到。
[0010]GABase或GABA酶均为Y-氨基丁酸转氨酶。
[0011]具体而言，检测GABA含量的方法按以下步骤实现:
[0012]I) 200 μ L 反应体系:
[0013]Tris-Hcl:80mM
[0014]NADP+:1.4mM
[0015]二硫苏糖醇:10mM
[0016]α-酮戊二酸:2.0mM
[0017]硫酸钠:750mM
[0018]GABase:30 μ g
[0019]样品溶液:20 μ L
[0020]2)将预处理后的样品加入上述反应体系反应，反应温度为30°C，在波长340nm检测吸光度；
[0021]3)将配置好的不同浓度梯度的GABA标准样品添加到反应体系中，建立标准曲线，未知样品中GABA含量的根据标准曲线计算得到。
[0022]对于发酵酸奶样品中Y-氨基丁酸的检测，需要将发酵酸奶样品进行前处理，避免酸奶中蛋白质、氨基酸等物质对于Y-氨基丁酸测定产生影响。具体预处理方法如下:取50g乳酸菌发酵奶，IOOOOrpm离心20min,取40mL上清液加入IOmLlO %的磺基水杨酸，
0.45um滤膜过滤,4°C冷藏静置60min, 14500rpm离心15min, 0.45um滤膜过滤,使用旋转蒸发仪对样品浓缩，浓缩液置于4°C备用。
[0023]本发明提供的检测方法，准确率高、检测速度快，整个检测结果可以在30min以内完成，有利于提闻食品检验检疫机构的检测能力。
【具体实施方式】
[0024]实施例1快速检测反应体系的建立
[0025]反应体系包括的化学试剂为Y-氨基丁酸转氨酶、琥珀酸半醛脱氢酶、辅酶I1、二硫苏糖醇、α-酮戊二酸、硫酸钠、Tris-Hc。其中每200uL反应体系含有25ug GABase、2mMNADP+、15mM 二硫苏糖醇、ImMa -酮戊二酸、500mM 硫酸钠、70mM Tris-Hcl。
[0026]将样品20 μ L加入上述反应体系中进行反应；上述反应体系可检出最低GABA浓度为0.5mM，低于0.5mM检测会受到限制。
[0027]实施例2快速检测反应体系的建立
[0028]反应体系包括的化学试剂为Y-氨基丁酸转氨酶、琥珀酸半醛脱氢酶、辅酶I1、二硫苏糖醇、α-酮戊二酸、硫酸钠、Tris-Hc。其中每200uL反应体系含有30ug GABase、3mMNADP+、10mM 二硫苏糖醇、2mMa -酮戊二酸、750mM 硫酸钠、80mM Tris-Hcl。
[0029]将样品20 μ L加入上述反应体系中进行反应；上述反应体系可检出最低GABA浓度为0.5mM，低于0.5mM检测会受到限制。
[0030]检测产Y-氨基丁酸乳酸菌发酵奶中GABA的含量为:61.7mg/100g，采用液相色谱的方法检测同一样品中GABA的含量为58.4mg/100g。
[0031]实施例3快速检测反应体系的建立
[0032]反应体系包括的化学试剂为Y-氨基丁酸转氨酶、琥珀酸半醛脱氢酶、辅酶I1、二硫苏糖醇、α-酮戊二酸、硫酸钠、Tris-Hc。其中每200uL反应体系含有40ug GABase、2mMNADP+、5mM 二硫苏糖醇、4mMa -酮戊二酸、800mM 硫酸钠、IOOmM Tris-Hcl。
[0033]将样品20 μ L加入上述反应体系中进行反应；上述反应体系可检出最低GABA浓度为 0.5mM,
[0034]低于0.5mM检测会受到限制。
[0035]检测产Y-氨基丁酸乳酸菌发酵奶中GABA的含量为:60.9mg/100g，采用液相色谱的方法检测同一样品中GABA的含量为58.4mg/100g。
[0036]实施例4GABA标准曲线的建立
[0037]在GABA标准溶液浓度为0.5-10mM范围内建立标准曲线，纵坐标y代表吸光值，横坐标X代表GABA浓度，得到线性方程，y=0.285x_0.21，相关系数R2=0.9966，(n=6)。
[0038]实施例5发酵奶中GABA含量的检测[0039]对发酵奶中GABA含量的快速检测按以下步骤实现:
[0040]第一步:将含有Y-氨基丁酸的发酵酸奶样品进行样品前处理，标准品不经样品前处理。所采用的前处理方法为磺基水杨酸法，将处理好的样品加入到配制好的混合反应体系中。
[0041]第二步:将反应体系放于分光光度计的样品池中，样品池选用的是微量样品池，反应温度为30°C，波长为340nm。
[0042]第三步:将所得的数据通过标准曲线进行转化，采用实施例1方法检测得到产Y -氨基丁酸乳酸菌发酵奶中GABA的含量为:61.3mg/100g。
[0043]为了验证方法的准确性，我们对实验进行了精密度和回收率实验。在检测结果线性范围为5.0X 10_4-1.0X 10_2之间，回收率达到72.8%，相对标准偏差(RSD)小于4%。
[0044]另外，对同一批次样品经过样品前处理用高效液相色谱方法进行检测，检测同一样品中GABA的含量为58.4mg/100g。
[0045]所述GABA产Y -氨基丁酸乳酸菌发酵奶的制备方法见中国发明专利:一种富含GABA酸奶的制备方法。
【权利要求】
1.一种Y-氨基丁酸快速检测试剂盒，其特征在于，每200μ L反应体系含有:25-40ygGABase、2_3mM NADP+、5_15mM二硫苏糖醇、l_4mM α -酮戊二酸、500-800mM硫酸钠、70_100mMTris-Hclο
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，每200μ L反应体系组成如下:TriS-Hcl:80mM、NADP+:1.4mM、二硫苏糖醇:IOmM, α -酮戊二酸:2.0mM,硫酸钠:750mM、GABase:30 μ g0
3.一种Y-氨基丁酸快速检测方法，其特征在于，步骤如下: 1)每200 μ L 反应体系含有:25-40 μ g GABase、2_3mM NADP+、5_15mM 二硫苏糖醇、l-4mMa -酮戊二酸、500-800mM 硫酸钠、70-100mM Tris-Hcl ； 2)将预处理后的样品加入上述反应体系反应，在波长340nm检测吸光度； 3)将配置好的不同浓度梯度的GABA标准样品添加到反应体系中，建立标准曲线，未知样品中GABA含量的根据标准曲线计算得到。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，样品加入反应体系后反应温度为30°C。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，样品加入反应体系后反应时间为60min。
6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述200μ L反应体系组成如下:
Tris-Hcl:80mM
NADP+:1.4mM
二硫苏糖醇:10mM
a -酮戊二酸:2.0mM`
硫酸钠:750mM
GABA 酶:30 μ g
样品溶液:20μ?。
7.根据权利要求3所述方法，其特征在于，具体步骤如下: 1)200 μ L反应体系:
Tris-Hcl:80mM
NADP+:1.4mM 二硫苏糖醇:10mM a -酮戊二酸:2.0mM 硫酸钠:750mM GABA 酶:30 μ g 样品溶液JOyL 2)将预处理后的样品加入上述反应体系反应，反应温度为30°C，在波长340nm检测吸光度； 3)将配置好的不同浓度梯度的GABA标准样品添加到反应体系中，建立标准曲线，未知样品中GABA含量的根据标准曲线计算得到。
8.根据权利要求3所述方法，其特征在于，具体步骤如下: I)对于发酵酸奶中Y -氨基丁酸的检测，需将发酵酸奶样品进行前处理，前处理方法如下:取50g乳酸菌发酵奶，1000Orpm离心20min,取40mL上清液加入IOmLlO %的磺基水杨酸，0.45um滤膜过滤，4°C冷藏静置60min, 14500rpm离心15min,0.45um滤膜过滤,使用旋转蒸发仪对样品浓缩，浓缩液置于4°C备用； 2)200 μ L反应体系:
Tris-Hcl:80mM
NADP+:1.4mM 二硫苏糖醇:10mM α -酮戊二酸:2.0mM 硫酸钠:750mM GABA 酶:30 μ g 样品溶液JOyL 3)将预处理后的样品加入上述反应体系反应，反应温度为30°C，在波长340nm检测吸光度； 4)将配置好的不同浓度梯度的GABA标准样品添加到反应体系中，建立标准曲线，未知样品中GABA含量的根据标准曲线计算得到。
【文档编号】G01N21/31GK103487389SQ201310287428
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年7月10日 优先权日:2013年7月10日
【发明者】姜毓君, 满朝新, 闫天文 申请人:黑龙江省乳品工业技术开发中心