一种有机磷农药快速检测用生物传感器及其检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种有机磷农药快速检测用生物传感器及其检测方法，以饱和甘汞电极为参比电极，铂片电极为对电极，以固定有酪氨酸酶和1,2-萘醌-4-磺酸钠底物的玻碳电极上作为工作电极，该工作电极用非导电聚合物将酪氨酸酶和1,2-萘醌-4-磺酸钠底物一起电化学聚合固定在玻碳电极上，因此利用本发明的生物传感器检测有机磷农药更可靠、灵敏、快速。本发明的生物传感器制备简单，可重复使用，利用率高，适合现场操作，利用这种生物传感器检测有机磷农药，不用每次都配置酶和底物溶液，能在较短的时间内筛选出大量的超标样品，缩小定量检测范围，是复杂的实验室方法的有效补充。
【专利说明】一种有机磷农药快速检测用生物传感器及其检测方法
【技术领域】:
[0001]本发明涉及食品以及农业领域，具体涉及一种有机磷农药快速检测用生物传感器及其检测方法。
【背景技术】:
[0002]随着农业产业化的发展，农副产品的生产越来越依赖于农药、激素和抗生素等外源物质。我国农药在粮食、水果、蔬菜、茶叶上的用量居高不下，而这些物质的不合理使用必将导致农副产品中的农药残留超标，影响消费者的食用安全。近年来，由于食品安全引发的问题使得人类健康受到严重的威胁，例如由于过量使用或不符合规定的使用农药而导致水果蔬菜等中农药残留，使人们急性或慢性中毒。目前，我国常用的有机磷、氨基甲酸酯类农药如马拉硫磷、甲胺磷、乐果、对硫磷等几十种高毒农药占总农药用量的70%以上。这些有机磷、氨基甲酸酯类农药都是通过抑制乙酰胆碱酯酶的活性使组织中乙酰胆碱不能分解而过量蓄积，使一系列以乙酰胆碱为传导介质的神经处于过度兴奋，最后衰竭而引起轻重不等的中毒。且它们易溶于有机溶剂，在中性和酸性条件下稳定，不易水解，在碱性条件下易水解而失效。因此，对食品中农药残留量的快速检测一直是食品安全检测的重要课题。控制农产品中农药残留量的关键环节之一就是对农产品中农药残留量及时、准确的分析检测，以监控农药的合理使用，同时杜绝农药残留超标的产品上市销售。
[0003]对食品中农药残留量的检测，传统采用GC/MS等农药残留分析技术，但这些技术存在检测成本高、时间长的弊端，这给食品安全监管部门对农产品产前、产中、产后的监督工作带来了许多不便，因此大量的快速检测技术孕育而生。利用有机磷农药和氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶的特异性抑制反应而发展的乙酰胆碱酯酶快速分析方法已广泛应用于痕量和微量有机磷和氨基甲酸酯类农药的残留检测，然而，乙酰胆碱酯酶常会被农残物不可逆性抑制，重复使用时需要对酶进行激活，而常常遇到酶不能重新激活的情况，因而该方法实际应用因重复性和灵敏度问题受到一定的限制。因而各国科学家都在致力于寻找新的、性能更好的酶代替目前的乙酰胆碱酯酶，已有采用一些新的酶(如酪氨酸酶、维生素C氧化酶、葡萄糖氧化酶、碱性和酸性磷酸酯酶、有机磷水解酶)制成生物传感器应用到农药残留快速检测方面的研究报道，比如曲云鹤等(参见文献:曲云鹤，肖飞，程欲晓，施国跃，金利通.Tyr/Glu/Fe304/Nafion/CNT/GCE酪氨酸酶生物传感器的制备及应用于农药检测的研究[J].化学学报，2010，68 (6):535-539.)公开了一种酪氨酸酶生物传感器的制备及应用于农药检测，用酪氨酸酶制备的生物传感器的重复性好，灵敏度高，可以重复使用，能满足痕量有机磷和氨基甲酸酯类农药的残留检测的要求。但将酶固定在电极上的生物传感器，每次检测时需要配 置底物溶液，不利于现场快速的初筛工作。
【发明内容】
:
[0004]本发明的目的是提供一种有机磷农药快速检测用生物传感器及其检测方法。
[0005]本发明是通过以下技术方案予以实现的:[0006]—种固定有酪氨酸酶和1，2-萘醌-4-磺酸钠(NQS)底物的玻碳电极的制备方法，该方法包括以下步骤:
[0007]a、将玻碳电极用氧化铝抛光粉打磨光亮，清洗干净后晾干；
[0008]b、将新配置的10 U L0.05mol/L的1，2_萘醌_4_磺酸钠(NQS)溶液滴涂在在步骤a得到的裸玻碳电极表面，自然晾干；
[0009]C、将10 u L20mg/mL的酪氨酸酶和5 u L2.5mg/mL的戍二醒溶液一起滴涂在经步骤b处理过的玻碳电极上，在4°C通氮气下晾干，得到经滴涂处理的玻碳电极；
[0010]d、将非导电聚合物单体溶于0.05mol/L PH=6.5的磷酸缓冲液中得到浓度为0.05mol/L的非导电聚合物单体溶液，通N2除氧，然后将步骤c得到的经滴涂处理的玻碳电极泡在0.05mol/L的非导电聚合物单体溶液中经电化学方法聚合得到表面上覆盖有一层非导电聚合物薄膜的玻碳电极，将制作好的目标电极贮存在4°C的磷酸缓冲液中24h以上再使用。
[0011]所述非导电聚合物单体优选为间苯二胺，所述非导电聚合物优选为聚间苯二胺。
[0012]聚合前非导电聚合物单体溶液通N2除氧可以防止聚合反应初期氧气对自由基阳离子的进攻。
[0013]所述电化学方法聚 合是在0.8V电压下作用30s。
[0014]本发明还提供一种有机磷农药快速检测用生物传感器，该传感器以饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，钼片电极为对电极，以上述固定有酪氨酸酶(Tyr)和底物1，2-萘醌-4-磺酸钠(NQS)的玻碳电极作为工作电极。
[0015]该工作电极用非导电聚合物将酪氨酸酶(Tyr)和底物(NQS)—起经电化学聚合固定在玻碳电极上。
[0016]所述非导电聚合物优选为聚间苯二胺。
[0017]所述有机磷农药选自灭菌磷、碘硫磷、二嗪磷、甲基氯吡硫磷中的任一种。
[0018]一种有机磷农药快速检测方法，该方法将前述有机磷农药快速检测用生物传感器放入PH=6.5的磷酸缓冲液溶液中，利用计时电流法在电化学工作站上用电流-时间方法扫描，研究酪氨酸酶玻碳电极的电化学行为，包括以下步骤:
[0019]首先在未加有机磷农药之前测定空白曲线，是在30mL0.05mol/L的磷酸缓冲液(通0215min)中进行扫描，在E=+0.1OV下稳定90s ;在￡=-0.15V下作用15s ;在￡=+0.1OV下恢复60s ；
[0020]空白曲线测定好之后，加入5 U L的配置好的有机磷农药溶液，孵育Imin后进行测定，按上述步骤进行，记录不同浓度有机磷农药对酪氨酸酶抑制的曲线。
[0021]所述有机磷农药快速检测用生物传感器的作用机理如下:
[0022]被固定在工作电极上的酪氨酸酶的活性随着脉冲电流的不同而不同。首先吸附在工作电极电极上的是1，2-萘醌-4-磺酸钠(NQS)，随着脉冲电流(+0.10V)加载在工作电极上，在没有酶的催化作用使1，2-萘醌-4-磺酸钠(NQS)转化为1，2-萘二酚-4-磺酸钠(H2NQS) ,H2NQS为酶的有效底物。在脉冲电流(-0.150V)加载在工作电极上时，将H2NQS转化为NQS，这就终止了此酶促反应。此时酪氨酸酶也由变位态酪氨酸酶(met-Tyr)转化为脱氧态酪氨酸酶(deoxy-Tyr)，在氧气的作用下脱氧态酪氨酸酶(deoxy-Tyr)转化为氧化态的酪氨酸酶(oxy-Tyr) ,H2NQS同时也与氧化态酪氨酸酶(oxy-Tyr)作用自身氧化成NQS的同时，将酪氨酸酶还原成变位态(met-Tyr)。这样就完成了一个循环，NQS和Tyr都能循环的使用。具体反应的机理如下:
[0023]NQS2H+2eH2NQS (E=+0.1V)
[0024]H2NQSmet-Tyr [Cu2+4] -2e_NQS+deoxy-Tyr [Cu2+2] +2H+
[0025]02+deoxy-Tyr [Cu2+2] oxy-Tyr [Cu2+4/O2-2]
[0026]所述有机磷农药选自表I所示的序号为I?5、8?9、11?15、17?26有机磷农药，优选为灭菌磷、碘硫磷、二嗪磷、甲基氯吡硫磷等有机磷农药。
[0027]本发明具有如下有益效果:
[0028](I)本发明利用非导电聚合物自身抑制生长的特点在电化学聚合时得到的膜的厚度在IO-1OOnm,使得小分子扩散障碍小，能够容易到达酶分子，也就大大减少了修饰物对底物、酶和农药之间相互作用的影响，而且非导电聚合物比导电聚合物具有更好的选择渗透性，减少了样品中一些可能的电化学干扰；因此利用本发明的生物传感器检测有机磷农药更可靠、灵敏、快速。
[0029](2)由于有机磷农药与酪氨酸酶之间属于可逆性的抑制作用，底物的不同状态1，2-萘醌-4-磺酸钠和1，2-萘二酚-4-磺酸钠可以通过电流相互转化，因此本发明制备的生物传感器可重复使用，利用率高；且这种传感器制备简单，适合现场操作，利用这种生物传感器检测有机磷农药，不用每次都配置酶和底物溶液，能在较短的时间内筛选出大量的超标样品，缩小定量检测范围，是复杂的实验室方法的有效补充。
【专利附图】
【附图说明】:
[0030]图1是裸玻碳电极的SEM表征图；
[0031 ]图2是修饰NQS后的玻碳电极的SEM表征图；
[0032]图3是修饰NQS和酪氨酸酶后的玻碳电极的SEM表征图；
[0033]图4是聚合膜修饰后的玻碳电极的SEM表征图；
[0034]图5是实施例2得到的生物传感器检测灭菌磷的计时电流曲线；
[0035]图6是实施例2得到的生物传感器检测灭菌磷的抑制剂浓度与抑制率的关系；
[0036]图7是实施例2得到的生物传感器检测碘硫磷的计时电流曲线；
[0037]图8是实施例2得到的生物传感器检测碘硫的抑制剂浓度与抑制率的关系；
[0038]图9是实施例2得到的生物传感器检测二嗪磷的计时电流曲线；
[0039]图10是实施例2得到的生物传感器检测二嗪磷的抑制剂浓度与抑制率的关系；
[0040]图11是实施例2得到的生物传感器检测甲基氯吡硫磷的计时电流曲线；
[0041]图12是实施例2得到的生物传感器检测甲基氯吡硫磷的抑制剂浓度与抑制率的关系;
[0042]图13-18分别表示灭菌磷、碘硫磷、甲基氯吡硫磷、甲基吡恶磷、二嗪磷、特丁硫磷对酪氨酸酶催化氧化L-DOPA抑制作用的Lineweaver-Burk曲线；
[0043]其中，图13中0、1、2分别表示灭菌磷的浓度为0，0.046，0.0933mmol/L ；
[0044]图14中0、1、2分别表示碘硫磷的浓度为0，0.0581，0.1162mmol/L ；
[0045]图15中0、1、2分别表示甲基氯吡硫磷的浓度为0，0.0619，0.0928mmol/L ；
[0046]图16中0、1、2分别表示甲基吡恶磷的浓度为0，0.5815，0.9692mmol/L ；[0047]图17中0、1、2分别表示二嗪磷的浓度为0，0.0361，0.0676mmol/L ；
[0048]图18中0、1、2分别表示特丁硫磷的浓度为0，0.1597，0.3194mmol/L ；
[0049]图19是不同灭菌磷浓度下酪氨酸酶活力和酶量的关系；
[0050]其中图中的0、1、2、3分别表示灭菌磷的浓度为0，0.0234，0.0467，0.0933mmol/L ；
[0051]图20是不同甲基氯吡硫磷浓度下酪氨酸酶活力和酶量的关系；其中图中0、1、2、3分别表示甲基氯吡硫磷的浓度为0，0.0712, 0.1068, 0.1424mmol/L。
【具体实施方式】:
[0052]以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0053]实施例1:一种用聚间苯二胺固定酪氨酸酶(Tyr)和底物(1，2_萘醌_4_磺酸钠)的玻碳电极的制备方法
[0054]一种用聚间苯二胺固定酪氨酸酶(Tyr)和底物(1，2_萘醌_4_磺酸钠)的玻碳电极的制备方法如下:
[0055]a、将直径为2mm的玻碳电极(用做工作电极)依次用粒子直径为I U m、0.3 ii m和
0.05 um的氧化铝抛光粉打磨光亮，再依次用蒸馏水，乙醇，蒸馏水超声波清洗3min，清洗干净后晾干；
[0056]b、将新配置的10 U L0.05mol/L的1，2_萘醌_4_磺酸钠溶液滴涂在在步骤a得到的裸玻碳电极表面，自然晾干；
[0057]C、将10 V- L20mg/mL的酪氨酸酶和5 u L2.5mg/mL的戍二醒溶液一起滴涂在经步骤b处理过的玻碳电极上，在4°C通氮气下晾干，得到经滴涂处理的玻碳电极；
[0058]d、将间苯二胺溶于0.05mol/L PH=6.5的磷酸缓冲液中得到浓度为0.05mol/L的间苯二胺溶液，通N215min除去间苯二胺溶液中的氧，然后将步骤c得到的经滴涂处理的玻碳电极泡在所述0.05mol/L的间苯二胺溶液中然后在0.8V电压下作用30s经电化学方法聚合得到表面上覆盖有一层聚间苯二胺薄膜的玻碳电极，即目标电极，将制作好的电极贮存在4°C的磷酸缓冲液中24h以上再使用。
[0059]图1?4为SEM表征图，其中图1是裸玻碳电极的SEM表征图；图2是步骤b得到的修饰NQS后的玻碳电极的SEM表征图；图3是步骤c得到的修饰NQS和酪氨酸酶后的玻碳电极的SEM表征图；图4是步骤d得到的聚合膜修饰后的玻碳电极的SEM表征图；从图3中我们可以清楚地看出NQS、Tyr被一层层修饰在玻碳电极上，图4显示电聚合的间二苯胺形成了网状薄膜，有效地将NQS和Tyr包埋在内，大量减少了其在溶液中的流失，网状结构中的大量空隙又使农药能进入与Tyr作用。
[0060]实施例2:—种有机磷农药快速检测用生物传感器
[0061]一种有机磷农药快速检测用生物传感器，称之为GC-NQS-Tyr-1，3-DAB生物传感器，该传感器以饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，钼片电极为对电极，以实施例1制备的用聚间苯二胺固定有酪氨酸酶(Tyr)和底物(1，2_萘醌_4_磺酸钠)的玻碳电极上作为工作电极，该工作电极用聚间苯二胺这种非导电聚合物将酪氨酸酶(Tyr)和底物(NQS)—起电聚合固定在玻碳电极上。
[0062]实施例3:—种有机磷农药快速检测方法，
[0063]一种有机磷农药快速检测方法，该方法将前述有机磷农药快速检测用生物传感器放入PH=6.5磷酸缓冲液中，利用计时电流法在电化学工作站上用电流-时间方法扫描，研究酪氨酸酶玻碳电极的电化学行为，包括以下步骤:
[0064]首先在未加有机磷农药之前测定空白曲线，是在30mL0.05mol/L的磷酸缓冲液(已通0215min)中进行扫描，在E=+0.1OV下稳定90s (此时，底物1，2-萘醌-4-磺酸钠(NQS)变成 I, 2-萘二酚-4-磺酸钠(H2NQS));在 E=-0.15V 下作用 15s (H2NQS 转化为 NQS)；在 E=+0.1OV 下恢复 60s (NQS 转化为 H2NQS)；
[0065]空白曲线测定好之后，加入5 U L的配置好的有机磷农药溶液，孵育Imin后进行测定，按上述步骤进行，记录不同浓度有机磷农药对酪氨酸酶抑制的曲线。
[0066]所述有机磷农药选自表I所示的序号为I?5、8?9、11?15、17?26有机磷农药，优选为灭菌磷、碘硫磷、二嗪磷、甲基氯吡硫磷等有机磷农药。
[0067]有机磷农药为灭菌磷时，实施例2得到的生物传感器检测灭菌磷的计时电流曲线如图5所示，抑制剂浓度与抑制率的关系如图6所示。
[0068]有机磷农药为碘硫磷时，实施例2得到的生物传感器检测灭菌磷的计时电流曲线如图7所示，抑制剂浓度与抑制率的关系如图8所示。
[0069]有机磷农药为二嗪磷时，实施例2得到的生物传感器检测灭菌磷的计时电流曲线如图9所示，抑制剂浓度与抑制率的关系如图10所示。
[0070]有机磷农药为甲基氯吡硫磷时，实施例2得到的生物传感器检测灭菌磷的计时电流曲线如图11所示，抑制剂浓度与抑制率的关系如图12所示。
[0071]由图5、图7、图9和图11看到加入农药越来越多时，响应电流变小，说明灭菌磷、
碘硫磷、二嗪磷、甲基氯吡硫磷等有机磷农药抑制了酪氨酸酶使其催化H2NQS氧化的量减少，且抑制效果很好。
[0072]由图6、图8、图10和图12可知，该传感器对灭菌磷、碘硫磷、二嗪磷、甲基氯吡硫磷等有机磷农药的检测线性范围分别为7?50 ii M、3?20 ii M、5?50 ii M、8?50 ii M。理论上的检测限可以定义为抑制率为10%时的所对应的抑制剂浓度，因此，该传感器对灭菌磷、碘硫磷、二嗪磷、甲基氯吡硫磷的检测限分别为10 ii M、3.5 ii M、8 u M、9 u M。
[0073]实施例4:有机磷农药对酪氨酸酶抑制活性的测试
[0074]酪氨酸酶抑制率是评价二者之间抑制关系的重要指标。酪氨酸酶催化氧化多巴胺的产物多巴醌在475nm有最大吸收峰，通过紫外-可见分光光度计测试酪氨酸酶催化氧化多巴胺产生多巴醌的量表示酪氨酸酶的催化活力。
[0075]具体操作如下:以0.5mg/mL L-DOPA为底物，在ImL0.05mol/L磷酸缓冲液(pH=6.8)的测活体系中，先加0.1mL含不同浓度的待测抑制剂(溶于DMSO中)于梨形管中，然后加0.1mL酪氨酸酶水溶液，用缓冲溶液补齐到0.6mL，再加0.4mL预先在30°C恒温水浴保温的底物溶液，立刻混匀，在30°C恒温下测定Imin内波长为475nm的吸光度值随时间的增长直线，从直线斜率求得酶活力。酶的终质量浓度为33.3mg/L, DMSO终体积分数为1%。
[0076]有机磷农药对酶的抑制作用是以抑制率对浓度作图，根据抑制曲线求得各物质的IC50 (抑制率为50%时抑制剂的浓度)，结果如表I所示。
[0077]表128种有机磷农药对Tyr抑制作用的IC5tl值
【权利要求】
1.一种固定有酪氨酸酶和1，2-萘醌-4-磺酸钠底物的玻碳电极的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤: a、将玻碳电极用氧化铝抛光粉打磨光亮，清洗干净后晾干； b、将新配置的10u L0.05mol/L的1，2-萘醌-4-磺酸钠溶液滴涂在步骤a得到的裸玻碳电极表面，自然晾干； C、将10 ii L20mg/mL的酪氨酸酶和5 u L2.5mg/mL的戊二醛溶液一起滴涂在经步骤b处理过的玻碳电极上，在4°C通氮气下晾干，得到经滴涂处理的玻碳电极； d、将非导电聚合物单体溶于0.05mol/L PH=6.5的磷酸缓冲液中得到浓度为0.05mol/L的非导电聚合物单体溶液，通N2除氧，然后将步骤c得到的经滴涂处理的玻碳电极泡在0.05mol/L的非导电聚合物单体溶液中经电化学方法聚合得到表面上覆盖有一层非导电聚合物薄膜的玻碳电极，将制作好的目标电极贮存在4°C的磷酸缓冲液中24h以上再使用。
2.根据权利要求1所述的固定有酪氨酸酶和1，2-萘醌-4-磺酸钠底物的玻碳电极的制备方法，其特征在于，所述非导电聚合物单体为间苯二胺，所述非导电聚合物为聚间苯二胺。
3.根据权利要求1或2所述的固定有酪氨酸酶和1，2-萘醌-4-磺酸钠底物的玻碳电极的制备方法，其特征在于，所述电化学方法聚合是在0.8V电压下作用30s。
4.一种有机磷农药快速检测用生物传感器，其特征在于，该传感器以饱和甘汞电极为参比电极，钼片电极为对电极，以权利要求1或2或3得到的固定有酪氨酸酶和1，2-萘醌-4-磺酸钠底物的玻碳电极上作为工作电极。
5.根据权利要求4所述的有机磷农药快速检测用生物传感器，其特征在于，所述有机磷农药选自灭菌磷、碘硫磷、二嗪磷、甲基氯吡硫磷中的任一种。
6.一种有机磷农药快速检测方法，其特征在于该方法将权利要求4或5所述有机磷农药快速检测用生物传感器放入PH=6.5的磷酸缓冲液中，利用计时电流法在电化学工作站上用电流-时间方法扫描，研究酪氨酸酶玻碳电极的电化学行为，包括以下步骤:首先在未加有机磷农药之前测定空白曲线；空白曲线测定好之后，加入配置好的有机磷农药溶液，孵育Imin后进行测定，记录不同浓度有机磷农药对酪氨酸酶抑制的曲线。
7.根据权利要求6所述的有机磷农药快速检测方法，其特征在于所述在未加有机磷农药之前测定空白曲线是在30mL0.05mol/L的磷酸缓冲液中通0215min后进行扫描，在E=+0.1OV 下稳定 90s ;在 E=-0.15V 下作用 15s ;在 E=+0.1OV 下恢复 60s。
8.根据权利要求6或7所述的有机磷农药快速检测方法，其特征在于所述有机磷农药选自灭菌磷、碘硫磷、二嗪磷、甲基氯吡硫磷中的任一种。
【文档编号】G01N27/48GK103675057SQ201310628678
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】潘文龙, 柳亚玲, 陈泳, 杜志云, 李正全, 朱黎明, 韦文蔚, 叶汝汉, 仇镇武, 林晨, 尹冲 申请人:中国广州分析测试中心