一种抗肿瘤淋巴细胞的鉴定方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗肿瘤淋巴细胞的鉴定方法。该鉴定方法是将取自癌症病人的一小块肿瘤组织，在特定的培养基中刺激肿瘤组织中的淋巴细胞，培养5天，然后直接用酶联免疫测定法检测培养基中的γ干扰素水平，从而鉴定肿瘤杀伤性淋巴细胞。本发明直接测定培养基中γ干扰素水平，快速，耗时较短。
【专利说明】一种抗肿瘤淋巴细胞的鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学领域，尤其涉及的是一种抗肿瘤淋巴细胞的鉴定方法。
【背景技术】
[0002]环境污染和遗传因素会导致DNA和基因的突变，癌细胞起源于人体内细胞由于DNA突变和损伤的无控制生长。通常，癌细胞生长形成肿瘤，癌细胞还会转移到别处继续生长，从而破坏正常的组织器官，导致病人的死亡。
[0003]癌症已成为常见病、多发病。据2008年的统计数据，全球有新发癌症病例1266万，死亡800万，估计至2015年新发癌症病例将达到1500万之多。《2012中国肿瘤登记年报》对外发布，报道全国每6分钟就有一人被确诊为癌症，每天有8550人成为癌症患者，每七到八人中就有一人死于癌症。全国癌症发病形势严峻，发病率与死亡率呈持续上升趋势，每年新发癌症病例约350万，因癌症死亡约250万。伴随着对空气中弥漫的PM2.5的不安，这一连串灰色的数字令中国人对癌症的认知绷得更紧了。
[0004]目前癌症是继心血管之后的第二位导致人类死亡的因素，大约一半的男人和三分之一多的女人会产生癌症。我国居民一生罹患癌症的概率为22%，癌症已成为人类第一杀手。目前，还没有很有效的办法来对付癌症，特别是晚期癌症病人的治疗。20世纪以来，以手术治疗、放射治疗和化学治疗三大常规武器为治疗和康复做出巨大的贡献，但这些传统治疗手段均有其局限性，在癌症治疗中未能取得整体满意效果。比如手术治疗，只适合大约20%的较早期的癌患者，有一部分手术治疗可以获得满意的根治效果，遗憾的是这样的情况实在是少数，大部分病例不适合手术治疗。化疗是双刃剑，全身化疗，毒副作用大，少数病种可以获得根治效果，但大部分化疗只是姑息或辅助效果，盲目化疗无益生活质量提高，甚至因为化疗导致并发症而增加身体和经济负担。为了根治癌症，迫切需要找到一种有效的治疗癌症的办法。
[0005]肿瘤的免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型生物技术治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发，增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。肿瘤的免疫治疗是继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术。
[0006]利用特异的杀伤性淋巴细胞进行肿瘤免疫治疗起源于八十年代，利用抗肿瘤的淋巴细胞进行肿瘤免疫治疗是一种特异、有效而先进的癌症治疗手段。近年来，这一技术在皮肤癌晚期病人的治疗上得到成功的应用。临床试验证明，四分之三的皮肤癌晚期病人经过治疗后癌症肿块明显消退，一半的皮肤癌晚期病人完全康复。因此，利用抗肿瘤的淋巴细胞进行肿瘤细胞免疫治疗是一种非常有效的癌症治疗新技术，有着广阔的应用前景。
[0007]利用特异的杀伤性淋巴细胞进行肿瘤免疫治疗的过程包括肿瘤组织样品的取得，从肿瘤样品中分离肿瘤杀伤性淋巴细胞，肿瘤杀伤性淋巴细胞的大量扩增和活化，肿瘤杀伤性淋巴细胞输入癌症病人和临床效果的观察。肿瘤杀伤性淋巴细胞的分离是关键。对从皮肤癌症病人分离肿瘤杀伤性淋巴细胞已进行了大量的研究，并取得了很好的效果，可以从百分之八十以上的皮肤癌症病人分离得到肿瘤杀伤性淋巴细胞。研究显示，也可以从其他癌症病人患者分离得到肿瘤杀伤性淋巴细胞。因此，肿瘤杀伤性淋巴细胞的肿瘤免疫治疗也可以应用于其他癌症病人。
[0008]肿瘤免疫治疗的关键是从癌症病人体内分离、鉴定肿瘤杀伤性淋巴细胞。通常，从癌症病人中切除一小块肿瘤组织，经过7-10天的刺激和培养，得到几百万的肿瘤浸润性淋巴细胞。然后，进行肿瘤浸润性淋巴细胞和肿瘤细胞的共培养。二十四小时后，利用酶联免疫测定法检测淋巴细胞是否释放Y干扰素，从而确定淋巴细胞是否具有肿瘤杀伤性。这种经典的鉴定肿瘤杀伤性淋巴细胞的方法，耗时较长，而且需要肿瘤细胞作为靶细胞。往往从癌症病人肿瘤组织中诱导培养原代肿瘤细胞，非常困难。所以，迫切需要简易快速的方法来鉴定来自癌症病人的肿瘤杀伤性淋巴细胞，以便有效地用于肿瘤的免疫治疗。
【发明内容】
[0009]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种抗肿瘤淋巴细胞的鉴定方法。
[0010]本发明的技术方案如下:
[0011]一种抗肿瘤淋巴细胞的鉴定方法，包括以下步骤:
[0012](I)取0.5厘米大小的癌症病人的肿瘤组织块，在生物安全柜中用手术刀将其切成I毫米见方的肿瘤组织小块；
[0013](2)将肿瘤组织放于24孔培养板，添加RPM1-1640培养基和白细胞介素_2，然后将24孔培养板置于37°C和5% C02培养箱中培养；
[0014](3)培养两天后，再添加RPM1-1640培养基和白细胞介素_2，将24孔培养板置于37°C和5% C02培养箱中继续培养；
[0015](4)第五天，从每孔培养基吸取0.5毫升培养基，置于_20°C冰箱保存；用伽马干扰素酶联免疫试剂盒测定培养基中伽马干扰素的含量；培养基中含有100皮克/毫升以上的伽马干扰素所对应的孔中的淋巴细胞，是具有抗肿瘤活性的淋巴细胞。
[0016]所述的鉴定方法，步骤(2)中，24孔培养板每孔放入一块(I)所述肿瘤组织小块；每孔添加I毫升RPM1-1640培养基和1000IU白细胞介素_2。
[0017]所述的鉴定方法，步骤(3)中，每孔添加I毫升RPM1-1640培养基和200IU白细胞介素_2。
[0018]本发明的特点是直接测定培养基中Y干扰素水平。所以，快速，耗时较短，不需要从癌症病人肿瘤组织诱导培养原代肿瘤细胞作为靶细胞。本发明的原理是当肿瘤组织中的肿瘤浸润性淋巴细胞受到特定培养基刺激时，肿瘤组织中的癌细胞本身也可以刺激淋巴细胞。也就是说，肿瘤组织中的癌细胞本身作为靶细胞，来刺激淋巴细胞释放Y干扰素，以此来鉴定来自癌症病人的抗肿瘤淋巴细胞。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为乳腺癌病人LMC5130的淋巴细胞抗癌活性的测定。
[0020]图2为肺癌病人LMC576的淋巴细胞抗癌活性的测定。
[0021]图3为肾癌病人LMC584的淋巴细胞抗癌活性的测定。[0022]图4为大肠癌病人LMC586的淋巴细胞抗癌活性的测定。
【具体实施方式】
[0023]以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0024]实施例1
[0025]从乳腺癌病人(病人代码为LMC5130)中手术切除0.5厘米大小的肿瘤块及其临近的正常乳腺组织块。在生物安全柜中用手术刀把肿瘤组织切成I毫米见方的肿瘤组织小块，把乳腺正常组织也切成I毫米见方的正常组织小块。把肿瘤组织和乳腺正常组织放于24孔培养板，每一孔放置一小块肿瘤组织或正常组织，每种样品置于4个孔中培养。乳腺正常组织标记为5130Ν-1、5130Ν-2、5130Ν-3和5130N-4 ;乳腺肿瘤组织标记为5130Tu_l、5130Tu-2、5130Tu-3 和 5130Tu_4。每一孔添加 I 毫升 RPM1-1640 培养基和 1000IU 白细胞介素-2。把24孔培养板置于37°C和5% CO2培养箱中培养。培养两天后，每孔添加I毫升RPM1-1640培养基和200IU白细胞介素_2。把24孔培养板置于37°C和5% CO2培养箱中继续培养。第五天，从每孔培养基吸取0.5毫升，置于-20°C冰箱保存。用伽马干扰素酶联免疫试剂盒测定培养基中伽马干扰素的含量。
[0026]测定结果如图1所示，从图1看出，从乳腺癌病人LMC5130肿瘤组织中分离、检测出抗肿瘤的淋巴细胞株-5130TU-1和抗肿瘤的淋巴细胞株-5130TU-3，在这两株淋巴细胞样品的培养基中检测到超过100皮克/毫升的伽马干扰素释放。
[0027]实施例2
[0028]从肺癌病人(病人代码为LMC576)中手术切除0.5厘米大小的肿瘤块及其临近的正常肺组织块。在生物安全柜中用手术刀把肿瘤组织切成I毫米见方的肿瘤组织小块，把肺正常组织也切成I毫米见方的正常组织小块。把肿瘤组织和肺正常组织放于24孔培养板，每一孔放置一小块肿瘤组织或正常组织，每种样品置于4个孔中培养。肺正常组织标记为 576Ν-1、576Ν-2、576Ν-3 和 576N-4 ;肺癌肿瘤组织标记为 576Tu-l、576Tu-2、576Tu_3 和576TU-4。每一孔添加I毫升RPM1-1640培养基和1000IU白细胞介素_2。把24孔培养板置于37°C和5% CO2培养箱中培养。培养两天后，每孔添加I毫升RPM1-1640培养基和200IU白细胞介素-2。把24孔培养板置于37°C和5% CO2培养箱中继续培养。第五天，从每孔培养基吸取0.5毫升，置于-20°C冰箱保存。用伽马干扰素酶联免疫试剂盒测定培养基中伽马干扰素的含量。
[0029]测定结果如图2所述，从图2可以看出，从肺癌病人LMC576肿瘤组织中分离、检测出抗肿瘤的淋巴细胞株-576Τ-1、576Τ-2、576Τ-3和576Τ-4。从肺正常组织中，也检测出抗肿瘤的淋巴细胞株-576Ν-1和576Ν-2。在这些淋巴细胞样品的培养基中检测到超过100皮克/毫升的伽马干扰素释放。
[0030]实施例3
[0031]从肾癌病人(病人代码为LMC584)中手术切除0.5厘米大小的肿瘤块及其临近的正常肾组织块。在生物安全柜中用手术刀把肿瘤组织切成I毫米见方的肿瘤组织小块，把肾正常组织也切成I毫米见方的正常组织小块。把肿瘤组织和肾正常组织放于24孔培养板，每一孔放置一小块肿瘤组织或正常组织，每种样品置于4个孔中培养。肾正常组织标记为 584Ν-1、584Ν-2、584Ν-3 和 584Ν-4 ;肾癌肿瘤组织标记为 584Tu-l、584Tu-2、584Tu_3 和584TU-4。每一孔添加I毫升RPM1-1640培养基和IOOOIU白细胞介素_2。把24孔培养板置于37°C和5% CO2培养箱中培养。培养两天后，每孔添加I毫升RPM1-1640培养基和200IU白细胞介素-2。把24孔培养板置于37°C和5% CO2培养箱中继续培养。第五天，从每孔培养基吸取0.5毫升，置于-20°C冰箱保存。用伽马干扰素酶联免疫试剂盒测定培养基中伽马干扰素的含量。
[0032]测定结果见图3，从图3可以看出，从肾癌病人LMC584肿瘤组织中分离、检测出抗肿瘤的淋巴细胞株-584TU-2和584TU-3，在这两株淋巴细胞样品的培养基中检测到超过100皮克/毫升的伽马干扰素释放。
[0033]实施例4
[0034]从大肠癌病人(病人代码为LMC586)中手术切除0.5厘米大小的肿瘤块及其临近的正常大肠组织块。在生物安全柜中用手术刀把肿瘤组织切成I毫米见方的肿瘤组织小块，把大肠正常组织也切成I毫米见方的正常组织小块。把肿瘤组织和大肠正常组织放于24孔培养板，每一孔放置一小块肿瘤组织或正常组织，每种样品置于4个孔中培养。大肠正常组织标记为586Ν-1、586Ν-2、586Ν-3和586N-4 ;大肠癌肿瘤组织标记为586Tu_l、586Tu-2、586Tu-3和586Tu_4。每一孔添加I毫升RPM1-1640培养基和1000IU白细胞介素-2。把24孔培养板置于37°C和5% CO2培养箱中培养。培养两天后，每孔添加I毫升RPM1-1640培养基和200IU白细胞介素_2。把24孔培养板置于37°C和5% CO2培养箱中继续培养。第五天，从每孔培养基吸取0.5毫升，置于-20°C冰箱保存。用伽马干扰素酶联免疫试剂盒测定培养基中伽马干扰素的含量。
[0035]测定结果如图4所示，从图4可以看出，大肠癌病人LMC586肿瘤组织中分离、检测出抗肿瘤的淋巴细胞株-586TU-3，在这个淋巴细胞样品的培养基中检测到超过100皮克/毫升的伽马干扰素释放。
[0036]应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
【权利要求】
1.一种抗肿瘤淋巴细胞的鉴定方法，其特征是，包括以下步骤: (1)取0.5厘米大小的癌症病人的肿瘤组织块，在生物安全柜中用手术刀将其切成I毫米见方的肿瘤组织小块； (2)将肿瘤组织放于24孔培养板，添加RPM1-1640培养基和白细胞介素_2，然后将24孔培养板置于37°C和5% CO2培养箱中培养； (3)培养两天后，再添加RPM1-1640培养基和白细胞介素_2，将24孔培养板置于37°C和5% CO2培养箱中继续培养； (4)第五天，从每孔培养基吸取0.5毫升培养基，置于-20°C冰箱保存；用伽马干扰素酶联免疫试剂盒测定培养基中伽马干扰素的含量；培养基中含有100皮克/毫升以上的伽马干扰素所对应的孔中的淋巴细胞，是具有抗肿瘤活性的淋巴细胞。
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征是，步骤(2)中，24孔培养板每孔放入一块(I)所述肿瘤组织小块；每孔添加I毫升RPM1-1640培养基和1000IU白细胞介素_2。
3.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征是，步骤(3)中，每孔添加I毫升RPM1-1640培养基和200IU白细胞介素-2。
【文档编号】G01N33/68GK103823068SQ201310690699
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2013年12月16日 优先权日:2013年12月16日
【发明者】周菊华 申请人:周菊华